（化学工艺专业论文）葛根总黄酮的提取与分离纯化工艺研究.pdf

at h e s i ss u b m i t t e di nf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t s f o r t h ed e g r e eo fm a s t e ro f e n g i n e e r i n g e x t r a c t i o na n d s e p a r a t i o no ff l a v o n o i d s f r o m p u e r a r i al o b a t a m a j o r ：c h e m i c a lt e c h n o l o g y c a n d i d a t e ：g a nl i n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rc h ir u a n w u h a ni n s t i t u t eo f t e c h n o l o g y w u h a n ，h u b e i4 3 0 0 7 3 ，p rc h i n a m a y , 2 0 1 0 摘要 摘要 天然产物的有效成分一直是制药的重要原料，而黄酮类化合物是天 然药物领域研究的重点与热点。作为葛根的主要有效成分，葛根总黄酮 具有改善心脑血管循环、降低心肌耗氧量等多种药理作用，其高纯度产 品在国际市场上更是倍受青睐。由此，为满足高端市场的需求，并针对 葛根总黄酮原料药粗品生产中存在的生产效率低、产量低等问题，本文 研究了葛根总黄酮的提取与分离纯化工艺。 分别采用乙醇回流和超声波辅助法提取葛根总黄酮，以单因素和正 交实验为基础，优化各工艺条件。在两种提取方法的优化工艺条件下， 乙醇回流法得到的提取率为8 1 5 0 ，超声波辅助法得到的提取率为 9 1 2 6 ，较前者提高了1 1 9 8 。与乙醇回流法相比，超声波辅助法具有 省时、高效的优点，且不会给后续的分离工作带来影响。 本课题考察了萃取法和树脂吸附分离法对总黄酮的纯化效果，并以 产物中总黄酮的含量和收率为评价指标，确定较优的纯化工艺。结果显 示，萃取法的优化工艺为：以总黄酮的水溶液为原溶液，p h 值调至2 3 ， 正丁醇等体积萃取，得到总黄酮的含量和收率分别为7 1 4 9 ，9 0 5 2 。 s 8 树脂吸附纯化的优化工艺为：吸附剂用量为总黄酮质量的1 0 倍，以 7 0 乙醇为洗脱剂，流速为1 5b v h ，所得产物的总黄酮含量及收率分别 为8 2 4 5 ，9 3 0 2 。最后对这两种纯化方法进行了比较，结果表明，采 用树脂吸附纯化葛根总黄酮的效果更为显著，较正丁醇萃取法更有工业 应用价值。 关键词：葛根；总黄酮；提取；分离 武汉工程大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ea c t i v ei n g r e d i e n ti nn a t u r a l p r o d u c ti st h ei m p o r t a n tr a 【wm a t e r i a l 南r p h a r m a c e u t i c a l s f l a v o n o i d sc o u l di m p r o v ec a r d i o v a s c u l a r c i r c u l a t i o n i e d u c e m y o c a r d i a lo x y g e nc o n s u m p t i o na n dp r e v e n th i g hb l o o dp r e s s u r ea n ds oo n i t sh i g h - p u r i t yp r o d u c t sa r ea c c l a i m e di nt h ei n t e m a t i o n a l m 破e t t om e e t 廿1 e h i g h e n dm a r k e td e m a n d ，a n da i ma tt h el o w p r o d u c t i v i t yi nt h ep r o c e s so f p r o d u c i n gr a wm a t e r i a lm e d i c i n ef o rp u e r a r i al o b a t ac n l d en a v o n o i d s w e s t u d i e dt h ep r o c e s so fe x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o no ft o t a l n a v o n o i d s 蜀r o m p u e r a r i ai nt h i sa r t i c l e b o t ht h em e t h o d s o fe t h a n o lr e f l u xa n d u l t r a s o u n d - a s s i s t e da i i e c o n s i d e r e dt oe x t r a c tt o t a lf i a v o n o i d sf r o mp u e r a r i a as i n g l e f a c t o ra l l d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa r ec o n s i d e r e dt oo p t i m i z et h ep r o c e s sc o n d i t i o n s ，a n d t oc o m p a r et h ee x t r a c t i o nr a t e so ft h et w oe x t r a c t i o nm e t h o d s t h er e s u l t s s h o wt h a te x t r a c t i o nr a t eo fe t h a n o lr e f l u xi s 8 1 5 0 ，a i l de x t r a l c t i o nr 乏l t ei s 9 1 2 6 b yu l t r a s o u n d - a s s i s t e de x t r a c t i o n ，r a i s i n g11 9 8 o v e rt h ef o 啪e r m e t h o d w ea l s oe x a m i n e dt h e p u r i f i c a t i o ne f f e c to ff l a v o n o i d sb yr e s i na n d e x t r a c t i o n w i t hp u e r a r i ac o n t e n ta n d y i e l da st h ee v a l u a t i n gi n d i c a t o r 1 e s e t w o p u r i f i c a t i o nm e t h o d sw e r ec o m p a r e d t h eo p t i m u m p r o c e s so fe x 仃a c t i o n m e t h o da sf o l l o w i n g ：a ne q u a lv o l u m eo fn b u t a n o la s e x t r a c t a n t ，p hv a l u e w a ga d j u s t e dt o 2 - 3 ，g e tt h et o t a lf l a v o n o i d sc o n t e n ta n dy i e l d so fp r o d u c t 、r e7 1 4 9 ，9 0 5 2 t h eo p t i m i z a t i o np r o c e s so fs - 8r e s i n a d s o r p t i o n p u r i f i c a t i o na sf o l l o w s ：a d s o r b e n td o s a g ew a st e nt i m e so ff l a v o n o i d s 7 0 e t h a n o la se l u a n t ，f l o wr a t ew a s1 5 b v h ，a n dt h et o t a lf l a v o n o i dc o n t e n t a n dy i e l d so ft h ep r o d u c tw e r e8 2 4 5 ，9 3 0 2 t h er e s u l t ss h o w t 1 1 a tu s m g i i i r e s i na d s o r p t i o np u r i f i c a t i o no ft o t a lf l a v o n o i d si st h ee f f e c t i v em e t h o d ，i ti s m o r es u i t a b l ef o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o n k e y w o r d s ：p u e r a r i al o b a t a ；f l a v o n o i d s ；e x t r a c t i o n ；s e p a r a t i o n i v 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 目蜀匙v j j i 言】【 第1 章文献综述3 1 1 葛根的分布及化学成分3 1 2 葛根的应用进展一5 1 3 黄酮类化合物的性质及作用6 1 3 1 黄酮类化合物的性质6 1 3 2 黄酮类化合物的作用7 1 4 葛根总黄酮的提取工艺研究现状8 1 5 葛根总黄酮的分离纯化工艺研究现状11 1 6 课题的研究意义与研究内容1 4 1 6 1 本课题的研究意义1 4 1 6 2 本课题的主要研究内容1 5 第2 章实验材料与方法17 2 1 实验试剂与仪器l7 2 1 1 实验试剂17 2 1 2 实验仪器。l8 2 2 分析方法18 2 2 1 标准曲线的制作1 8 2 2 2 葛根提取液中总黄酮含量的测定1 9 2 2 3 葛根中总黄酮含量的测定2 0 2 2 4 色谱条件21 2 3 乙醇回流提取工艺2 1 2 3 1 实验原理2 1 v 武汉工程大学硕士学位论文 2 3 2 操作方法2 2 2 4 超声波辅助提取工艺2 3 2 4 1 实验原理2 3 2 4 2 操作方法。2 4 2 5 萃取法分离总黄酮。2 4 2 5 1 实验原理2 4 2 5 2 萃取剂的选择2 5 2 5 3 影响萃取效果的因素2 6 2 5 4 葛根粗粉的制备及其总黄酮含量的测定2 7 2 5 5 操作方法2 7 2 6 大孔树脂吸附法分离总黄酮2 7 2 6 1 实验原理一：2 8 2 6 2 吸附剂的选择2 9 2 6 3 影响吸附分离效果的因素2 9 2 6 4 树脂的预处理3 0 2 6 5 树脂静态吸附率的测定3 0 2 6 6 树脂静态解吸率的测定3 0 2 6 7 洗脱剂浓度的考察3 1 第3 章结果与讨论。3 3 3 1 乙醇回流提取工艺。3 3 3 1 1 乙醇回流提取的单因素实验3 3 3 1 2 乙醇回流提取的正交实验。3 8 3 1 3 验证实验4 0 3 2 超声波辅助提取工艺4 1 3 2 1 超声波辅助提取的单因素实验4 1 3 2 2 超声波辅助提取的正交实验4 4 3 2 3 验证实验。4 6 3 3 总黄酮提取方法的比较4 7 3 3 1 提取工艺的比较4 7 v i 目录 2 产品纯度的比较4 8 取法分离总黄酮。5 2 1 不同溶剂的萃取效果。5 2 2 不同p h 值对萃取效果的影响5 2 3 不同无机盐对萃取效果的影响5 3 4 各因素协同作用下的萃取效果5 4 孔树脂吸附法分离总黄酮。5 4 3 5 1 树脂的筛选5 4 3 5 2 洗脱剂浓度的考察5 6 3 5 3 正交实验5 6 3 6 总黄酮纯化方法的比较5 8 3 7 本章小结一5 9 第4 章结论6 1 参考文献6 3 硕士学位期间发表的学术论文6 7 致谢6 9 v 武汉工程大学硕士学位论文 v i i i 引言 引言 ，因其丰富的药用成分和广泛的生理活性，而素有“千年人参” 在众多医术专著，如中国古代的本草纲目和神农本草经 根成功治疗众多疾病的记载。临床研究表明，葛根总黄酮具有 ，降低心肌耗氧量等多种生理活性，由此而被广泛应用到化工 域。 科技部、中医药局等八部委联合颁布的中药现代化发展纲要 加强中药提取、分离、纯化等关键生产技术的研究和先进技术 用，促进中药提取物生产向规模化、标准化、商品化发展，提 高企业的核心竞争力，加速现代中药产业化进程。因此，研究葛根总黄 酮的提取分离工艺是十分迫切和需要的。但是，目前葛根总黄酮的提取 与分离技术仍然有不完善的地方，比如生产成本高，生产工艺的周期长 等。基于我国丰富的葛根资源和国内外市场对葛根产品的大量需求，以 及其生产工艺存在的一些问题，本文将着重探讨葛根总黄酮的提取与分 离纯化工艺，以确定提取与分离纯化的优化工艺参数，期望为葛根资源 的充分利用提供良好的依据。这对实现中药现代化，使中医药产品走向 世界也具有十分重要的意义。 武汉工程大学硕士学位论文 2 含有 少量的果胶、脂肪和三萜类物质，其中含黄酮和淀粉较多。除此外，葛 根中还含有少量人体所必需的的氨基酸。比如，含赖氨酸的量大于1 0 m g g 、缬氨酸大于1 1 2 4m g g 、组氨酸大于6 7 4m g g 。另外，葛根中还 含有十多种人体所必需的矿物质和微量元素。铁、磷、钙、锌、铜、锗 等，尤其是锌、锰等微量元素的含量要高于其它同类植物。这些微量元 素对促进儿童骨骼发育和智力增长有十分显著的作用。可见，葛根的药 用成分极为丰富，其药用价值也十分广泛。 黄酮类化合物是葛根中含量最高的有效成分，约占葛根质量的 5 1 0 ，它具有降低血脂和心肌耗氧量的作用【4 】。现今，从葛根中分离出 来的黄酮类化合物大约有二十种，其中主要包括葛根素、大豆甙元、大 豆甙、4 ，7 一二葡萄糖大豆甙、7 木糖一葛根素、3 ，- 甲氧基葛根素等【5 】o 黄酮 类化合物的基本结构见图1 - 1 、图1 2 、表1 - 1 。 武汉工程大学硕士学位论文 o 图1 1 黄酮类化合物的基本母核 印宁一 第1 章文献综述 1 2 葛根的应用进展 中华人民共和国药典和卫生部药品标准中收录大约有1 4 0 余种葛根复方制剂，其中主要有葛根片剂、针剂等。粉葛与野葛都有广 泛应用，粉葛中富含淀粉，而多为食用。目前，很多国内研究者致力于 葛根淀粉产品的加工方法。石小琼研究了即食葛粉和葛粉软糖的制作f 6 1 ； 陆宁等研究了葛粉一茯苓即食保健糊的加工工艺川；丁利君等制作了解酒 饮料【8 】；时忠烈等用热浆法生产出优质速食的天然葛粉1 9 1 ；蒋世琼等研究 了酶生产低聚糖葛粉的工艺【l o ，1 1 1 ，这些产品兼具质地细腻和香味浓郁的 优点。葛根中还含有一些高营养成分，包括大量维生素和人体所必需的 钙、锌等微量元素，由此葛根保健品畅销国内外，而且老少皆宜【1 2 1 。世 界粮农组织等权威机构的专家们还预测葛根将会成为世界第六大粮食作 物【1 3 】。 在美国，葛根总黄酮己经被应用到生物制药中。在我国也被用于注 射液、降血压等用途的药物中【1 4 1 。据报道，有些葛根制剂已经应用到临 床上，其中主要有：葛根片、愈风宁心片、葛根黄豆苷元的固体分散物 胶囊、葛根素注射液等。此外，葛根因为其特有的功效，如抗氧化能力 和增强机体免疫力，以及能够抑制人体皮肤黑色素的发生与形成，其提 取物已作为功能性成分被添加到各种美白祛斑的化妆品中【1 5 】。国际化妆 品界还称葛根是又一种源于绿色植物的皮肤脱色组分【1 6 1 。 可见，提取葛根中的有效成分，不仅对开发利用野生植物资源有重 大意义，而且还有很好的经济效益。因而，针对一些葛根黄酮的加工企 业存在的问题，比如对有效成分的提取率较低、能量消耗较大、产品纯 度不高而达不到市场的需求等等，尽快更新生产技术、研究高效、低能 耗的提取分离工艺是十分必要的。 武汉工程大学硕士学位论文 1 3 黄酮类化合物的性质及作用 1 3 1 黄酮类化合物的性质 黄酮类是一大类化合物，在植物界内普遍存在，大多存在于高等植 物以及羊齿类植物中。这类化合物大多呈现黄色或淡黄色，所以被称为 黄酮【1 7 1 。黄酮类化合物含有氧杂环，在植物体内大部分与糖成甙，另外 一部分以甙元的形式存在1 8 1 。目前，统计的黄酮类化合物有5 0 0 0 余种【1 9 1 。 在提取与分离黄酮时，其物理化学性质发挥着其它谱学技术所取代 不了的巨大作用。所以，在研究黄酮类化合物的提取与分离工艺前，充 分的了解其物化性质是十分必要的。就黄酮类化合物的性质简单介绍如 下 2 0 1 ： ( 1 ) 性状 大多黄酮类化合物呈结晶性固体，少部分呈无定形粉末，如黄酮苷 类。其颜色会因分子中是否有交叉共轭体系而存在差异，它还与助色团 的种类、取代的位置以及数目有关系。 ( 2 ) 酸碱性 大多黄酮类化合物由于分子中含有酚羟基而显酸性，酚羟基的位置 和数目不同，其酸性的强弱也不同。以黄酮为例，其酚羟基酸性强弱顺 序依次为：7 ，4 ，- 二o h 7 或4 - o h 5 o h 。该性质可作为提取、分离 与鉴定工作的良好依据。 ( 3 ) 溶解性 苷或苷元、单糖苷、双糖苷等在黄酮类化合物中存在的状态不同， 其溶解度也不同。一般来说，平面性较强的分子，如黄酮、黄酮醇等由 于分子之间的排列比较紧密，分子间的引力也很大，因而难溶于水。二 氢黄酮和二氢黄酮醇类，因为是非平面性分子，分子间引力较小，溶解 度会比黄酮醇类大。而游离的苷元在水中的溶解度则非常小，几乎不溶， 第1 章文献综述 但是较易溶于乙醇和甲醇等有机溶剂中，也易溶于稀碱水溶液中。 经研究发现，通过改变分子的结构能够增加其在水中的溶解度，比 如在黄酮苷元分子中引入羟基。而羟基被甲基化后，其在有机溶剂中的 溶解度也会增加。例如，一般的黄酮类化合物不溶于石油醚，而川陈皮 素在石油醚中有较好的溶解度。苷元在水中的溶解度还与糖的结合位置 有关，一般来说，糖链越长，其在水中的溶解度也越大。比如，一般的 黄酮苷较易溶于水以及极性较强的溶剂中，但是在苯，氯仿等有机溶剂 中的溶解度几乎为零。 1 3 2 黄酮类化合物的作用【2 1 1 黄酮类化合物在植物界广泛存在，其生理活性也多种多样，由于它 们具有抗缺氧与抗氧化等药理功能，而被广泛应用，还引起了众多国内 外学者的研究和关注，现将它的主要作用简单介绍如下： ， ( 1 ) 抗肝脏病毒 经过动物实验和临床研究证明，从水飞蓟中提取得到的水飞蓟素对 肝脏有很好的保护作用。l 临床上，黄酮类化合物被用于治疗急慢性肝炎， 而且效果显著。这说明，黄酮类化合物可有效地抗肝脏病毒。 ( 2 ) 对心血管系统的作用 芦丁和葛根素等被用于治疗冠心病或者用于活血化淤的药物中，并 且这些药物都成功的用于临床。有些黄酮类化合物还有降低血脂和胆固 醇的作用。 ( 3 ) 抗炎 据报道，有些黄酮类化合物对甲醛引起的关节炎有较好的抑制作用， 比如芦丁及其衍生物。金养麦中的双聚原矢车菊苷元有抗炎、解热、提 高机体免疫力的作用。 ( 4 ) 抗菌及抗病毒 i 曩 武汉工程大学硕士学位论文 近年来，有关于黄酮类化合物能抗菌的报道，比如黄芩苷和黄芩素 有一定的抗菌及抗病毒作用。 黄酮类化合物因为这些显著的生理活性，而被广泛的应用到医药、 食品和化妆品等工业中。现在，世界上也掀起了一股开发天然产品的热 潮，天然食品或者护肤品都备受青睐，高纯度的天然产品更是价格昂贵。 1 4 葛根总黄酮的提取工艺研究现状 目前，葛根总黄酮的提取方法有很多。传统的有水煮法、冷浸法、 回流法等。随着科学技术的不断进步和发展，新材料、新技术都不断的 被应用到中药的提取研究工作中。逐渐发展出超临界流体萃取法、超声 波辅助提取法、微波辅助提取法、酶水解法等方法，这些新技术现在还 处于开发研究阶段，也有少部分技术被应用于工业生产上。为了比较众 多提取方法的优缺点，现将葛根总黄酮现有的几种提取方法简单介绍如 下： ( 1 ) 仿生提取法 仿生提取法的基本原理源于仿生学，即以人工胃肠为基础，模拟口 服药经过胃肠道的运转原理而设计。该方法的目的是尽可能的保留原材 料中的有效成分，比较符合中医药的多种有效成分复合作用的特点。 杨欣欣【2 2 】等以葛根素和干膏收率的综合评分为考察指标，设计正交 实验，考察了搅拌次数、搅拌转数、搅拌时间等因素对提取效果的影响。 实验结果表明，影响提取效果的各因素的主次依次是搅拌次数、搅拌转 数、搅拌时间、固液比。该提取法的优化工艺为固液比采用1 ：6 ，转数为 1 5 0r m i n ，搅拌两次，每次1 5m i n ，在此工艺条件下，所得产品的葛根 素纯度为2 8 以上，干膏收率为2 5 。该方法的优点是反应条件温和、 能耗小、对环境造成的污染也比较小。 ( 2 ) 溶剂回流提取法 第1 章文献综述 方法的基本原理是根据目标成分在各溶剂中的溶解度不同而达到 标成分的目的，对该方法来说，溶剂的选取是十分重要的，一般 目标成分溶解度大，而对其它成分溶解度小的溶剂作为提取溶剂。 洪雄【2 3 l 等采用单因素和正交实验对葛根黄酮的提取工艺进行了优 黄酮提取率为考察指标，考察了不同溶剂、溶剂浓度、提取时间、 以及提取次数对提取效果的影响。实验结果显示，乙醇的提取效 和丙酮好。正交实验结果说明，提取葛根黄酮的优化工艺为以5 材料的9 0 乙醇为溶剂，回流提取3 次，每次2h 。此时，黄酮的 达7 4 3 。潘见 2 4 1 等也探讨了葛根黄酮的优化提取工艺，单因素 实验考察因素为固液比、溶剂浓度、温度、提取时间和p h 值等。实验结 果显示，优化提取工艺为p h 值为8 ，固液比为1 ：1 0 ，以7 0 乙醇为溶剂， 在8 5 。c 温度下提取2 次，每次3h 。在此工艺条件下，所得提取率在9 以上，提取物的黄酮含量在4 0 以上。可见这种提取方法具有操作简单 的优点，但是所得提取率较低，且生产周期长，不适于工业化大生产。 ( 3 ) 煎煮法 赵浩如【2 5 】等用3 5m l 水为溶剂浸泡4 5g 药材，浸泡3 0m i n ，煎煮 2 5m i n ，离心过滤，再加水1 4m l 煎煮2 5m i n 。过滤，合并滤液，滤液 用正丁醇萃取，减压回收正丁醇后将浸膏真空干燥即得产品。实验结果 表明产品得率低，而且煎煮过程还会破坏葛根中有效成分，可见该方法 不如上述两种提取方法好。 ( 4 ) 酶提取法 酶提取法就利用酶来破坏中药材的细胞壁，从而加快有效成分的溶 出。目前用来提取中药有效成分的酶是纤维素酶，因为其细胞壁是纤维 结构。纤维素酶在国外已经广泛用于食品、化工等领域。 杨云【2 6 】等采用正交实验进行研究，分析了纤维素酶对葛根提取工艺 的影响。实验结果显示，在提取葛根有效成分前，用纤维素酶酶解，葛 根素的含量能够提高1 7 5 9 ，而影响酶解效果的主要因素是酶解时间、 武汉工程大学硕士学位论文 温度、p h 值和用酶量。 ( 5 ) 微波辅助提取法 微波辅助提取就是利用微波对细胞的辐射作用和对药材的加热作 用，而加快有效成分的溶出。 马海乐1 2 7 等以葛根渣为原料，采用微波萃取技术提取葛根黄酮，实 验考察了固液比、乙醇体积分数、微波功率和作用时间对提取效果的影 响。实验结果显示，微波辅助提取的优化工艺为采用7 5 的乙醇为提取 溶剂，固液比是i ：2 0 ，微波作用时间为lm i n ，微波作用强度为中高档。 与不施加微波辅助处理相比，葛根总黄酮的提取率提高了5 0 以上。微 波技术在近几年得到了十分广泛的应用，它具有穿透能力强、选择性高、 省时等特点。 ( 6 ) 超声波辅助提取法 该方法是通过超声空化、物质中的微气核振动、生长和崩溃等过程 来完成。此外，超声波的搅拌、粉碎等特殊作用，能够破坏植物药材的 细胞壁，从而使溶剂更快地渗透到药材细胞中，这样就加快了原材料中 有效成分的溶出。 张尊听【2 8 1 等采用超声法提取葛根中异黄酮，并用定性和定量分析方 法测定葛根提取物中异黄酮成分及其质量分数。实验结果显示，较好的 超声提取工艺为以甲醇为溶剂，超声3 0m i n ，此时总黄酮提取率为2 0 6 ， 产物中总黄酮的质量分数为5 0 0 3 。采用超声提取法具有设备简单、省 时、节约能源、提取率和产品纯度较高等优点。 ( 7 ) 超临界流体萃取技术 现今，我国已将超临界萃取技术作为一项新技术来研究中药现代化 的高效提取分离。超临界萃取技术是以某一介质为萃取剂，在临界温度 和压力之上的条件下，从液体或者固体原料中萃取出有效成分的一种方 法。根据有关报道，可作为超临界萃取剂的流体体系有很多种，其中非 极性的二氧化碳是使用最广泛的萃取剂。 第1 章文献综述 王龙虎1 2 9 1 等采用正交实验考察原料、温度、压力、二氧化碳流量以 及萃取时间和共溶剂的用量等工艺条件对葛根素提取率的影响。实验结 果表示，当原料的粒度为o 2 0r n l n ，加入1 ：l ( w w ) 共溶剂乙醇，在5 0 和2 5m p a 下，以1 5l h 流量的二氧化碳萃取3h ，葛根素的提取率达到 1 8 5 。超临界萃取法与有机溶剂萃取法相比，具有以下优点：产品中没 有溶剂残留、提取效率高、热不稳定性成分和活性成分不容易被分解破 坏等等。另外，通过改变压力和温度以及调节改性剂的种类和用量，还 能够实现选择性萃取和分离纯化。但是超临界二氧化碳萃取也有其自身 的一些不足，尤其是在萃取天然产物的有效成分时，天然产物的成分比 较复杂，各成分之间的性质比较相近，因此想利用超临界萃取技术从原 料中一步萃取到较纯的物质是很难实现的，往往需要预处理和经过多步 分离。而当原料杂质较多，粘性较大易结块时，还会堵塞管道，引起设 备的损伤和破坏【3 0 3 1 1 。 1 5 葛根总黄酮的分离纯化工艺研究现状 葛根总黄酮的分离纯化工艺主要有：铅盐沉淀法、硅胶柱层析法、 聚酰胺柱层析法、大孔树脂吸附柱层析法、正丁醇萃取、酸水解法等。 各方法的研究现状现简单介绍如下。 ( 1 ) 铅盐沉淀法 该方法的基本原理是依据提取液中的诸多微量杂质能与醋酸铅生成 沉淀，而总黄酮会与碱式醋酸铅生成沉淀，因而铅盐沉淀法可以达到除 杂的目的。 李稳宏【3 2 1 等将醇提物用1 5 0m l9 5 乙醇溶解，加入饱和中性醋酸铅 至不再有沉淀生成，过滤，水洗沉淀，合并滤液，加入碱式醋酸铅至不 再有沉淀生成，再将沉淀干燥后加入3 0 0m l9 5 乙醇中，通入硫化氢气 体脱铅，过滤，醇洗沉淀，将滤液与洗液合并并调节p h 值至6 5 7 0 ，减 矗 譬： 武汉工程大学硕士学位论文 压回收乙醇，再真空干燥，即得浅棕色产品。实验结果说明，所得产品 的总黄酮含量达6 2 8 1 ，但是产品质量低。这是因为在铅盐沉淀的过程 中会带走一部分有效成分，使其损失很大，而且沉淀过程冗长，所以该 纯化方法不适于生产高纯度的葛根黄酮，也不适于工业生产。 ( 2 ) 聚酰胺柱层析分离法 聚酰胺柱层析是利用聚酰胺能和目标成分之间形成氢键，这种氢键 的强弱就反应了被分离成分与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。 赵爱萍p 3 】等以水提取葛根后，用乙醇沉淀，然后经过聚酰胺柱层析， 再以水洗脱，浓缩，放置就会析出葛根素的粗品，粗品再层析，水洗， 浓缩至析出晶体，再干燥即得葛根素含量为9 0 的精品。谭斌【3 4 】等以葛 根异黄酮含量为4 4 2 的葛根粗提物为原料，以1 3 4 0 目的聚酰胺柱层析。 实验结果显示，聚酰胺对异黄酮的吸附量为4 5 6m g g ，吸附率为2 4 2 7 ， 解吸量和解吸率依次为1 8 3m g g ，4 0 1 7 。这说明聚酰胺对葛根异黄酮 有一定的吸附能力。但是不能将异黄酮充分吸附与解吸下来，会损失部 分有效成分。 ( 3 ) 大孔树脂柱层析法 大孔树脂是一种多孔性的高分子材料，具有较大的比表面积，主要 是通过物理作用从溶液中有选择性的吸附有机物质，从而达到分离纯化 的目的。 杨荣平【3 5 1 等采用静态吸附和动态解吸的方法从a b 一8 、x 5 、i - i p 2 0 、 s p 8 5 0 、s p 2 0 7 、s p 7 0 、d 1 4 1 、d 1 4 0 树脂中筛选出s p 7 0 的分离效果较好， 该优化工艺为药液浓度采用0 5g m l ，p h 值5 - 6 ，吸附速率为2b v h 时 吸附效果最好。洗脱工艺是以7 0 乙醇为洗脱剂，洗脱速率2b v h 。经 过s p 7 0 树脂柱层析后，产品中葛根总黄酮的含量达到8 0 以上。可见， 树脂吸附纯化可以得到较高纯度的产品。 ( 4 ) 络合萃取法 该方法是利用葛根素和三价铁离子能够生成水溶性络合物的性质， 第1 章文献综述 将其转化为水溶性化合物，这样可以将葛根素与其它不溶于水的杂质分 离开来，然后在f e 3 + _ 葛根素的溶液中加入盐酸解聚，就能析出葛根素。 贺云 3 6 1 等利用f e 3 + 能和葛根素生成可溶性络合物的性质建立了一种从野 葛中萃取葛根素的新型分离方法。以甲醇冷浸从野葛中提取葛根总黄酮， 将其进行水解，中和，再在其中加入氯化铁使其与葛根素络合溶解，过 滤，用盐酸解聚f e 3 + - 葛根素络合物，即得葛根素粗品。实验结果显示， 该方法得到的葛根素收率为1 2 ，纯度为9 6 5 。该方法具有操作比较 简单，容易实现产业化的优点，但是该方法还在研究的初步阶段。 ( 5 ) 正丁醇萃取法【3 7 1 以9 5 的乙醇为溶剂提取葛根总黄酮，减压浓缩提取液，再加入正 丁醇反复萃取，摇匀，静置。正丁醇相经过三氧化二铝柱脱色，然后减 压回收正丁醇，所得粗产品用冰醋酸反复重结晶，即得葛根素精品。该 方法具有操作简单、成本低等优点。 ( 6 ) 酸水解法 该方法是利用葛根素衍生物被水解能生成葛根素的性质，酸水解提 取物，将酸水解液用氯仿萃取分离，即能得到葛根素。酸水解法操作简 单，但其缺点是酸水解过程破坏了药材中的某些成分，而且葛根素的收 率也不高。潘娓婕【3 8 1 等将葛根总黄酮提取物用5 盐酸水解4h ，酸水解 液用乙酸乙酯萃取后放置，待析出葛根素。实验结果显示，葛根素产率 为1 3 6 ，纯度为9 8 3 2 。 ( 7 ) 膜分离法 膜分离法是利用有效成分与其它成分之间分子量的差异，达到去粗 取精的目的。王丽杰【3 9 1 等采用膜分离法提取葛根淀粉、黄酮类药物，但 其所用的膜为金属纳米膜，成本过高，限制了膜技术在精制浓缩葛根素 工艺中的应用。该方法兼具有分离纯化、浓缩和精制的功能，又有高效、 节能、环保、易于自动化控制的特点。因此，膜分离法在中药制剂、有 效成分保留、杂质的去除等方面较传统方法有其明显的优势。 ，。 武汉工程大学硕士学位论文 ( 8 ) 环糊精键合固定相技术 环糊精具有疏水空腔以及多羟基结构，黄酮类化合物能够与环糊精 配基同时发生疏水作用和氢键作用，从而为色谱分离过程提供保留作用 力。凝胶键合固定相可在常压或者低压下进行，解决了生产放大后压力 过高的问题。贺湘凌等【4 0 】将环糊精及其低聚物键合在多糖类凝胶介质上 制备新型层析分离介质，在分离纯化葛根总黄酮时，葛根素的纯度高于 9 0 ，其收率也在9 0 以上。该法具有操作简便、原料易得、产物收率 和纯度高等优点。 1 6 课题的研究意义与研究内容 1 6 1 本课题的研究意义 由于天然产物化学研究所提供的活性物质结构新颖、副作用小、疗 效高，所以天然产物化学的研究成果已经广泛用于医药工业，它们也始 终是制药工业中新药研究的主要源泉之一【4 l 】，天然药物所显示的结构还 是新药设计的主要模型。此外，天然产物化学研究成果还广泛应用于农 业与工业当中。比如，甜叶菊中的甜叶菊甙及其它天然甜味剂已经开始 逐步替代糖精；豆瓜中的一种瓜胶多糖已经用到石油工业当中作压裂剂 等。当今，运用近代技术结合本国的资源情况开展研究，已经成为许多 国家天然产物化学研究的主要方向。在欧美、日本等一些发达国家，也 有许多科学家深入开展了海洋生物的化学研究，并探索海洋生物体内的 高活性物质；还有一批科学家转入研究生物合成工作，探索有效成分的 生物合成途径，为人工合成提供了合理的合成路线。因此结合我国特有 的天然产物资源，解决资源的合理应用，特别是结合我国历史悠久的中 医药传统，进行天然化学的研究应是我国天然产物化学家的历史任务， 以期我们在继承和发扬中医优势和特色的基础上，充分利用现代科学技 第1 章文献综述 方法和手段，研究开发出更多进入国际医药市场的中药产品。 葛根，历来有“千年人参”之美称，可用于新型中药和功能性保健 研究和开发。因此，合理开发利用葛根资源是十分迫切和需要的。 统的提取分离工艺却不同程度地存在提取效率低、生产周期长、对 产生严重污染等缺点，不能满足现代化市场的要求。因此，采用超 辅助提取，树脂分离纯化葛根总黄酮有着显著的潜在优势。 本课题的主要研究内容 本课题主要研究了以下几个方面的内容： ( 1 ) 以总黄酮的提取率为考察指标，研究了传统的乙醇回流法和超 声波辅助法提取葛根总黄酮，并设计单因素实验和正交实验，确定了这 两种提取方法的优化工艺。在各优化工艺下的提取物，采用正丁醇萃取 法初步纯化，比较纯化前后各产品的总黄酮含量。 。? ( 2 ) 以总黄酮的含量和收率为考察指标，研究了萃取法纯化总黄酮 的工艺。并考察不同的萃取溶剂、不同p h 值以及添加不同种类的无机盐 对纯化效果的影响。 ( 3 ) 研究了大孔树脂吸附分离法纯化总黄酮的工艺，筛选树脂，并 以正交实验为基础，确定该纯化工艺的吸附树脂的用量、洗脱剂浓度以 及最佳流速，还比较了萃取法与大孔树脂吸附分离法的纯化效果。 武汉工程大学硕士学位论文 第2 章实验材料与方法 实验试剂与仪器 1 实验试剂 第2 章实验材料与方法 本实验所需要的材料和试剂如表2 - 1 所示。 表2 - 1 实验材料与试剂 1 7 武汉工程大学硕士学位论文 2 1 2 实验仪器 本实验所需要的仪器与设备见表2 2 。 表2 - 2 实验仪器与设备 仪器名称厂家 旋转蒸发仪 真空干燥箱 2 4 5 0 u v 分光光度计 电热鼓风干燥箱 电子分析天平( | a l l 0 4 ) x m t b 数显恒温水浴锅 s h z d ( i i i ) 循环水式真空泵 k q 一2 5 0 d b 型数控超声清洗器 a g i l e n t11 0 0 系列高效液相色谱仪 上海嘉鹏科技有限公司 上海实验仪器有限公司 日本岛津公司 天津市泰斯特仪器有限公司 梅特勒托利多( 上海) 仪器有限公司 武汉市琴台医疗器械厂 巩义市英峪予华仪器厂 昆山市超声仪器有限公司 美国a g i l e n t 公司 2 2 分析方法 2 2 1 标准曲线的制作 葛根总黄酮的分析方法采用分光光度法，葛根黄酮的对照品在紫外 区2 5 0n l l l 处获得稳定的特征吸收峰。因此，直接采用分光光度法在紫外 区2 5 0n l n 处测定溶液的吸光度。 准确称取5 5m g 葛根素对照品，用9 5 乙醇溶解并定容于5 0m l 容 量瓶中，得到o 11m g m l 的葛根素标准溶液。依次精密吸取该标准溶液 0 、0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0m l 于1 0m l 容量瓶中，蒸馏水稀释定 容，得到系列对照品溶液。以1 0m l9 5 乙醇加水至1 0m l 作空白对照， 第2 章实验材料与方法 处测定各对照品溶液的吸光度，得到吸光度a 与总黄酮质量浓 m e ) 的线性关系，如图2 - 1 所示： _ 、 j 吕 壶 吕 、 u 谜 蠖 图2 1 葛根黄酮的标准曲线 从标准曲线得出的线性回归方程是：c = 0 0 1 5 0 2 a 一0 0 0 0 0 4 1 ；线性回 归系数是：r = 0 9 9 9 9 2 。 2 2 2 葛根提取液中总黄酮含量的测定 精密吸取葛根总黄酮提取液1m l 于5 0m l 容量瓶中，用蒸馏水稀释 定容，按上述2 2 1 项的方法操作，测定吸光度，根据线性回归方程计算 各提取液中总黄酮的含量。由此得出葛根总黄酮的提取率为： x=堡兰曼竺兰兰曼竺1 0 0 9 6、x= 一上 、 1 0 1 0 0 0 t 1 ( 2 1 ) 式中， x 一总黄酮提取率，； 武汉工程大学硕士学位论文 c 一由线性回归方程计算出的提取液中总黄酮浓度，m e m e ； 如 一稀释倍数； 2 5 0 一提取液体积，m l ； 1 0 一葛根质量，g ； l o o o , t 一葛根中总黄酮含量，m g g 。 2 2 3 葛根中总黄酮含量的测定 准确称取1 0 0g 葛根( 粉碎过2 0 目筛备用) ，加入8 0 乙醇2 0 0m l ， 在8 0 。c 水浴下回流提取6 0m i n ，抽滤，滤液用等浓度乙醇定容至2 0 0m l 。 滤渣同条件下反复提取5 次，至提取液中总黄酮的含量趋近于零，结果 见图2 2 。 、 一 昌 吕 、_ ， 趟 媾 疑 盛 裂 图2 2 提取次数与提取液浓度的关系 由图2 - 2 可以看出，经过5 次提取后，提取液中总黄酮含量趋近于零， 近似认为总黄酮已被完全提出。测定提取液中总黄酮浓度并计算葛根中 2 0 第2 章实验材料与方法 2 3 乙醇回流提取工艺 2 3 1 实验原理 柱( 2 5 0m m x 4 6i i l l n ，5l a i n ) ；流动相：甲醇一 流速：1 0m l m i n ；检测波长：2 5 0n m g 进样 溶剂提取工艺的基本原理就是按极性化合物易溶于极性溶剂，非极 性化合物易溶于非极性溶剂的一般规律来选择适当的溶剂。溶剂选择适 当，就可以将需要提取的目标成分从原料中比较顺利的提取出来。乙醇 回流提取葛根总黄酮就是通过乙醇水溶液来提取，依据“相似相溶”的 基本原理，选择比例适当的乙醇水溶剂来提取葛根中的黄酮类化合物。 具体工艺流程如图2 3 所示。 武汉工程大学硕士学位论文 i 干燥至恒重 2 3 2 操作方法 i 浓缩、干燥 图2 3 乙醇回流提取的工艺流程图 准确称取经预处理( 干燥至恒重) 的葛根1 0 0g ，加入一定量乙醇， 在设定条件下回流提取后抽滤，滤液用同浓度的乙醇定容至2 5 0m l 。按 照2 2 1 项的方法操作，测定提取液中总黄