（应用化学专业论文）生物大分子与有机小分子相互作用的荧光法研究.pdf

西南科技大学硕士研究生学位论文 第1 页 摘要 荧光光谱法作为一种重要的现代仪器分析方法，它具有灵敏度 高、选择性强、用量少、方法简便、信息多样等优点，因而被广泛应 用于化学、生物学、药学、医学、环境科学等领域。 本文提出以巴比妥、酞紫、甲基百里酚蓝和达旦黄为荧光探针， 研究结果表明： l采用荧光光谱法分别研究了巴比妥、酞紫与牛血清白蛋白相 互作用的特点，实验发现巴比妥、酞紫对牛血清白蛋白均有较强的荧 光猝灭作用。利用荧光猝灭理论，分别研究了巴比妥、酞紫对牛血清 白蛋白的猝灭机理，测定了两个反应体系的结合常数、结合位点数及 热力学参数g 、h 和s ，根据热力学参数和离子强度实验确定了 两者的作用力类型。采用同步荧光技术分别考察了巴比妥、酞紫对牛 血清白蛋白构象的影响。 2 采用荧光光谱法和紫外一可见吸收光谱法分别研究了甲基百 里酚蓝、达旦黄与牛血清白蛋白结合反应的特征。实验发现：甲基百 里酚蓝、达旦黄对牛血清白蛋白均有较强的荧光猝灭作用，根据荧光 猝灭数据，由s te r n v o l m e r 方程和l in ew e a v e r b u r k 双倒数方程得 到了反应的结合常数和热力学参数，并由此推出了结合反应的主要作 用力类型。在此基础上依据f o r es t e r 非辐射能量转移理论，分别探 讨了甲基百里酚蓝、达旦黄与牛血清白蛋白相互结合时，给体一受体 间的距离和能量转移效率。从而证实了反应为静态猝灭过程，且阐明 了其猝灭机制是通过能量转移产生的。 3 对达旦黄与d n a 的结合反应进行荧光光谱法、紫外光谱法等 方面的研究，结果表明：在p h = 7 4 的溶液中达旦黄与d n a 的双螺旋 碱基对之间存在嵌插作用和静电力作用。基于在达旦黄中加入d n a 后，达旦黄的荧光被猝灭，建立了达旦黄测定d n a 的新方法。在最佳 实验条件下，d n a 的线性范围为o 5 5 2 7 1 0 m o l l ，最低检测限为 2 2 2 1 】o m 0 1 i 。 关键词：荧光光谱法同步荧光法荧光猝灭理论脱氧核糖核 酸( d n a )血清白蛋白 蘸南精按文学硕士磺究生学位论文 第1 i 耍 a b s tr a c t f l u o r e s c e n c e s p e c t r a l m e t h o di so n eo f i m p o r t a n t m o d e r n i n s t r u m e n t a la n a l y s i st e c h n q u e s h i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y ，s m a l l e o n s u m p t i o n ，s i m p l eo p e r a t i o na n dm u l t i p l ei n f o f l n a t i o nd 8 t aa r et 圭l e v i r t u e so ft h em e t h o d s oi t 量l a sf o u n dw i d ea p p l i c a t i o ni nv a r i o u sf i e l d s ， i n c l u d i n gc h e m i s t r y ，b i o i o g y ，p h a r m a c y ，m e d i c i n e ，a n de n v i r o n m e n t a l s c i e n c e ， b a r b i t o n e 、p h t h a l e i np u r p l e 、m e t h y lt h y m 0 1b l u ea n dt i t a ny e l l o w w e r ep r o p o s e da sf l u o r e s c e n tp r o b e s r e s u l t ss h o w o dt h a t ： lt h ei n t e r a c t i o nc h a r a c t e f i s t i c so fb a r b i t o n e ( b b t ) 、 p h t h a l e i n p u r p l e ( p p ) w i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w e r er e s p e c t i v e l ys t u d i e d b yf | u o r e s c e n c es p e e t r 硅m ，t 量l er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hb b ta n dp p 量l a d p o w e r f u lc a p a b i l i t y t o q u e n c h t h eb s af l u o r e s c e n c e w i t ht h e q u e n c h i n gf l u o r e s c e n c es p e c t r at h e o r y ， w es t u d i e dt h e q u e n c h i n g m e c h a n i s ma n dm e a s u r e dt h eb i n d i n gc o n s t a n t 、t h eb i n d i n gs i t e sa n dt h e t h e r m o d y n a m i c sp a r a m e t e r s ( g 、 ha n d s ) a c c o r d i n gt o t h e t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sa n di o n i ci n t e n s i t ye x p e r i m e n t ， t h em a i n s o r t so fb i n d i n gf o r c ec o u l db ek n o w n t h ee f f e c t so fb b t 、p po nt 圭l e c o n f o f | n a t i o no fb s aw e f ef e s p e c t i v e l ya n a l y z e du s i n gs y n c 量l f o n o u s f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y 2t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h eb i n d i n gr e a c t i o no fm e t h y lt h y m o i b l u e ( m t b ) 、t i t a ny e l l o w ( t y ) w i t hb s aw e r er e s p e c t i v e l ys t u d i e db y f l u o r e s c e n c ea n du l t r a v i o l e t - v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r a ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tb o t hm t ba n dt yh a dp o w e r f u la b i l i t yt o q u e n c ht h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fb s a ，t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gd a t aw e r e a n a l y z e da c c o r d i n gt os t e f n v o l m e re q u a t i o na n dl i n ew e a v e r b u r k e q 驻a t i o n ，a n dt h eb i n d i n gc o n s t a n t ，a n dt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s w e r eo b t a i n e d a c c o r d i n gt ot h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r st h em a i n s o r t so fb i n d i n gf o r c ew e r ed e t e r m i n e d t h eb i n d i n gd i s t a n c ea n d e n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c yb e t w e e nd o n o r ( b s a ) a n da c c e p t or ( m t bo r t y ) w e r eo b t a i n e db yf o r s t e r sn o n r a d i a t i v ee n e r g yt r a n s f e rm e c h a n j s m 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1 i i 页 i tw a sr e s p e e t i v e l ye o n f i r 撒e dt h a tt 圭l ec o m b i n a t i o nr e a c t i o nw 8 sas t a t i c q u e n c h i n gp r o c e s s ， a n dt h e i ri n t e r a c t i o nr n i g h tb ei n t e r p r e t e dw i t h e n e r g yt r a n s f e rm e c h a n i s m 3t h ei n t e r a c t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft yw i t hb s aw e r es t u d i e db v f l u o r e s c e n c es p e c t r u ma n du l t r a v i o l e t v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r a t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt yw i t hd n ab vi n t e r c a l a t i o na n de l e c t r o s t a t i c a t t r a c t i o n t yc o u l di n t e r c a l a t eb e t w e e nt h eb a s i cd a i r so ft h e d o u b l e h e l i c a ls t r u c t u r eo f n a 。s ot h a ti t sf l u o r e s c e n c ed e s c e n d e d m a r k e d l y an o v e ln u o r e s c e n tm e t h o dw a s d e v e l o p e d f o r r a p i d d e t e 撒i n a t i o no fd n aw i t ht ya saf l u o r e s c e n c e 势r o b e ，b a s e do 珏t h e f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go ft yi nt h ep r e s e n c eo fd n a u n d e ro p t i m a l e o n d i t i o n s ，t 量l ec a l i b f a t i o ng r a p 圭l s 5 5 2 7 1o + 4 m 0 1 lf o rd n a t h e 2 2 2 l 1 0 。5m o l l w a sl i n e a fo v e rt h er a n g eo fo c o r r e s p o n d i n g d e t e c tl i m i tw a s k e y w or d s ：f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ；s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y ； f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gt h e o r y ； d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) ；s e r u ma l b u m e n 独创性声明 本人声嗡所里交的论文是我个人程导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南科技大学或其它教4 霄机构的学位或证书面使用过的材料。与 我一闻工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：毕农颍 目翔：扣占。，矿 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解谣南搴斗技大学蠢关保留、使用学位论文的规定，鼷： 学校有权保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可 以公蠢该论文的全都或部分内容，可以采用影印、缩印或其健复制手 段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守扛匕规定) 签名：毕印屯钕 导师签名 a 氓j 扩似彤 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1绪论 1 1研究意义 生物大分子是指在生物体内存在的具有特殊生物学功能的商分 子化合物，主要包括器白质、酶、核酸、多糖和脂类。其中，蛋囱质 和核酸是生命现象的基本体现者。蛋白质作为生命物质的基础具有各 稚重要的生理功能，安鞋生物体薪陈代落中越催化剂作壤的酶、多种激 素、细胞生长分裂的调节因子和细胞表面与内部的各种受体等等，它 是肌肉、皮肤、血液和毛发等的匿要成分。核酸作为遗传物质的基础 决定着遗传信息的传递，参与遗传信息在细胞内的表达，从而促成并 控制伐谢适程，所以孩酸在生物戆生长、发育及繁殖等生命活动有重 要的作用。因而研究蛋白质及核酸的结构与功能的关系，有利于人们 从分子水平上了解生命现象的本质。 由于蛋白质和核酸的分子煮巨大、结构复杂，使褥蛋白质与核酸 的研究受到了缀大匏限铡，近年来蛋自质与核酸的探舒研究为这一难 题提供了很大的帮助。在化学意义及生物学意义上的探针( d r o b e ) ， 是指能与特定的靶分予发生特弗性相互作用的分子，并可以被特殊的 方法藤检测。如生物光谱探钤就怒能与生物大分子发生相互作用的化 学试裁( 有机分子、无襁l 离子或络合物) ，这些试剂与生物大分子反 应或作用产生荧光、紫外光、可见光等方面的光信息变化，由所获信 息可进行生物大分子以下研究内容：( 1 ) 研究生物分子所具有的秘来 被发现的特殊缤惠；( 2 ) 利用光谱探锌，建立薪豹商灵敏度、具露特 殊选择性的分析检测方法；( 3 ) 利用生物探针研究生物分子与物质结 合的机理、化学键的键合性质及反应的基本条件。通过研究的信息， 认识和了解一些物质与生物大分予的结合在生命枫体中的行为与表 现，并推导和预溺其窕物质与生物大分子的作用和功憨，并可以靛制、 调整或排除有毒有害物质与生物太分子的结合与反应。 借助蛋白质探针的研究不仅对改进蛋自质分析方法有实际意义， 还有劲于阐明蛋叁质与小分予配体之闯耀互作用豹化学本震，两且对 研究蛋白质结构与功能的关系提供了有效的手段。核酸探针除上述优 点外，还对基础研究及临床上的各种传染病、遗传病、肿瘤等疾痫的 诊断越来越显示出其独特的优势。因而，生物探针已广泛运用到生物 西南科技大学硕士研究擞学位论文第2 页 工程、临床医学、基因工程等研究工作中，能准确定性、定量的反映 生物大分子中豹各方面磷究信息和引导研究工作的深入发展。 总之，对蛋白质、核酸探针的研究，可以用来研究蛋白质、核酸 的商级结构及滔明其生物学意义；可以建立完善豹、抉遽准确的测量 蛋囱质、核酸的定黛方法；可以指导新药的合成及药物体外筛选工作， 尤其是抗肿瘤药物的研究。 1 ，2 有机小分子与生物大分子相互作用的荧光法硪究 进展 荧光分析法具有高灵敏度、高选择性、需样品量少、方法简单和 信息多样等优点，使其在物质的测定中有独到之处。因而广泛地应用 于工农娆、医药卫生、环境污染簸测和科学研究等各个领域，成为生 命科学研究中重要的分析方法。 研究与生物分子据萎作愿的荧光探铮大概分为三类：有机分子 型、金属离子型和金属配合物型。本文主要介绍有机荧光探针技术， 有机分子荧光探针主要有分析试剂和药物两类，它是指利用有机分子 荧光探测荆与生物大分子戳共价键或菲共价键结合，根据结合前后荧 光信号发生的变化，以此来推断生物大分子的含量或结构等信息。 1 2 1 有机小分子与蛋白质相互作用的荧光法研究进展 有机荧光探针技术可对蛋白质进行定量分板和作用机理两方瑶 的研究。它的定量分析是医学、嫩物学、化学和其它学科中经常涉及 的分析内容，又是临床检验中诊断及评价疗效的重要指标，同时也是 谗多药物分析提缝豹厦量检验戳及食品检验中鬻凳的分移亍项强；研究 探针分子与蛋白质相互作用的机理，能够间接地认识和探索生物大分 子的结构、性质和行为。 1 2 1 1分析试剂型荧光探针研究进展 羼前，已发现用来定最测量鬃自质荧光的探针狠多，见表卜l ， 下颟就蛋白质荧光探针作用机理方面的研究情况进行介绍。 研究最早的蛋自质荧光染料探针，热8 一苯胺基一l 一萘磺酸( a n s ) 、 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 箍 议 粕 舔 t c 0 2 爱毫 誉=蓦 呻 一 一 竺 誉 4女 三 gg gog 三 d gd *蛰5 。 s ； 百 溅j ： 亭事 暑 孚 2主 事 千 莘 ，三 嘏 !薹 耋 羔 至量 善士 薹 呈 划” 。 蠼甚 螺“ 谶 米： 米+ 拭嚣 曼萎菩 譬蠹 鐾赛器暑誉 譬皇 湍 崎卜 叫 蜷苗 皿e 黼! 侧= 霞2 粼三 篓 = 器2 譬慕景薯2 誉 l 兰 帕甘畸i 2 叫 t 甚 p n 7 卜 亨宁 嚣 亨 誉 薹 叫 鞯笤 土 。釉 三 圭 ： 薹 二 苦 三 坼 。 善 酶 删 窭萎羔 磊蒉爱爱蒉器羞 丫 嚣 互 叠 。 嗣， j 敝 蚕 溪 圣鋈 鬟 妻 菱 髹 薹 萋 堪 露南科技大学硕士避突生掌位论文繁4 页 2 对一甲苯胺基萘一6 一磺酸( t n s ) 、l 一( n 一二甲胺) 一豢一5 一磺酸( d n s ) 、 铬天青s 寝荧光胺等m 。t n s ( 2 一对一甲苯胺基萘一8 一磺酸慧) 是一秘 疏承荧光深舒，它在水耜中不发荧光，但在有机相发出强烈荧光。当 t n s 与具有疏水区域的蛋白质b s a 作用时，发出很强的荧光，这说明 l k s 与b s a 上躲藏窳区域攘馋忍。阏薅酸窳荧竞据镑a n s ( 8 一苯胺鏊 一卜萘磺酸) 由极性环境转入到非极性环境后，荧光增强。然后有用 胰蛋白酶将b s a 分割，用个片断与溶菌酶交联并用交联厩的溶菌 懿与矗k s 馋蔫，发现矗n s 瓣荧竞增强了l g g 绩，嚣溶蓉酶本务无魏袋 象，这间接说明了疏水力作用的存在”1 。 y u t a k as ”1 研究了十几种有关铬天青s 的染料与h s a 的相互作 鬻，发嚣禽羧基静染料与 s a 挥蔼衙其设救光谱发生红移，继荧先强 度不变化，而铬天宵r 与h s a 作用詹的荧光强度增强，这可能与羧基 的离子化及染料的平覆性蠢关。马赛琪等m 涟一步磷究了蛋彝震与铬 天青s 豹桶互作用，认为铬天青s 优先与b s a 上的饿氨酸结合，随萁 浓度的增大，铬天青s 开始与酪氨艘结合。在p h 假小于b s a 等电点 辩，嚣考之阗菠静魄力摇结合；大予等毫煮以后滋滚东力结合，爱应 符合相分配模型。 近年来，关于徽白质荧光探针的研究又有新的遴展。如水溶性卟 辫8 ，多，￥，5 一强( 黠磺笨基) 渗( p p s ；) 稻8 ，y ，6 一舀( 辩 羧苯基) 卟啉( t c p p ) 就是性能优良的蛋白质荧光探针。利用微量的 蛋白质就可对t p p s t 的荧光产生猝灭作用，可以测定绒克级的爨自质。 西t c p p 在酸往条 警下荧光缀弱，但加入少羹自蛋白就可傻t e p p 荧光 增强( 除球蛋白) 。当有s d s 存在时，白蛋白和球鬃白都能使t c p p 的荧光增强终用增翔，基予这一现象，霹以剃震一个溅定体系分别i l i | | 定臼蛋白和球蛋白”、。 李东辉等”1 用荧光各向异性法研究了四磺基铝酞篱与b s a 的相互 终援，试麓褒者之瓣存在强、弱嚣耱俸建方式。在p 疆3 ，0 静分陵中， b s a 高度膜子化，由于四磺基铝酞篱在此介质中仍以负电荷形式存 在，并带脊较多负电荷，因此与b s a 发生静电作用蕊在b s a 上聚集， 势京在霆骥基锯酝簿之润静辐互辩斥彳车箱。在8 s 矗浓度较低时其溺围 有较多的四磺基铝献箐聚集这时排斥作用较强，从而削弱了四磺基铝 酞褥与b s a 之间鲍楣互作用。但只鸯那些与b s a 有较强终用的鲤磺基 铝酞等分予才能弓f 超荧光备淘异性的变化。 西南科技大学硕士研究生学位论文 第5 页 徐弱宽等m 合成了一种新型的荧光探钟3 h 一晖l 哚季铵盐分予，并 运用荧光光谱探讨它与牛斑清蛋白的作用。结果表明，探针分子与 b s a 的结合作用可使3 h 一吲哚的荧光强度增强，而对强白质却具有猝 灭作用，其结合常数和结合位点数分别为k = 1 9 9 5 1 0 5 d m3 m o l 。1 和 n = l ，1 2 。 刘保生等”一磷究了苯酚磺酞类酸拣染料苯酚红、甲酚红、氯酚红、 澳甲酚紫、间甲酚紫与人血清白蛋白( h s a ) 之间的相互作用。实验 表明：苯酚磺酞类酸性染料对h s a 的荧光有较强的猝灭作用，其荧光 猝灭主要为静态猝灭，从荧光猝灭结果求得不同温度下各染料与h s a 的结合常数k ，发现染料取代基的引入使k 值增大，且随反应温度上 升k 篷下降。由染攀 与 l s a 反皮焓变、熵变，确定染料与h s a 主要戳 静电力结合。又依攒菲辐射能量转移机理，阐明了其猝灭过程是通过 能量转移产生的。 1 2 1 2 药物型荧光探针研究进展 各种药物与人类的生活和健康都密切相关。药物进入血液后随着 血液循环分布手全身，发生药理作用，在这一过稷中，药物分子必然 不同程度地与血浆蛋白( 主要是血清自蛋自) 结合。这萃申结合作用对 药物的活性、药物在体内的储留时间和作用强度都将产生影响。鼠此， 研究药物分子与血清白蛋白的相互作用，是药物动力学及临床药理学 的重要内容。 药物与餐白质榴互作翔后会引起药物自身荧光光谱的变化或引 起蛋白质垂身荧光( 癌源荧光) 光谱酌变化，如改变药物的荧光强度， 改变药物的荧光偏振度，出现新的荧光峰等，因样可以提供药物与蛋 白质相互作用的信息，结合有关理论计算，则可提供结合部位，结合 常数，结合位点之间的距离以及一然热力学参数等物理学参数，该方 法具有灵敏快速的特点。 荧光分柝法癍用于药物分析始自十九世纪6 0 年代，常兢荧光分 析法最早被应用于分橇抗疟疾药物奎宁。近几十年来，| 2 壅着荧光分丰厅 的发展，其应用范围也网益扩大，样品的品种除抗疟药品於，还广泛 的应用于抗菌素( 青霉素、金霉素、四环豢、土霉素等) ，抗结核萤 药品，止痛药和麻醉药强心荆，止血药及治疗高血压药品，镇静剂等 的荧光分析“”。所涉及的方法包括鸯接荧光法、衍生物荧光法、荧 西南科技大学硕士研究生学位论文 第6 页 光猝灭以及光化学诱导荧光法等。顼采用的仪器手段也不仅崩限常规 荧光法，而且应用到近代荧光分析的许多新技术，如同步扫描荧光时 间分辨荧光、激光诱导荧光等，所采用的方法在提高分析方法的灵敏 度，改善方法的选择性等方面也都得到了很大的提高。 国外对药物与血清白蛋白结合反旋的研究较翠“。国内在这方面 的研究也有十几年豹历史，并取褥了一定的成果，觅表卜2 。 1 2 2有机小分子与核酸相互作用的荧光法研究进展 核酸是生物所特有的重要大分子物质，从低级的细菌、病毒到高 级的哺乳动物，乃至人类的全部生命现象，如物质代谢、性状遗传、 缨臆的分裂分化、繁殖等，都是核酸积极参与的结果。核酸的结构宣 接影响其功能，并且与致癌、抗瘿有关。 对核酸进行定量或定性研究的方法有许多，像放射免疫法，酶标 记免疫法，生物素标记法，化学发光法和荧光分光光度分析法。其中 荧光分光光度法的灵敏度高、选择性好、方法简便，因而许多用于d n a 分析溯定的荧光分析方法便发展起来。但是，我们知道，在家温下， d x a 的内源荧光量子产率很低，因疵不糖利用爱光技术直接研究核酸 的结构和性质，两必须引入荧光探针。利用d n a 对一些小分子荧光探 针的荧光增强或猝灭作用来研究小分子探针和d n a 的相亘彳乍用葶曩进 行d n a 的定量分析，方法比较简单，应用较广。 拔酸分子与小分子化合物的作用有三种方式“，第一种是静电作 用，龀作爝沿着d n a 双螺旋结构的外壁作用没有选择性鼠受到溶液 中离子强度影响较大：第二耱是与0 k a 的沟耩榴聂作用 第三种是 嵌入作用，后两秘作用方式其有选择性，医丽它们是该研究领域的重 点。 1 2 2 1分析试剂蛰荧光探针研究进展 分析试剂作为有机分子型核酸撵针的研究工作较多，研究较孚的 存溴化乙锭( e 8 ) “、4 ，6 一二蟹基一2 一苯基吲嗓盐酸狳( d a p i ) “、 二苯并咪唑染料h o e c h s t 3 3 2 5 8 m ，、嚷唑橙的二聚体( t o t o ) 、唑黄的 二聚体( y o y 0 ) “。e b 本身的荧光强度很弱，但与d n a 作用后e b 的 生色团( 平面菲罗啉环) 嵌入到碱基对中，则e b 的荧光强度被大大 加强。因丽e b 是裣铡双链d n a 灵敏的探针试剂。s l a d el e esm 一研 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 麓 似 刹 粼状 釜 r r rr- r较 畏r r e r * 麓 廿母心翟 苌繁簧* 髓 幡 鋈 稚 湓 箍箍褥鬻猎懵惺 世 e d 磐考 擎； 球 h 肇警 o_o 2b2 蠼专 券。 h x 薹 蚤 薹薹 蚤 荟 x o 取o g “ 门 文式 舳 gg 醋 倒= 蟋： q 三 目 蟠暑 矗 压。 o h 啪兰 正9 媲 刚 目 。 嚣 稍拍稳稻糟 谗桶憎姻怕柏拍拍桶 | f i i 竺 联 箍艋灏艋箍艋艋 拯纛箍髓艇疆辘 爨； 黏 嫁三 皿 甲三 咖 蜒 墨 =墨 | | 莘 鲁 棰 喇 划 喇 魁 斑 整誊 赇 孽蜚 暇喾餐 鋈 蒙 鋈妻 婶 叁爨 篓 薹娄垂 1 嘲台磺 羹 暴 雾窿 蜮磁 薹 臻 酶骊瓣 耀 基蚓膝 剥 辖橱坼氍嚣婆糯螺谈糯 廿糯 目襁 j 0 趣 料南科技大学：硕士研究生攀位论文第8 页 突了d 矗p i 与d n 矗瓣握互终嚣，荬荧戈巍谬懿激发渡长受3 s o n 辍，发 射波长为4 4 5 n m 一4 6 0 n m ，其荧j l 强度与d n a 浓度呈线性关系，可用来 定量测量树叶中的d n a 的含擞。r y ehs “”研究了嚷唑橙的= 聚体 ( t o t 0 ) 、唑黄的二聚体( y o y o ) 与核酸的楣互作用，指出在p h 8 ，2 ， t is 一乙黢薤0 ，l 瑶鞯e d 矗o ，g 5 麓髯a e l 条停下，荧光强度罐强，测定 d n a 的线性范围为o 5 10 0 n g m l 。 但魁由于溴化己锭( e b ) 舆有强烈的教癌性现在已经很少使用， 且二聚体染料t 0 下0 与￥o y o 等的份格鞋：鞍爨贵，所以人艇希望找翔无 毒、价格便宜测量d n a 的荧光探针。有祝荧光小分子中亚胺试剂可作 为d n a 的荧光探针，如m a s u d ag “”研究了合成的含碳化二亚胺功能 团的试剂与d n a 的相互作用，发现荧光峰的位置及强度发生了改交。 g u oxq “”磅突了藏缎羊与器瓣矗豹稳互终蠲，据密其焚光疆o n a 獬灭， 认为这鼹豳为两者形成了不发光配合物所敬，测定d n a 的线性范嗣是 1 4 o n g m l 一1 5 o u g m l 。魏亦男等n “研究了邻菲罗啉与核酸的相互作 用，指惑当邻菲罗啦受到2 3 0 n 壤及2 6 7 n 瑚鳃紫井光激发，在3 6 7 n 噩 产生戆荧光漳旋蚤n a 弊灭，谈为邻嚣罗曝嵌入到了d n a 双螺旋结褊中， 并与d n a 碱基间存在配位作用及疏水力所致。 也有用酸碱荧光指示剂作为核酸探针。有作者研究了吖啶橙与核 酸靛据戛馋展”“，d a r z y n k i e w i e zz m t 认为霹跌羯茨党弱定绥熬中 豹核酸。认为其荧光强度增大是因为阴离子表面活性剂溶液中的 d n a 使吖啶橙的单聚体与双聚体之间的平衡发生变化，单聚体嵌入 d n a 中，引起二聚体的离解，母致荧光增强。唐宏武等m ，指出吖啶 整与核凝结合夔方式：耱燕在嵌a 竣酸双链懿璇蒸对之润，形成 a o d n a 复合物，另种是与d n a 单链核酸的磷酸基团发生静电作用， 形成吖啦橙一r n a 复合物。 s c h y 谨酽”研究二氨基苯学黢与d n a 懿襁互作用，援出b is 下r is 缓肆滚会辩荧先定鬃分辑d n a 产生于挠，灏为b is 干r is 可髓转交成 一种含聪甲基的醛，念与二氨熬甲苯酸生成发荧光的产物，从而干扰 测定，提出用二氨基蔓| 芝甲酸一2 h c l 荧光法联合紫外光谱法测2 6 0 n 盯l 的 啜兜度采溅藿d n a 瓣缝度。 还有些其他的分析试剂作荧光探针。b h a t t a c h a r y as 一，利用含 有葸基的荧光探针研究表面活性剂与d n a 的相互作用，指出阳离子型 表面活性剂和盐可以诱导d n a 构象转变，使得结合在d n a 上的荧光探 西南科技大学硕士研究生学位论文 第9 页 针分子被释放出来，而且表面活性剂的加入或其他物质的加入均导致 d n a 熟熔点温度的升高。此外还有：h y p o c r e l l i na 1 、水杨酸1 、 甲基萘并二呋喃m 1 、9 ，1 0 一葸醌一2 一磺酸钠”“等。 1 2 2 2 药物型荧光探针研究进展 d n a 与药物分子相互作用的研究对阐述抗癌、抗病毒药物的作用 机理、药物的体外筛选及对致癌物机理的研究都是非常有意义的。其 荧光探针的研究工作主要有： 李志怠等m ，已将荧光法用于抗癌药物的初步筛选。唐宏武等n “ 根据吖啶橙具有可穿过完整细胞膜并能使细胞内d n a 和r n a 染色的特 点，提出了一种新的抗癌药物的筛选方法。研究抗生素、抗癌药物有 益于进一步阐明药物与抗病的机理，因而这方面的研究将对抗癌新药 的设计有重要的意义。 宋功武等“”和贺吉香等m ”等采用紫外光谱、荧光光谱、荧光偏振、 热变性曲线等手段对小蘖碱与d n a 的作用方式进行了研究，证实了小 蘖碱是通过嵌插方式与d n a 相互作用的。江崇球等“”也利用荧光光谱 法、荧光偏振法及紫外吸收光谱法研究了多粘菌素b 与d n a 的作用方 式。李来生等“利用荧光光谱、荧光偏振等手段研究了更生霉素d ( a c t i n o m y ind ，a c t d ) 与小牛胸腺d n a 的作用机理，认为a c t d 与 d n a 之间不存在静电力作用，主要是嵌入和沟槽两种作用。王瑞琼等 m ，也利用荧光光谱法和荧光偏振研究了丝裂霉素c ( m i t o m y c i nc ， m m c ) 与小牛胸腺d n a 的作用机理，认为m m c 与d n a 之间发生交联， 且两者之间存在沟槽和部分嵌入两神结合方式。 z h o n gwy 等“”利用荧光光谱法、吸收光谱法研究了d n a 与药物 c h l o r o b e n z y l id i n e 结合反应，并研究与d n a 相互作用的键合常数、 键合模式和热力学性质。胡敏等n “利用荧光光谱法和吸收光谱法研究 了抗癌新药吡柔比星( t h p ) 与d n a 的作用机理，结合常数及结合位 点数，并认为t h p 的葸醌环与d n a 的碱基对发生嵌入作用，而t h p 的含糖侧链与d n a 有小沟槽作用。郑朝华等n ”采用荧光光谱法研究了 左氧氟沙星与小牛胸腺之间的作用机理、结合常数、结合位点数等， 并认为两者之间可能是以沟槽作用模式结合。 b a i l lyc m ，应用荧光滴定方式结合d n a 的印渍( f o o t p r in t in g ) 技术研究了柔红霉素与d n a 之间的相互作用，研究了柔红霉素与d n a 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1o 页 的主要结合位点及机理。 袁小英等m ，粥荧光法研究了环丙沙掇与d n a 的相互作蠲，利用所 测得的结合常数研究了铜( i i ) 对环丙沙星和d n a 相互作用的影响及 其可能的虮理。潘褪亭等”采用荧光光谱法研究了提橼酸氯米芬与 d n a 之间的相互作用。在p h = 7 4 接近人体体液的条件下，枸橼酸氯 米努浓度小于1 0 0 l o “m o l l 时，两者作用方式表现为沟槽方式； 当构橼酸氯米芬浓度较高时，主要作用方式表现为混合模式。 1 3课越来源 本研究课题“生物大分子与存极小分子相互作用的荧光法研 究”，受豳家教育部科学技术研究重点项目( 0 2 12 6 ) 、自然科学基余 资助项目( 2 0 0 2 c 0 4 ) 、国家电分析化学重点实验室基金项目( 2 0 0 5 0 0 7 ) 和潮川省辩学技术重点攻关项目( 0 3 g g 0 0 9 一0 2 4 ) 的支持。 1 。4磺究内容 光谱探针在生物工程、悔床医学、基因工程等研究工作中已被广 泛应用，它能够准确豹定性、定薰反映生物大分子的各方面研究信息 和引导研究工作的深入发展。 本文采用荧光光谱法鄢紫外一吸牧光谱法分别研究巴比妥、酞紫、 甲慕百里酚蓝和达旦黄与牛血清白蛋白之间的作用机理。利用荧光猝 灭理论探讨体系的猝灭类裂、反廒速率鬻数、作用力类型、热力学参 数、结合常数及结位点数。采用同步荧光技术分别研究巴比妥、酞 紫和甲基百里酚蓝对牛血清白蛋自构象的影响。并依据f o r es t e r 非 辐射能量转移理论，分别探讨甲慕百里酚蓝、达塑黄与牛盘清翔蛋自 作用体系中给体一受体间的作用距离和能量转移效率。 采用荧光光谱法和紫铃吸收光谱法研究d n a 对达盟黄的焚光猝 灭作用，利用荧光猝灭理论探讨体系的猝灭类型、反应速率常数、热 力学参数。通过吸收光谱、变性d n a 实验、离子强度实验探讨达旦黄 与d n a 之闻存在豹相互作用力。基于在达旦黄中加入d n a 后，达旦黄 的荧光被猝灭，建立d n a 的定量分析方法。 蔓妻愁燕态堂璧圭堡塞兰兰壁堡塞笺! ! 要 _ _ _ _ _ _ _ _ 。“_ ”_ 1 1 。1 。”一 2巴比妥与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱 法研究 巴比妥( b a r b i t o n e ，又名二乙基巴比妥酸，其结构式见图2 一1 ) 是镶静、催眠药，霹改善病人的睡眠、抗焦虑、鳃除烦躁起到重要的 作糯。但是，巴比妥类药物具有中枢神经系统柳制作用，通常被人们 称为蜜眠药，长期服用还会导致成瘾和耐药性。巴比妥( b b t ) 是在 1 8 6 0 年代在德国拜尔实验窳中完成的，1 9 0 3 年巴比妥第一次运用在 医疗上。本文利用荧光光谱法研究了b s a 与巴比妥的相互作用的机 理，这对阐明巴比妥在体内的运输过程以及其药理作用有重要的意 义。 f ig 。2 一 隧2 一巴比妥的分子结梅 h e 瞻o l e c u lars t r u c t 口r eo f 8 ar b j t o n e 2 1实验部分 2 1 1仪器与试剂 r f 一5 3 0 l p c 荧光分光光度计( 日本，岛津公司) ；酸度计8 6 8 型 ( 樊围，孙e r m oo r i o n ) ；瞻温制冷加热水浴( 丹麦， e t o c b n8 3 0 ) ； 移液器( 德国，e p p e n d o r 譬) ；隔拳式潼瀣培养箱( 上海一恒疆技有限 公弼) 。 牛血清白蛋自( 生化试剂上海丽珠东风炭物技术有限公司) 0 4 5 m g m l ，置冰箱0 4 保存；巴比妥( 分析纯天津市科密欧化学 试剂开发中心) 6 7 1o m 0 1 儿；b r i t t o n r o b i n s o n ( b r ) 缓冲溶液 ( 由0 0 4 m o l l 的磷酸、冰醋酸、硼酸和o 2 m o l 几的氢氧化钠溶液 西南科技大学硕士研究生学位论文 第12 页 按一定的比例配制厮成) ：t r is h c l 缓冲溶液：其余试剂均为分柝纯 实验用水为二次去离子水。 2 。 。2实验方法 准确移取1 0 m lb s a 溶液于1 0 o m l 容量瓶中，荐加入适量b b t 溶液，p h 值由缓冲溶液控制，以二次去离子水定容后援匀。然后置 予1 c m 荧光比色皿中，固定荧光激发波长2 8 0 n m ，入射和出射狭缝均 为5 on m ，扫描荧光光谱并测量荧光强度。 2 2结果与讨论 2 2 1 荧光光谱 巴比妥本身没有荧光，牛血清白蛋自由于含有色氨酸、酪氨酸、 苯丙氨酸等芳香氨基羧残基，具奄内源荧光。固定b s a 浓度，逐渐增 加b b t 浓度，结果发现：b s a 的荧光强度不断降低，但发射峰的位置 积峰形不交( 见图2 2 ) ，这表明b b t 对b s a 的荧光有猝灭作用。 豳2 2b b t 对b s a 的荧光猝灭光谱 f ig 2 2f iu oreseenceq u e n c h in gs p e c tr ao fb s aa sb 8 t 辑er ea d d e d cag ：o 6 7um 0 1 l ：c 日bt ( l o4 m o l l ) ：1 ：0 ，2 ：0 0 67 3 ：o 2 0 1 4 ：o 33 5 ，5 ：o 4 6 9 ， 6 c 8 l ：0 3 3 5 l o 叫m o l l ( b l a n k ) ； ， 。= 2 8 0 n m 345 n m 嚣南科技大学硕士研究生攀位论文第 3 页 2 2 。2p h 值的影响 实验中固定b s a 的浓度，加入一定量不网p 值的b r 缓冲溶液， 扫描b s a 的荧光发射光谱( 见图2 3 和2 4 ) 。b s a 荧光光谱在6 8 之间变化很小，在p h 10 的碱性环境中，8 s a 变性使肽链伸展，强度开始迅速下降 “。因此， 实验应在中性的条伟下进行。图2 5 为p 僵鼹8 b 王猝灭8 s a 荧光强 度的影晌，从图中珂看出在p l 为6 8 躲藏嚣内f 基本缣持不变。 因此，本实验选择在酸度接近人体体液的p h7 4 0t r is 一 c l 炭化缓 冲溶液中进行。 圉2 3b s a 在酸性条件下的荧光光谱 f g 2 3 f iu orescences p e c tr ao fb s a na c i d cs o iu t io n s l 一6 ( p h ) ：1 8 9 ，2 6 l ， 3 19 ， 4 12 ，5 2 0 。6 2 8 ：cb s ：o 6 7 m o l l ： 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1 4 页 椭m 图2 4 b s a 在碱性条件下的荧光光谱 f ig 2 4f iu orescenees p e c tr 鑫o f b s ain a k a l ；n es o iu t lo n s l 一6 ( p h ) ：7 1 4 ，8 1 4 ，9 0 4 ，1 0 5 0 ，1 1 o o 1 1 8 0 cbs ： o 6 7um o l l 1 2 0 1 1 0 也1 0 0 q 9 0 。 。= 2 8 0 n m 3 4 5 n m 6 06 57 - o d h 7 - 58 o8 - 5 图2 5p h 德对b b t 猝灭8 s 荧光强度的影响 f ig 2 5e f f e c to fp ho nf iu orescenceq u e n c h in go fb s ao nb b t c b s a ：0 ，6 7 1 0 畸m o l l ：c # e t ：0 3 3 5 l om 。l l ： 。l x 。= 2 8 0 n 日3 4 5 n m 1 6 ( p h ) ：6 2 8 ，6 7 8 ，7 1 4 ，7 7 0 8 1 4 西南科技失学硕圭聚变生学位论文 第15 页 2 2 3 荧光猝灭与温度的关系 荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和 荧光分子之间因彼此扩散和碰撞导致荧光物质焚光减弱的现象。其碰 撞猝灭过程遵循s t e r n v o l m e r 方程”“： f o f =l+ k 。t 。c q = l+ k s ，c 口 式中，f 。为未麓八猝灭镧睦