（生物化学与分子生物学专业论文）theromin基因的克隆、表达及融合蛋白活性研究.pdf

t h e r o m i n 基因的克隆、表达及融合蛋白活性研究 摘要 ( 血栓栓塞性疾病严重威胁着人类的健康，新型凝血酶直接抑制剂有望 克服传统抗凝药的应用缺陷，已成为当今心血管药物研究领域的一个热 点。t h e r o m i n 蛋白抗凝血活性高，具有较高的应用前景了苯戛表据 t h e r o m i n 蛋白的氨基酸序列，设计了重组的t h e r o m i n 基因。将重组 t h e r o m i n 基因全基因合成后克隆于p e z z l 8 表达载体上，构建成p 1 a c 及p 。 双重启动子控制下的z z - t h e r o m i n 融合表达质粒p e z z t 。转化到 e c o l i j m l 0 9 后，融合蛋白以可溶形式大部分分泌至周质间隙和培养基中。 经s d s - p a g e 检测融合蛋白呈现分子量为4 3k d 和2 2 k d 的主带。融合 蛋白经过i g g - s e p h a r o s e 分离纯化后，产量达1 2 m g l 培养基，抗凝血酶 活性为1 1 0 i u m g 融合蛋白。纯化的融合蛋白产物经过肠激酶切割， s d s p a g e 显示出现1 4 k d 的主带与天然t h e r o m i n 蛋白分子量一致。此 外，本文还对培养条件的优化进行了初步尝试，为今后进一步研究 t h e r o m i n 蛋白的结构与功能打下了基础。 关键词：t h e r o i n i n ，克彰融合蛋白v 分泌表必p e z z c l o n i n g ，e x p r e s s i o n a n df u n c t i o n a ls t u d yo f t h e r o m 矾 a b s t r a c t t h r o m b o c m b o l i f i cd i s e a s e sa r eal e a d i n gc a u s eo fd e a t ht h r o u g h o u tt h ew o r l d d i r e c tt h r o m b i n i n h i b i t o rs h o w saw i d e rt h e r a p e u t i cw i n d o wt h a ne s t a b l i s h e da n f i t h r o m b o s i sa g e n t a sah i g h l yp o t e n t a n ds e l e c t i v ei n h i b i t o ro ft h r o m b i n , t h e ：r o m i nm a yo f f e rc e r t a i na d v a n t a g e so v e rc u r r e n t l ya v a i l a b l e a g e n t s a c c o r d i n gt ot h ea m j l l oa c i ds e q u n l c eo f t h c r o m i np r o t e i n , a2 4 9 b pg e n ec o d i n gf o rt h c r o m i n w a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h eg e n ew c l o n e di np u c 5 7a n dc o n f i r m e db ys e q u o n c e i no r d e rt o e x p r e s st h e r o m i ni ne c o l ii nd i s s o l v e df o r m ，w ec h o s et h ef u s i o ne x p r e s s i o nw i t hz z - t a gi np l a s m i d p e z z l 8 m o s tf u s i o np r o d u c t sw f f f es e c r e t e di n t ot h ep e r i p l a s ma n dc u l t u r em e d i t m i a f t e ro n e - s t e p p m i f i c a t i o nb yi g g - s e p h a r o s e ，t h ef u s i o np r o t e i ns h o w e dt w om a i nb o n d so f4 3 k d a n d2 2k db y s d s - p a g e , a n d t h ey i e l do f a n t i - t h r o m b i na c t i v i t yo f f u s i o n p r o t e i n w a s1 1 0 i u m g f u s i o n p r o t 咖t h e p u r i f i e df u s i o np r o t e i nw a sc l e a v e db y e k s u b s e q u e n t l y , a n ds h o w e d t h em a i nb a n do f1 4 k d ，w h i c h w a ss a i n ea sn a t i v et h c x o m i nw ea l s os m d i c dt h eo p t u n i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o no fp e z z t j m l 0 9 t h e s ew o r k sw o u l d h e i pt od of u r t h e r i e s e a r c ha b o u tt h e r o m i n sf u n c t i o na n ds t r u c t u r e k e y w o r d s ：t h c r o m i n , p p _ z z ，f u s i o np r o t e i n ，s e c r e t o r ye x p r e s s i o n h 文献综述 血栓是由不同的临床病理情况、手术状态造成的复杂的并发症。临床病理上将其分为3 种类 型：冠状动脉疾病形成血栓，主要是指急性心肌梗死：脑血管疾病形成血栓，即脑血栓中风：末梢动 静脉疾病形成血栓即脉管栓塞。血栓栓塞性疾病已经严重威胁着人们的生存和健康。据报道，在 美国每年有3 0 0 0 0 人由于静脉栓塞而入院其中1 2 的病人因此而死亡。肺栓塞每年会造成5 0 0 0 0 到2 5 0 0 0 0 人的死亡。现有预防和治疗技术的贫乏、极大的临床治疗的需要和近期生物技术的发展 都触动人们寻找能够控制血栓形成过程中的特定靶位的新药。如今，世界上很多著名的医药公司 都在致力于新型抗凝血药物的研究。 t a b l e1 e s t a b l i s h e da n t i t h r o m b o t i c a g e n t s 目前最基本的预防和治疗血栓栓塞性疾病的方法是应用溶拴药、抗凝药、抗血小板药的抗血 栓疗法“。这三种药物都有不同的作用靶位：溶栓药促进血块的溶解；抗凝药抑制凝血酶的生 成、血纤维蛋白的形成；抗血小板药物可咀抑制血小板的凝聚。传统的抗凝药，如非组分肝素、 低分子量肝素、丙酮苄羟香豆素( 法华令) ，虽然具有一定的效果，但是它们也往往带有严重的应 用限制性。抗撮药物可望提高动静脉血栓性栓塞进行性脑卒、肺栓塞的治疗效果因此寻找有 效的抗凝抗栓新药成为当今心血管药物研究领域的主要研究方向之一。 “凝血酶的直接抑制剂” 是一较新的抗凝药的概念。它的出现克服了传统抗凝药的某些应用局限性，已成为当今抗凝药物 领域的研究热点。 1 传统抗凝药物及其应用缺陷 目前，在临床治疗中应用最广泛的抗凝血注射剂是非组分肝素( u n f r a c t i o n a t e d h e p a n n ，u f h ) 。 u f h 是一种天然高度硫酸化的酸性蛋白多糖，由氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和硫酸聚 合而成。肝素合成于肥大细胞后者沿毛细血管壁分布，所以肝素几乎存在于所有的组织器官中， 以肝、肺中含量最多。肝素可被胃酸破坏，所咀必须注射给药。肝素组分很不均一，分子量在 3 0 0 0 - 3 0 0 0 0 之间。因此，u f i 的药动学特性、抗凝血活力也园组分的不均一而呈现特异性。目前 还没有针对肝素的化学检测，必须通过生物学活性来进行临床监测。 u f h 作为抗凝抗栓药物在临床上已得到广泛应用，它在预防及治疗静脉血栓形成、治疗稳定性 心绞痛等方面等均有显著疗效，现已作为脉管栓塞和肺栓塞的常规用药。肝素的抗凝活性来自于 它可以和抗凝血酶( a n t i t h r o m b i n ) 结合并增强其活性的特性。其作用机制是：肝素首先与抗 凝血酶结合，生成肝素一抗凝血酶复合物，此复合物再与凝血酶或因子x a 结合成为三元复合 物，后者释放出肝素，形成无凝血活性的凝血酶( 或因子x a ) 一抗凝血酶复合物。释放出的 肝素可反复使用。结构研究进一步表明：凝血酶和其他凝血因子的丝氨酸活性中心被抗凝血酶 上的精氨酸活性中心抑制；肝素与抗凝血酶的赖氨酸结合位点结合后，造成了抗凝血酶上的 精氨酸活性中心的构像变化，从而提高抗凝血酶与凝血酶或因子x a 的反应速度。肝素和抗凝血 酶的高亲和力是通过一个独特的五糖结构进行调控的，这个五糖结构已经被化学合成并鉴定。 但是u e q 具有一定的应用限制性。首先，它能非特异性地结合某些血浆蛋白( 如因子v 、 血纤维蛋白原、玻璃体结合蛋白、纤维结合素) ，以及活化的血小板、内皮细胞、及巨噬细胞所释 放的蛋白。这种非特意结合造成了u f h 的生物利用度不高，增加了药物清除的复杂性，并使肝素 的半衰期呈现剂量依赖性。并且这种效应在不同的病人身上也表现不同。因为这些血浆蛋白往 往是急性发病时期显著上升的反应物不同的急性发病病人的情况各不相同，所以必须通过临床监 测来确保应用足够的肝素来达到抗凝血疗效。因此，u f h 很难在大部分急性血栓病者身上取得很好 的疗效。第二，肝素与抗凝血酶组成的复合物可以使游离的凝血酶失活，但却不能使结合在凝块 中的凝血酶失活；同样，肝素也不能使与活化的血小板结合的因子x a 失活。而因子x a 是凝血酶原 酶的组成物可将凝血酶原转化成凝血酶，从而提高与血纤维蛋白原结合的凝血酶量。园此肝素可 能导致血栓在用肝素治疗时或治疗后的继续生成。第三，u f i 能造成肝素诱导性的血小板减少症， 从而产生严重的治疗后动静脉栓塞。最后，由于肝素必须依赖于抗凝血酶作为辅助因子而发 2 挥功能，因此它对一些抗凝血酶缺乏的病人( 如弥漫性血管内凝血患者) 是无效的。 2 新型抗凝药物一凝血酶直接抑制剂 由于凝血酶在血栓形成过程中起着重要作用，所以目前针对血栓栓塞性疾病预防和治疗的许多 方法也是着眼于抑制凝血酶的生成或抑制它的活性。一些传统抗凝药，如u f h 、香豆素、阿斯匹 林即采用的这一用药方针。但是由于它们自身的生物学、药理学、药动学特性，往往限制了疗效。 凝血酶直接抑制剂如水蛭素( h i r u d m ) 不仅可以使游离的凝血酶失活，还可以抑制与血纤维蛋 白结合的凝血酶。因此它们的疗效更显著治疗范围也更广泛。 2 1 血液凝固过程及凝血酶作用机制 血液中存在着凝血和抗凝血两个对立统一的机制，在生理状态下两者保持平衡，共同维持着血 液的正常生理。发展凝血酶直接抑制剂的理论依据是：凝血酶处于凝血级联反应的最后，凝血酶 的增加在动静脉血栓形成中起着重要作用。因此抑制上述凝血酶活性，阻断纤维蛋白形成，阻止 凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小扳激活反应便可达到抗凝抗栓的目的。 1 9 6 4 年，d a b i e r a t n o f f 以及m a c f a r l a n e 分别在n a t u r e 和s c i e n c e 上发表了他们关于血液 凝固的级联瀑布理论( c l o t t i n gc a s c a d e ) 。该理论阐明了血液凝固是由一系列酶所催化的复杂 的化学连锁反应，血液凝固系统中的凝血因子以无活性的酶原状态存在。血液凝固过程中，凝血 因子经过特异的酶切割，转化成为有活性的蛋白酶。先前活化的酶又可催化下一级酶原的活化 最终结果是胶溶状态的血纤维蛋白原转变为凝胶状态的血纤维蛋白。除了这些凝血因子外，一些 其他的催化剂及蛋白，如组织因子、钙离子、磷酯、前激肽释放酶、激肽原，也参与了凝血过程。 血液凝固途径具有一系列正、负反馈环来调控活化过程，最终产生凝血酶使可溶性的血纤维 蛋白原变为不溶性的血纤维蛋白，从而形成血块。凝血酶的产生可以划分为三个阶段：内源性、 外源性途径、共同途径。其中内源性和外源性途径都可以分别产生凝血园子x a ，共同途径是凝血 因子x a 在磷脂、钙离子、因子v a 的共同作用下，将凝血酶原转化成有活性的凝血酶。 b l o o dc i o l l i n gc a s c a d ei nh u m a n s 凝血酶的活化发生在已活化的血小板表面，并需要形成一个凝血酶原醇复合物 ( 肿，山i 硼b i m 踮) 。当因子v 活化成为v a 后，结合于活化的血小板特异受体上，与凝血蘸娠、 因子形成凝血酶原酵复台物。在凝血酶礞酶复合物中，凝血尊原被因子x b 切割产生两条链； a 链和b 链。它们之阃通过一个二碱键结合，形成有活性的凝盘酶。接着，活化的壤血酶将血纤 维蛋白原切割成血纤维蛋白血纤维蛋白原是一个可溶性的二聚体蛋白当血纤维虽自服接触到 凝血酶在极短的时间内即可发生降解，并释放出血纤维蛋白肽 。当凝血酶再次切割血纤维蛋 白酶原后释放出血纤维蛋白肚b ，从而形成血纤维蛋白单体。这些单体在凝血酶切割的同时即可 快速聚集成不溶的凝胶。聚合的血纤维蛋白通过非共价键、离子键结合，并可被凝血酶活化的因 子x i a 稳定。这些不溶性的血纤维蛋白凝胶与聚集的已经活化的血小板共同形成血块，在正常的 生理状态下可以阻塞受伤的血管，防止过度失血。 凝血酶除了可以催化血纤维蛋白原成为血纤维蛋白，还在凝血过程中起了重要的调控作用。 它可以活化因子v 、及促进血小板聚集通过内源性途径活化因子，在高浓度时可活化t a f i 。 活化的因子v ，可加速促凝血酶激酶产生及凝血酶原活化，进一步形成纤维蛋白。同时，当凝 血酶与表面结合的血栓调节蛋白( t i n ) 形成复合物后，凝血酶可活化蛋白c ( p c ) ，p c a 叉可与蛋 白s ( e s ) 结合，使促凝血途径的成分失活。此外，凝血酶与t m 组成的复台物结合到内皮细胞上 后，内皮细胞可产生组织纤溶酶原激活物( t p a ) 从而启动溶血途径”。因此，对凝血酶和这些 内源性因子的相互作用的了解对设计直接的凝血酶抑制剂尤为重要。 2 2 凝血酶直接抑制剂 人一凝血酶是由轻链a ( 3 9 个氮基酸残基) 和重链b ( 2 5 9 个氨基酸残基) 组成的丝氨酸血 清蛋白酶。轻链a 和重链b 之间通过一对二硫键连接。a 一凝血酶是由含5 7 9 个氮基酸的凝血酶原 ( 因子i i ) 经因子x a 切割而成。切割发生于凝血酶原a r g ( 2 7 2 ) - t h r ( 2 7 3 ) 和k r g ( 3 2 0 ) - i l e ( 3 2 1 ) 位点上。凝血酶原切割后释放a 、b 链，并在i l e ( 3 2 1 ) 和a s p ( 5 2 4 ) 位上形成一对离子对。接着凝 血酶自身切割a r g ( 2 8 5 ) _ n l r ( 2 8 5 ) 位，释放n 末端1 3 个残基，最终形成有活性的凝血酶。凝血酶 b 链与胰蛋白酶具有同源性，但是凝血酶的反应特异性更高，它与大多数天然的血清蛋白抑制剂 不会结合。凝血酶只切割特定的a r g - x 键，对l y s 的切割效率稍低并且对a r g 或l y s 前方有 p r o 的位点表现一定的选择性。凝血酶底物结台口袋比其他胰血清蛋白酶的底物结合口袋深。一 些l o o p 结构的存在大大增加了其他蛋白进入活性中心的难度，因而形成凝血酶的反应高度特异性 l d 凝血酶具有三个结构域“”：催化结构域位于b 链，具有s e r ( 5 2 5 ) ，h i s ( 3 6 3 ) 。a s p ( 4 1 9 ) 活化位点底物识别区，它对于凝血酶起始结合底物及抑制物是必须的，并负责将底物咀正确的方 向锚定。血纤维蛋白( 原) 的识别区( e x o s i t e1 ) 靠近催化区。离子结合区是a 凝血酶与多离子化 台物( 如肝素) 结合区( e x o $ i t e 2 ) 。凝血酶与血纤维蛋白原的特异结合性很大程度上依赖于这一离子 结合区。凝血酶与底物的结合是一个两步过程：底物首先结合于凝血酶的底物结合区，将某些敏感的 a n t i t h r o m b i n h e p u i nc o 血 t o ri i p r o t e i n u en e h hi f i g2 t h r o m b i na n dh a e m o s t a s i 一b o l da r r o w ss h o wt h r o m b np r o t e o l y t i ca c t i o n a u t i c o a g u l a t o r yf u n c t i o n sa r es h o w e db yd a s h e da r r o w s 切割位点以特殊的方向呈现于凝血酶的催化结构区：这些位点被切割后，凝血酶从切割产物上脱下 再去切割下一个底物 一个凝血酶的直接抑制剂以l ：l 的比率与人的n 一凝血酶的一个或所有的结构域作用结合， 从而使凝血酶丧失结合底物的能力，抑制凝血酶的催化活力。根据来源可将凝血酶直接抑制剂分 为内源性及外源性两种类型”内源性抑制剂包括：抗凝血酶、肝素辅助因子i i 、a - 2 巨球 蛋白a 外源性抑制剂包括：水蛭素及其片段、合成的杂环衍生物( 9 aa r g a t r o b a n 、n a p s a g a m m 、 i n o g ；a w a n 、e f e g a 垃a n 、m e h 娜等) 。耳前正在进行临床实验的凝血酶直接抑制剂有：凝血酶、 b i v a l i r u d i n 、低分子量的活性位点抑制剂( 如a r g a r 扭o b a n 、e f e g a 订a n 、h _ l o g r a l m u ) 。 在生物学、药动学特性上，凝血酶直接抑制剂比肝素更具有优点。凝血酶直接抑制剂的生物 学优点表现在它能够使与血纤维蛋白结合的凝血酶失活。因为凝血酶是通过e x o s r e l 与血纤维蛋 白结合的，因此当它们形成复合物时，与凝血酶活性中心反应的试剂并不因此而受影响。水蛭素 f i s3 ( a ) s t e m ov ；脚o f m e 鼻c t i v e 嘻她d 哦o f h u r r a mq - t l , a u m b i n d a r kb l u e , h t s i i cr e a d i e s ； r e d , a c i d i c ；l 遮 i tb l 峨m c o ) s c h e m 越i cd i 嘲阻m 吕i i o w i n gr e s i d u e si n v o l v e di nt h ev a r i o u ss u b s i 捆 o f t h m m b i n 1 1 1 f h 。er e s i d t m s 棚警c 蕾i nm e 打a l 印# o x i n m mi o c 啦i o n si nt h e 暑l 瞳由r d 啪_ i e 哪鲥甜哪氓) t i 峙 d s h t - - z ds i d es h o , v s 岫d i v i s i o no f t h e 铷d 峨i n t of u n e r a lm g i o mk e y ：v a 航s i mt r i b d ：s l - s 6 , 卸础c i 坩s i m sm m o - t e n r m m lt 。c l e a v a g e ；aa r y l - b i n d i n g 鲥噜棚m y l - b n d i n 窖s i t ea n dt h es 2s i t e t 0 群t i i 盯f o r m 也e a p o l e ab 缸d 证gs i t e kf 蹦唧i 罾f o 印i d 锄蜥协；h e p 哪协b i n 凼岖妇；g ， e 帆。孽y t a t i o ns 如e ，s l s 8 ，讲l 抽6 v es p e c i f i c i t ys i l e sc a o o x y - t e r m i n a lt od 哪搿：c ，d 嵋m 刊a c 虹c r e g i o n ；l kr g ds 蜘u e r - o e ；c o m p a s s , d e f i n mo f i 靠帕捌r o 妇t ht d 崩加。哪帆 可以同时和凝血酶的苗把l 和活性位点结合因此它可以和血纤维蛋白竞争结合血ei 。而 且，与肝素不同的是，凝血醇真接抑制剂并不结合周质蛋白因此它们能产生更能预计的抗凝血 反应。从理论上来说，这种药动学方面的优点完全可以避免对凝血酶直接抻制剂进行临床监测 ， 2 3 由水蛭中分囊的抗凝鼍白 长期以来，科学家为了了解细胞活化引起的病理反应，经常用嗜血性动物来研究抗凝刺。这 些嗜血性动物依赖吸入新鲜血液得以生存，因此进化出多种抗凝机制。医用承蛭的药用价值早就 为人们所知在1 8 8 4 年j o h np m y e r a f t 便发现医用水蛭的提取物中古有抗凝血的物质。一直刊本 世纪初发现肝素之前，医用水蛭一喜是阻止血液凝固的唯物质。在翮年代，r k l m r d t 从医用 水蛭( h i r 砌om e d i c i n a l i s ) 的唾液腺中分离到一种抗凝韵质，并将之命名为水蛭素( h i r u d i n ) 。 接着，它的抗凝血机制被阐明。基于永蛭中蛋白质的抗凝血特性，世界多个制药公司及研究机构 7 正致力于开发来源于水蛭的抗凝溶栓药物，在天然蛋白质的基础上，利用生物工程手段设计新型 抗凝药，为治疗提供新思路。在水蛭中至今主要发现两类抗凝剂。第一种为蛋白酶的特殊抑制剂 通过防止血栓形成而起作用，如人凝血酶抑制剂( 水蛭素、h a e m d i n ) 、x a 因子抑制剂 ( a n t i s t a s i n ，昏h i l a n t e n ) 。第二种抗凝剂通过胞外基质产生作用，如b d e l l i n 、e l i n s 、g e l i n 、 g u a m e r i n e s 、h i r u s t a s i n 。不同的水蛭血清蛋白酶抑制物根据它们的结构可分为 a n t i s t a s i n t y p e家族及表达 a n t i - h a e m o s t a t i c p r o t e i n l a p保守基序 ( c y s x 6 1 2 一c y s - x c y s 3 - 6 一c y s x 3 6 c y s 8 一1 4 ) 的蛋白家族。序列同源性比较表明这两个家族 是由同一祖先基因扩增而来的“。 2 3 1 水蛭素 在众多抗凝血分子中，水蛭素是研究的最深入、最广泛的凝血酶直接抑制剂。一。临床应用 始于1 9 1 5 年，当时它是作为输血中的抗凝剂来使用。1 9 5 7 年，水蛭素被纯化鉴定，1 9 8 6 年被克 隆。它的基因工程产品一重组水蛭素，目前已进行了大量的临床实验。其中一种重组水蛭素商品 一l e p i r u d i n ( r e f u l d a a t m ) 已经被f d a 批准上市， 用于治疗肝素诱导型血小板减少症。 天然水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离纯化的一种多肽目前已知水蛭素有十几个类系物，差 别最大的有1 3 个氨基酸不同，主要的三个类系物各为h w l 、：- 5 2 、h w 3 。这些类系物是由6 5 6 6 个 氨基酸组成的多肽，分子量为7 0 0 0 k ! ) 。水蛭素的一级结构主要特征是有三个二硫键组成，高含量 的谷氨酰胺和天门冬酰胺以及在6 3 位酪氨酸处的硫酸酯化。水蛭素的基因工程产品已经得到大 量生产，重组水蛭素无论在物理化学性质方面，还是生物化学性质方面和天然水蛭素完全一样。但 是重组水蛭素在6 3 位酪氨酸处未硫酸酯化，降低了它与凝血酶的亲和力。水蛭素是一个很强的凝 血酶直接抑制剂，它以l ：l 的比例与凝血酶特异性结合，其结合速度快于血纤维蛋白原与凝血酶 结合速度，解离常数达到0 i - i 0 p m 。通过水蛭素与a 一凝血酶的三维结构研究表明”：水蛭素的 氨基末端区通过疏水性反应与凝血酶活性中心和e x o c i t el 结合部位相结合，氨基末端深入到活性 中心。羧基末端的最后l o 个氨基酸( 5 5 - 6 5 ) 与凝血酶的阴离子结合域结合。氨基末端区的l 一4 8 位氮基酸在水蛭素和凝血酶的反应过程中起了重要的作用，它们与活性位点相作用。其中水蛭素 p r 0 4 6 一l y s 4 7 一p r 0 4 8 区与凝血酶主要的活性中心相结合。这些结构特点使水蛭素以高亲和力与凝 血酶结合，而不与其它血清蛋白酶反应。 p i 9 4 t h e i n t e r a c t i o nb e t w i nr e c o m b i n a n th i r u d i n ( b l e e )e n dh t m m d t h r o 曲i n ( g r e e t l ) i nt h es t a r t 血r do r i e n t a t i o n t ot h el e f t 。t h eg l o b u l a ra m i n o - t e r m i n a l d i s u l p h i d ek n o t t e dg l 曲u l a rd o m a i no fh i r u d i ns i t so v e rt h ea c t i v es i t e r e n d e r i n gi t i n a c c e s s i b l et om a c r o m o l e c u l a rs u b s t r a t e s t ot h er ig i t t h ec a r b o x y - t e r m i n a la c i d i ct a i l s t r e t c h e sa l o n gt h ef i b r i n o g e n - r e c o g n i t i o ne x o s i t e ；t h i st a i li sf l e x i b l ei nt h ef r e e h i r u d i nm o l e e u l e 与其它一些抗凝药物相比，水蛭隶因为只有很小的免疫原性，所以对治疗中风腩人尤其适合。 与肝寮相比。水蛭素不蔼要抗凝血酶m 作为辅助因子也不被抗肝素蛋白灭活对血小板没有直 接的作用还能使与血块和内皮下膜结合的凝血酶失活水蛭素也不抑制其他凝血途径或溶血途 径的酶。当它1 堋来治疗中风，心脏病发作时造成出血的几宰也较低。重组水蛭素三期临床实验 中主要用于治疗急也d 肌梗塞，不稳定性心绞痛和经皮冠状动脉腔内成形术( p t c a ) 后的再栓塞。 在g u s t oi i ，水短蠢可 ；【减少2 4 小时内的死亡率和再齄塞但是对于急性心肌梗塞3 0 天后韵死 亡率的降低不明显”。与肝索相比。低捌量治疗的病人的出血几率大致相等或更低。但是，承蛭 素作为溶栓治疗的辅助治疗手段或对正在进行冠状血管成型术的病人疗效欠佳。这说明，用高剂 量的水蛭素来治疗动脉栓塞，尤其是当水蛭素与其它溶栓药一起连用时，可能不能选封安全绘药。 但当用低荆量的水蛭素来预防整形手术后静脉挂塞，效果赠比低分子量肝素好总的来说与肝 素相比，承蛭素仅在治疗翦3 天疗效置蓍，长期运用并无较好韵疗效”临床上运用木蛭素有可 能引起比肝素更为严重的出血练合症，所队必须进行用药监测。而且水蛭紊还可抑制活化蛋白c 过程，从而拇制了内濠性抗凝血途径。 2 3 2t h e r o m t n t h e r o m i n 蛋白是法田科学家从t h f n c h o b d e l l i dl e e c h ( t h o r o 螂z o nt e s s u a t 埘) 中提取的 新型凝血酶童接抑制荆”它是神从水蛭头部提取的由报同单体组成的二聚体蛋白a 每个单 9 体含有6 7 个氨基酸，1 6 个半胱氨酸残基。其氨基酸序列为 。 e c e n t e c p r a c p g e y e f d e d g c n t c v c k g c d d a q c r i s s d & n c c e s f c t c n t r c s a a d e c n p r c t c e “。t h e r o m i n 蛋白 n 端富含阴离子，c 端由于含有l 0 个半胱氨酸残基而极为松散。单体为7 2 k d ，二聚体为1 4 5 k d 。 t h e r o m i n 与已知的凝血酶抑制剂无明显的序列同源性。水蛭素n 端4 6 - 4 8 位氨基酸( p k p ) 对水蛭紊与凝血酶的结合极为重要，这一序列也存在于其他一些凝血酶抑制剂中。但t h e r o m i n 却不具有这一段序列。事实上，t h e r o m i n 与现今发现的所有动物凝血酶抑制剂无明显的序列同源 性。 与水蛭素相比，t h e r o m i n 与凝血酶结合能力更强。在相同的测定条件下，t h e r o m i n 与凝血酶 形成的复合物的解离常数为1 2 5 f m ，水蛭素凝血酶形成的复合物的解离常数为2 1 f m 。还原的 t h e r o m i n 单体蛋白具有较小的抑制凝血酶活性，这说明二聚体化是t h e r o m i n 完全结合凝血酶的 构象条件。但完全还原的分子还是具有一定的抗撮活性，因此在每个单体上都因该具有活性位点， 这也可以解释t h e r o m i n 二聚体蛋白k i 值明显低于水蛭素的现象。有可能t h e r o m i n 单体蛋白是通 过协同作用来抑制凝血酶。同时t h e r o m i n 只与凝血酶专一反应，而不抑制其他血清蛋白酶。此 外，它还可明显减少由脂多糖引起的人粒细胞及单核细胞的活化。因此，t h e r o m i n 具有极高的生 物医药应用前景。 3 基因工程重组蛋白在大肠杆菌表达的一般策略 在原核系统中表达真核蛋白，面临着许多问题，例如缺少真核系统的翻译后修饰、分泌蛋白困 难、蛋白错误折叠等o 。但是选择大肠杆菌作为表达系统仍然具有一定的优势”。大肠杆菌遗传 及分子生物学背景清楚，来源广泛，基因操作方便，筛选容易，宜于将外源基因进行优化重组- 更适于工业化大生产。许多真核蛋白虽然缺少糖基化修饰，但仍能保持一定的活力。因此对于一 些来源有限，或者化学方法较难合成的蛋白、多肽的表达尤其适合。短肽在大肠杆菌中的表达没 有通用的法则。就其表达方式而言，主要有融合表达和非融合表达，或者内含体表达和分泌表达 等方式。 3 1 非融合表达 要表达非融合蛋白，插入的真核结构基因必须具备起始密码子a t g 。若缺少a t g ，则需合成后再 接入真核基因转录起始端。将此基因插入原核启动子和s d 下游，构成杂合的核糖体结台位点则重 组d n a 在原核系统中可表达为非融合蛋白。原核翻译是从n - f m e t - t r n a 结合到3 0 5 核糖体亚基后 起始的。在翻译过程中，n 末端甲酰基及大多数蛋白的甲硫氮酸残基都会被宿主的去甲酰基酶及 氨肚酶切除。但是，也有一部分蛋白会保留n 端的甲硫氧酸。这一多余的甲硫氨酸有时会影响真 核蛋白的生物活性或免疫活性。如当重组水蛭素n 端多出一个甲硫氨酸时生物活性会大大下降 。除此之外，非融合表达时，表达产物还会受到细胞内蛋白酶的水解而使产率降低。在酵母和 大肠杆菌中非分泌表达外源基因产物由于高浓度的表达产物形成非特异性堆积，经常会造成包涵 体的形成。在包涵体中蛋白一般是无活性的。所以细菌表达体系通常需要进行体外变性、复性 操作。包涵体的溶解，经常需要用较强的蛋白变性基，如8 m 尿素或6 7 m 盐酸胍，这些试剂往往 造成蛋白质结构的不可逆修饰和改变，削弱药用蛋白的治疗用途。 3 2 分泌表达 使大肠杆菌分泌外源基因蛋白有以下几个优点：在工业发酵中，如果仅生产一种蛋白，那么 纯化手段的简化将大大增加最终产率。由于大肠杆菌一般不分泌自身蛋白细胞周质含有近1 0 0 多种蛋白，约占菌体总蛋白的4 。因此使外源基因蛋白分泌将使其成为细胞周质或培养基中的主 要蛋白。与从整个细胞抽提物中获取目的蛋白相比，分泌表达将会使下游纯化工艺简化。真核 蛋白在原核系统表达时，很多会保留n 端的f t 造成生物活性降低或产生新的免疫原性，因此 给新药评估带来困难。分泌表达时，在n 端引入信号肽后，f m e t 在信号肽切除时，可被同时除去 。，较易产生与设计完全相同的目的蛋白。分泌表达有利于目的蛋白形成正确的构像。真核蛋 白的生物活性很大程度上取决于蛋白是否正确折叠。在细胞质中，一些蛋白的自动折叠能力很弱， 例如一些含有较多二硫键的蛋白，几乎不可能在细胞质这种还原环境中自发形成正确的构像。 但周质或培养液能提供一个蛋白折叠的较佳环境。许多蛋白易受蛋白酶降解而不稳定。例如一 些小的真核蛋白，如多肽激素，由于不正确的折叠，对宿主的蛋白酶极为敏感。因为在周质中的 蛋白酶与细胞质中的蛋白酶种类不一样，而且周质和培养液中蛋白酶量也相对较少。当将其分泌 到周质或培养液中时，蛋白的稳定性可以极大的提高。目前，一些周质蛋白酶基因突变的菌株也 已分离获得。 分泌表达主要有两种策略，一种是利用大肠杆菌中原有的分泌途径来表达分泌的真核蛋白 如利用溶血素分泌途型5 ；另一种策略就是利用信号肽、融合肽、营养条件及其它试剂造成细 胞膜的渗漏从而使目的蛋白进入周质或培养液，如利用细菌外膜蛋白o m p f 、外膜蛋白a 等均能 有效地将某些真核蛋白进行分泌表达。 s 3 融合表达 融合表达是将一段融合肽段通过基因工程手段加入目的蛋白的n 端或c 端进行表达。在实验 室规模中应用大肠杆菌中进行融合表达有许多优越之处。首先，由于选择的融台肽的生物特性， 利用其配体配基之间的特异作用，为蛋白的分离纯化提供了有效的手段。传统的蛋白纯化工艺由 许多操作单元组成。每一步骤都必须根据目的蛋白的带电性、溶解度、分子大小、疏水性等特异 性质来设计每一个操作单元都必须根据特殊条件来进行优化。而利用蛋白融合技术，一些起始 浓度很低的融合蛋白往往经过一步分离纯化就可达到较高的浓度。因此大大降低了工作强度，提 高工作效率。目前较为纯熟的融合肽有这样几类：完整的酶，其亲和配基是固定化的底物或抑 制物，如b 半乳糖苷酶。，g s t ”；能与i g g 或血清蛋白结合的肚段，如s p a ，s p g 。；可 与多糖类物质结合的蛋白或多肽，如m b p ：具有生物素结合位点的多肽。当它在体内被生物素化 后，可与亲和素或链霉素结合： 可与固定化的单克隆抗体结合的抗原表位；带电性的 氨基酸残基，在纯化过程中可通过电性结合纯化载体，如p o l y ( a r g ) ；多聚组氨酸，可用固 定化的金属亲和层析柱纯化。； 其他一些多聚氨基酸，根据侧链氨基酸性质分离纯化如 p o l y ( p h e ) ” 第二，融合肽可以增加目的蛋白的稳定性。一些较小的真核蛋白由于非正确折叠等原因， 对宿主蛋白酶系统尤为敏感。这不仅极大降低了产率，并且将完整蛋白从它的部分降解产物中分 离也教为困难。周质或胞外相对氧化的环境为蛋白正确折叠提供了一个良好的条件”。但是由 于大肠杆菌中天然的分泌机制很少，所以不少的目的蛋白的核酸序列之前要加上信号肽序列共同 进行表达，往往产率较低另一种增加蛋白稳定性的方法是采用双重融合肽连接于目的蛋白的n 端和c 端。b h a m m a r b e r g 运用双融台体系表达重组的人胰岛素样生长因子，在n 端加上与i g g 结合结构域( s p a ) ，c 端连上与血清蛋白结合结构域( s p g ) 。结果这种双融合体系能有效地保护目 的蛋白免受宿主蛋白酶系统的降解。最近，这种双重融合肽还被成功地用于表达人的胰岛素原， 小鼠二硫键异构酶的结构域，人t 细胞受体的片断等。 2 f u s i o np a r t n e r l i g a n d p r o t e i n - p r o t e i ni n t o c i l c a l o l l $ p r 口幛h a i g g s y n l h e l i cp r o t e i na n a k ) g u q 3i g g p r o t e i nga i b u r a i n e n z y m h u b s t r a t e r n t e r a c f i o n $ b g a l a c t o s i d a s e a p t g g l u t a t h i o n es - b a n s f e r a s e a u t a t h i o n e c h l o r a m p h e n i c o la c y lb a n s f e r a s e c h i o r a m p h e n i c o l c - t e r m i n a ia r g i n i n e a n h y d r o t r y p s i n 嘣h d 呐蛳i n t m t e t i o n r e c aa n - r e c a f l a gp e d 6 d e a n l j - f l a gp e 叫d e 8 g a l a c t o s i d a s e a n u p , g a | a c t j o s i d a s e n 晴y 帅呐a d d s v g i n i n e i o ne x c h a n g e r a s ；d 硼ca c i d i o ne x c h a n g e r h i s l i c l i n e i m a c p h e n y l a l a n i n e h i c c y s b i n e c o v a l e n t c h r o m a t o g r a p h y 咖p h a n t w o - p h a s es y s t e m 钿由哺蝴嘣州n 咖口p r o 埘n s m a l t o s e - b i n d i n gp 嘲b i n m 蜘 $ t a c h - b i n d i n gd o m a i n s t a r c h c e l l u l q s e - b i n d i n gd o m a i n c e l l u l o s e g a l a c t o s e - b i n g d i n o d o m a i n g a l a c 自o s e c 枷1 0 m 纳硼喇ng i 惦部l o i 哺s 蕾明r 驰 c y c l o d e x t r i n o 啦i m e m c f l m $ b i o d n j o i n d i n gd o m a i n b i o t i n l a c 帕哪b 渤rl a co 玳a t o r t a b l e2 t h em o s tc o m m o n l yu s e df u s i o np m t = i ns y s u m “ 第三融合蛋白的表达方式可以提高目的蛋白的溶解度。在胞内大量表达的异源蛋白往往会 形成包涵体。虽然包涵体可防止蛋白降解但是由于包涵体中的蛋白大多是非正确折叠的，因此 没有生物活性。为了要获得活性蛋白需要进行蛋白变性、溶解、复性等复杂过程。由于变性条 件剧烈，会造成蛋白降解、失话、或个别基团的修饰。并且蛋白质的复性需要在很稀的溶液中进 行以避免重新堆积a 复性时常常使用低于2 0 u g m l 的蛋白浓度。某些蛋白需要更低的复性浓度 如h l l - 2 需要l u m l 的复性浓度。此外，提取包涵体过程中的某些操作还会对后续步骤产生影响。 如s d s 萃取包涵体时，由于s d s 与蛋白共价结合，改变蛋白的带电性、疏水性。从而改变了蛋白 质分子在离交、疏水、反相色谱上的保留行为。这些都导致了此法操作复杂、成本高、产量低、 较难适用于工业化大生产。 是否将融合蛋白中的融合肽切除取决于目的蛋白的最终用途。对于实验室规模的研究来说， 研究目的是确定目的蛋白的性质，在确证融合肚的存在不会影响目的蛋白的性质时，可以保存。 但是如果融合肤的存在对目的蛋白有影响，那么为了获得可靠的实验结果，融合肽必须被除去。 尤其是药用蛋白必须对融合蛋白进行精确有效的切割。而融合肽的切除往往是融合表达技术的 瓶颈“。目前主要有化学切割和酶切割两种方式“。化学切割经常用于将较小的蛋白或多 肤从较大融合肽上切除。化学切割效率较高，但经常产生非特意性的切割现象。对某些蛋白来说， 反应条件太剧烈，造成产物的失活。化学