（光学工程专业论文）悬浮式生物芯片检测系统中光学系统的研究.pdf

浙江大学硕十学位论文 6 8 9 2 9 6 摘要 生物芯片技术是将大量的生物反应信息以及许多不连续的分析过程集成在 一个芯片上， 从而实现对生物大分子的准确、 快速和大信息量的检测和分析， 能 在很短的时间内完成上万次的生物化学反应检测， 具有高通量、 高集成度、 并行 分析、微型化的优点。 从探索新的检测方式到发展出新型的生物芯片， 人们在不断的改进发展生物 芯片技术。发展出了 微阵列式生物芯片以及悬浮式生物芯片。 悬浮式芯片的独特设计使得它拥有常规的检测方法所不具备的特点， 本课题 在现有的悬浮式生物芯片技术的基础上提出了一种全新的检测技术方案: 采用独 特的液流装置使微球体并行流过二维的检测区域;采用脉冲氨灯瞬时曝光照明， 配合c c d 连续进行凝结成像， 以获取荧光信息图像。 系统可以实现不间断的大通 量并行检测，大大的提高检测速度。 本论文的内容:首先，对悬浮式生物芯片检测系统的总体结构和工作流程进 行初步分析， 总结各组分单元的技术研究要点 然后， 对检测系统中的光学系统 部分进行细致的研究分析， 将其分为照明系统、 荧光收集成像系统、滤色系统三 个部分， 针对光学性能提出要求， 为光学系统的具体设计实施给出理论基础， 并 根据理论分析对检测系统进行设计; 文章着重针对照明系统进行分析， 为了更有 效的 进行照明系统的设计， 在计算机中建立模型， 再计算机模拟的辅助下， 提出 并改进设计方案， 并付诸实施。 文章最后给出整个系统的实施检测结果， 在对这 些结果进行分析的基础上，评价现有方案，提出改进意见。 关键词:悬浮式生物芯片，氛灯，并行液流通道，并行检测，c c d凝结成像， 照明系统，计算机模拟 浙江大学硕士学位论文 ab s t r a c t b i o c h i p t e c h n o lo g y in t e g r a t e s l a r g e n u m b e r s o f b i o - r e a c t i o n i n f o r m a t i o n a n d m a n y d i s c o n t i n u o u s a n a l y s is p r o c e s s e s o n a c h i p , t o r e a l i z e a c c u r a t e , q u i c k d e t e c t i o n a n d a n a l y s i s w i t h l a r g e i n f o r m a t io n , a n d t o c o m p l e t e t e n t h o u s a n d s o f b i o c h e m i s tr y r e a c t i o n i n a v e r y s h o r t t i m e , h a v i n g t h e a d v a n t a g e o f h ig h fl u x , h i g h d e g r e e o f i n t e g r a t i o n , p a r a l l e l a n a l y s i s a n d m i c r o m a t i o n . f r o m t h e d i s c o v e r y o f n e w d e t e c t i o n m e t h o d t o t h e d e v e l o p m e n t o f n e w b i o c h i p , p e o p l e k e e p i m p r o v in g a n d d e v e l o p i n g b i o c h i p t e c h n o l o g y , h a v i n g a c h i e v e d m i c r o a r r a y a n d s u s p e n d i n g a r r a y . t h e s p e c i a l d e s i g n o f s u s p e n d in g a r r a y h a s u n i q u e c h a r a c t e r i s t ic t h a t r o u t i n e d e t e c t i o n m e t h o d d o e s n o t h a v e . t h i s p r o j e c t p r o p o s e s a b r a n d - n e w w a y o f d e t e c t i o n t e c hn o l o g y o n t h e b a s i s o f p r e s e n t s u s p e n d i n g a r r a y t e c h n o l o g y ; a d o p t s a s p e c i a l fl o w d e v i c e t o m a k e m i c r o s p h e r e fl o w p a r a l l e l a c r o s s p l a n a r d e t e c t i o n a r e a ; a d o p t s i n s t a n t a n e o u s e x p o s a l i l l u m i n a t i o n o f x e n o n fl a s h l a m p , c o o p e r a t i n g w it h t h e c c d t o f r e e z i n g c a t c h a s e r ie s o f i m a g e s , t o g e t i m a g e s o f fl u o r e s c e n c e i n f o r m a t i o n . t h i s s y s t e m c a n r e a l i z e c o n t i n u o u s p a r a l l e l d e t e c t i o n o f l a r g e a m o u n t o f fl u x , w h i c h g r e a t l y i m p r o v e d t h e s p e e d o f d e t e c t io n c o n t e n t o f t h i s p a p e r : f i r s t o f a l l , e le m e n t a r i l y a n a ly z e t h e g e n e r a l s t r i c t u r e a n d w o r k p r o c e s s o f s u s p e n d i n g a r r a y d e t e c t i o n s y s t e m , a n d s u m m a r i z e t e c h n i c a l r e s e a r c h p o i n t s f o r e a c h u n i t ; t h e n s t u d y a n d a n a l y s i s t h e o p t i c a l s y s t e m in t h e d e t e c t i n g s y s t e m , w h i c h i s d i v i d e d i n t o t h r e e p a r t s o f i l l u m in a t i o n s y s t e m , fl u o r e s c e n c e c o l l e c t i o n a n d i m a g i n g s y s t e m , a n d f il t e r i n g s y s t e m , a m o n g w h i c h p r o p o s e s re q u i r e m e n t s f o r o p t i c a l f u n c t i o n s , g i v e s t h e o r e t i c b a s i s t o c o n c r e t e d e s i g n a n d i m p l e m e n t o f o p t i c a l s y s t e m , a n d d e s i g n s t h e d e t e c t in g s y s t e m a c c o r d i n g t o t h e a c a d e m i c a n a l y s i s ; th i s p a p e r e m p h a s i z e s o n t h e a n a l y s i s o f i ll u m i n a t i o n s y s t e m , i n o r d e r t o p r o c e s s e f f e c t i v e l y t h e d e s i g n o f i l l u m i n a t i o n s y s t e m , m o d e l s a r e e s t a b l i s h e d i n t h e c o m p u t e r , u n d e r t h e a i d o f c o m p u t e r s i m u l a t i o n , t o p r o p o s e a n d i m p r o v e d e s i g n p r o j e c t , t h e n t o i m p l e me n t . t h e e n d o f t h i s p a p e r g i v e s t h e i m p l e m e n t i n g d e t e c t i o n r e s u lt o f t h e w h o l e s y s t e m, o n 浙江大学硕_ 万 学位论文 t h e b a s i s o f r e s u lt a n a l y s i s , e v a lu a t i n g p r e s e n t p ro j e c t a n d p r o p o s i n g i m p r o v e m e n t s u g g e s t i o n s . k e y w o r d s : s u s p e n d i n g a r r a y , x e n o n fl a s h l a m p , p a r a l l e l f l o w c h a n n e l s , p a r a l l e l d e t e c t i o n , f r e e z i n g i m a g e w i t h t h e c c d , i l l u m i n a t i o n s y s t e m , c o m p u t e r s i m u l a t i o n 浙汀大学h i ll 卜 学位论文 第一章 绪论 刚刚进入二千一世纪， 人类基因组计划就已初步完成，蛋白 质组计划己 经启 动， 基因序列数据及蛋白序列数据 f .在以前所未有的速度增长。 为研究如此众多 的基因和蛋白 质在生命过程中所担负的功能， 产生了生物芯片技术， 它 是信息技 术与生物技术相结合的产物，是生命科学研究中的一次革命性技术突破。 生物芯片技术是将大量的生物信i ll 以及许多不连续的分析过程集成在一个 芯 片 上， 从 而来 现 对d n a , 蛋白 质、 细 胞以 及 其 他生 物 组分的 准 确、 快 速 和 大 信息量的检a ll 和分析， 能在很短的时间内完成上万次的生物化学反应， 具有高 通 11 - 、 高集成度、 并行分析、 微型化的优点。 正是生物芯片的这些突出 优点， 世界 各国的众多科研和科技工作者都致力于生物芯片相关工艺、 设备、 检测技术及处 理软件的研究与开发。 夸 1 . 1 论文背景 生物芯片具有高通量、高集成度、 并行分析、 微型化等突出的优点，大大促 进了生命科学的发展， 并且作为一 种快速的检测手段， 将传统的许多复杂、 不精 确的医学检测变成简单、 可靠的常规检测， 使传统的疾病诊断发生革命性的变化。 从探索新的检测方式到发展出新型的生物芯片， 人们在不断的改进发展生物芯片 技术。 生物芯片的信息检测是整个生物芯片技术中不可或缺的环节， 也是生物芯 片技术改进发展的关键， 因 此， 大量的关于生物芯片技术的研究是为了 改进生物 芯片信息检测系统， 提高检测速度、 灵敏度、 准确度以及扩展适用性等。目前绝 大多数生物芯片采用荧光物质作为示踪标记物， 因此本文所讨论的生物芯片检测 分析系统均为采用荧光标记物。 9 1 . 1 。 1 生物芯片的 种类及相应分析仪的 典型结构 生物芯片是利用微加工技术并结合有关的化学合成技术， 将各种大量的探针 分子固定于载体 ( 如玻片、 硅片、聚丙烯酞胺凝胶、 尼龙膜或聚苯乙烯等载体) 上制得的微型反应器件; 芯片上探针分子的种类、 数量及分布皆是确定的，在生 物化 学实 验或 检测中 可以 与 待 测未知 样品中 的日 标分子 发生 杂交反 应川 ; 反 应过 后， 目标分子将与对应种类的探针分子相结合而滞留于生物芯片上; 所有的样品 第一章绪论 刚刚进入二卜一世耋己，人类基因组计划就已初步完成，蛋白质组计划已经启 动，基斛序歹l 数撼及蛋黩序列数援，e 在以翦所未有熬速蹙增长。为研究如照众多 的基因和蛋白质在生命过程中所担负的功能，产生了生物：卷片技术，它怒信息技 零与生物技术穗结台豹产甥，是生命褥学褥究串瓣次革命注较，术突酸。 生物：苞= 片技术是将大量的生物信息以及许多不连续的分析过程集成在一个 芯片上，扶丽寒魏对d n a 、蛋岛质、缀脆良及其他生物缱分的准确、快速和大 信息量的检测和分析，能在很短的时间内完成上力次的生物化学反应，具有高通 澄、高浆成度、并行分拆、微型化的优点。f 是生物芯片的这些突出优正( ，世界 各国豹众多科研粒科技工作者郡致力于生物芯片穗关工艺、设备、捡测搜术及处 理软件的研究与丌发。 l 。l 论文背景 生物芯片具有高通爨、高集成度、并行分析、微型化等突出的优点，大大促 进了生命科学的发展，并且作为种快速的检测手段，将传统的许多复杂、不精 确的医学检测变成麓单、可靠的常规检测，使传统沟疾癍渗龋发生革命性黢变化。 从探索新的检测方式到发展出新型的生物芯片，人们在不断的改进发展生物：卷片 技术a 垒三貔芯冀酾信愚捻溅是整令璺三壤芯片技术中不可或姣靛环节，- 篷是生秘芯 片技术改进发展的关键，阁此，大量的关于生物芯片技术的研究怒为了改进生物 芯片信患硷瓣系统，遥蔫捡溺速度，灵敏浚、准确度以及扩震适掰性等。醋前绝 大多数生物芯片采用荧光物质作为示踪标遗物，因此本文所讨论的生物芯片检测 分析系统均为采糟荧光标记物。 l 。1 1 生物芯片的稳类及提应分析仪的典型结构 生物芯片是利用微加工技术并结合有关的化学台成技术，将各种大量的探针 分子露定于载体 l 、e j o w e h 。卧 3 。本系统鼹选用的为球 本尺寸爽5 微米左右，c c d 像素尺 寸为9 9 微米，m 。取4 ，则放大率为7 倍。 3 2 。3 景深 当荧光收集成像系统调焦于基准物平蕊上对液流场中的微球体进行成像以 获敬荧光信息时，如果位子蒸准物平面附近的其他平面上的微球体荧光信息同样 能够被有效获取的话，则这魑平嚣榴互之闯距离的爨大值即为荧光收集戒像系统 的景深。在系统成像条件定的情况下，景深随数值孔径的增大而减小。因此， 浙 江大学硕 1 : 学位论文 由式35 可以看出，要提高显微镜的分辨率，只有两个途径:一是增大物镜 的数值孔径n a ;二是减小光波长x a 在本课题中，采用的是 c c d进行图像探测，受图像采集分辨率的影响，过 低的光学分辨率并不会给图 像质量带来更多的提高， 当检测区域上两点分别成像 于c c d两个相邻的像素上时， 从图像中将无法分辨出该两点，因此系统只需要 能够将对应像点的距离大于一个像素尺寸的两点分辨出来， 即光学分辨率最低达 到c c d 像 素 尺 寸除以 系统 成 像 放 大 倍率 ， 在 本 课 题 研究中 为1 .2 8 6 1d m即 可 。 在 研究实验中 采用的透镜数值孔径较大， 光学分辨率实际上达到0 .9 7 1 m a 3 .2 .2 放大率 在荧光收集成像系统中， 液流通道上的 检测区将被放大成像于c c d像敏面。 其放大率由 微球体尺寸端， 、 c c d像素尺寸d e c d 及图像采集分辨率这三项数据来 材_ d , 3 。 本系统所选用的为球体尺寸为5 微米左右， c c d 像素尺 一寸 为9 x 9 微米， m c c n 取4 ， 则放大率为7 倍。 互 3 . 2 . 3 景深 当荧光收集成像系统调焦于基准物平面上对液流场中的微球体进行成像以 获取荧光信息时， 如果位于基准物平面附近的其他平面上的微球体荧光信息同样 能够被有效获取的话， 则这些平面相互之间距离的最大值即为荧光收集成像系统 的景深。在系统成像条件一定的情况下，景深随数值孔径的增大而减小。因此， 浙江人学硕 学位论文 / 片份 图3 . 8景深形成示意图 在景深要求较大的系统中， 数值孔径将受到限制而不是任意增大的。 同样景深也 将受到数值孔径要求的限制而不能任意增大。 图3 . 8 ， 为景深要求形成的示意图， 0 为荧光收集成像系统孔径角， a 为基准 物平面上点扩散斑的直径，h 为景深。 数值孔径的定义式为 n a = n - s i n o式 3 . 7 当系统对准基准物平面进行成像时， 若枪测区域的纵向尺寸即景深为h ， 则 检测区域的纵向边缘上的点在基准物平面上的衍射斑尺寸为 a , = a 2 一 2 . h :二 (a rc sin ( n a -) 式 3 . 8 由式3 . 8 得到h 与n a之间以a 为参数有关系式 。 一 。 / ta n (a rc sin ( n a )式 3 . 9 由 此得到h 与n a之间在不同的a 值下的关系曲线如图3 .9 0 浙江人学硕 卜 学位论义 h 与n a 对应关系曲线 ( a 单位为微米) 3 2 0 2 8 0 2 4 0 一 h ( a = 1 ) h ( a = 5 ) h (a = 15 ) h ( a = 2 5 ) h ( a = 3 5 ) 八目八曰六曰 n乃09户 兴担川线呱 n曰八川门 n月理 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 数值孔径n a 图3 .9 h 与n a之间在不同的a 值下 的关系曲线 从曲 线图中可以 看出， h 与n a成反比， 与a 成正比。 要确定h 和n a的取 值， 需 要 先要确定a s 微球体在基准物平面上的扩散斑直径d为微球体直径 a与点扩散斑直径 a 之和。 为保证景深范围边缘的微球体能够被探测， 微球体扩散斑的光强度工 应该 不低于系统的探测底限f lo w ，这将影响到系统的动态范围。理想的系统动态范围 底限i f. 、 应对 应于, lo w ，上 限i h ig h 应对应于 系统的 探测上限, h ig h ， 而由 于 系统景深 造成的扩散斑的影响， i ts , “ f to w ( d 2 / d 2 ) cxe 式 3 . 1 0 式中e 为检测区域的激发光照明强度， c 为与荧光物质荧光激发效率相关的 一项参数。可以 看到， 微球体扩散斑直径对系统探测动态范围 底限的影响很大。 在保证系统具有一定的探测动态范围的前提下先确定a 的最大可能取值， 由 此就可以进一步得到n a 与h 之间的数值关系。 浙江大学硕士学位论文 若微球体中的一部分有可能贴近液流通道的上下表面流过检测区域， 则系统 的景深至少需要达到通道厚度h 。 为保证在垂直于检测区域面的方向上 不发生微 球体叠盖现象， 液流通道的厚度至少小于检测液中微球体的平均间距， 但 h 不能 任意小， 因为如果液流通道过薄， 将导致液流场流通不畅等液流场问题， 因 此系 统需要保证一定的景深 h ，不能够任意小。在 h有一定要求的情况下，n a与 a 的关系式为 n a 二 n -sin (a rcta n (是 ， 式3 . 1 1 本系统中根据适当的悬浮液浓度选择液流通道的厚度约为5 0 微米，在无法 确定微球体是否一定或不会贴近液流通道边缘通过检测区域的情况下， 就要求景 深应大于5 0 微米，n a于a 之间的对应关系曲线如图3 . 1 0 . n a 与a 关系曲线 ( h 单位为微米) 1 . 2 r- 一 一 产 一一 - 一- ，- 一 - 一 一- 一 一- 一一一- 一 08 0 . 6 0 4 一 n a ( h = 5 0 ) 一 v a ( h = 6 0 ) n a ( h = 7 0 ) 一 、 琳 ( h = 8 0 ) 一 n a ( h = 9 0 ) 1 v之卑本测纂 0 . 2 0 1 0 2 05 0 6 0 点衍射斑直径a( 微米) 图3 . 1 0 n a与a 之间的 对应关系曲 线 为了能够确定数值孔径的最大可能取值， 应在h 的取值范围内取h 的最小可 能取值5 0 微米，可以看到n a随a 的增大而增大，确定a 的最大可能取值后， 即可得到数值孔径的最大可能取值。 本课题研究中， 对景深最基本的要求为5 0 1 i m ,由 图3 . 功种可以 看到，若点 浙江人学硕 打 学位论义 衍射斑直径要求很小， 则系统的数值孔径将非常小， 这不利于系统其他光学性能 的 提高; 在实验中， 透镜的数值孔径为0 .3 4 7 3 1 6 5 ， 在景深为5 0 u m时， 其点扩 散斑直径将达到 1 3 . 5 w m , 这将大大的影响系统探测动态范围底限。 在实验中， 需要进一步改进液流装置技术， 使景深要求更低， 并且系统探测动态范围的变动 容限也需要进一步确定。 3 . 2 . 4 数值孔径 数值孔径是荧光收集成像系统一个重要指标， 除了会直接影响到系统的光学 分辨率及景深外，还决定着荧光收集效率，对检测灵敏度有很大的影响。 荧光物质受激后向各个方向发射荧光， 而系统只能在检测区域的一侧收集某 个立体角内的荧光信号， 其荧光收集效率与数值孔径之间有如下关系: 77 = s i n a a r c s in ( n a l n ) 1 2 式3 . 1 2 其中 ， q 为 荧 光 收 集效 率、 n a为 数 值 孔径 、 n 为 周围 介质 折 射率。 由 图3 . 1 1 可见， 增大数值孔径可以有效的提高荧光收集效率。 因此， 为更多的收集原本就 相对微弱的荧光，增强荧光信号强度， 应尽量的增大数值孔径。 收集效率对数值孔径曲线 卜卜!:卜we 一一卜口 nun八八匕4cnu 0乙1111111飞1 渗冲 只行h迁注门乙 口并撼咪孚 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 数值孔径n a 们 门 图3 . 1 1 荧光收集效率与 数值孔径之间关系 数值孔径的增大可以提高系统的光学分辨率， 但也会导致系统检测景深的减 小， 而且会增大透镜的设计难度。 此外， 数值孔径大的透镜工作距离短， 会增加 机械安置上的问题，同时，根据章节3 . 1 .3中所述，数值孔径限制了照明光线的 浙江大学硕! 一 学位论文 位置角度， 增大数值孔径就会导致斜入射角度的增大， 照明系统可利用空间的减 小， 这使得照明系统的设计难度增大。 综上所述， 系统数值孔径的选择必须结合 实际综合考虑。本课题研究实验中透镜数值孔径设计为0 .3 4 7 3 1 6 5 ，对应的荧光 收集率为1 .7 3 5 %，这些参数需要在实验中进一步进行优化。 夸 3 . 2 . 5 荧光收集成像系统光路特点 在荧光收集成像系统中需要将液流通道上的检测区域按照一定的放大率成 像于c c d像敏面。实现该功能的最简单光学系统是采用一个透镜组将检测区域 直接成像于c c d像敏面。但是，这种光学系统存在一个间题，即从检测区域收 集的荧光信号中， 包含多种波段的荧光信息及非荧光信号波段的背景光， 因此在 使用c c d进行探测之前，需要进行分色及滤色，这个要求多使用干涉器件来实 现， 而干涉器件的通光谱线特性与光束入射角度有密切关联， 通光角度相差越小， 滤色器件的性能就越好。 令检测区域对角距离为a ，系统成像放大率为m，数值孔径为n a ，像面与 透 镜 组出 瞳 的 距离 为1, ， 则 在 应系 统 滤 色 要 求 对 滤 色 或分 色 器 件 进 行设 计时， 需 要满足的角度差异要求士。( 如图3 . 1 2 所示) a r c s i n 困a i m) m 平 a 出瞳 图3 . 1 2 透镜组成像示意图 a=a r c t a n ( ，, n a,、 ， a 竺 x ta n ta rc sin t m 竺 兰 x 2 式 3 . 1 3 显然，与a 成正比，与n a 成正比，与1 。 成反比;图3 . 1 3 为 a与m 之间在 a 为1 . 1 8 7 m m , n a 为0 . 3 4 7 3 1 6 5 , 1 , 为1 6 5 二条 件下的 对应 关系曲 线。 浙江人 学硕 卜 学位论文 。 与m 对应关系曲 线 汽5 djqn八乙1 巡已 5 1 0 放大倍率m 可以看到，a存在极小值。将该式对m 求导，可以得到，当m 满足式3 . 1 4 时，。有极小值: 一na 一 (arc sin (等 )一 (令 )m 2 式 3 . 1 4 在现有的实验条件设定下， m为7 ， 放大率的确定，如章节3 .2 .2 中所讨论 的， 是由微球体尺寸、 c c d像素尺寸及图像采集分辨率这三项数据来加确定的， 因此并不能保证满足极值条件。此时滤色器件需要满足的角度差异要求为士 4 . 5 4 8 为了能够更好地对荧光信号分色及滤色， 使更多的荧光信息被c c d探测到 的同时， 滤掉更多背景光， 应尽量降低滤色光路中光束的角度差异。 为此， 可以 采用下述的一种收集成像光路 12 1 该光路中包含前后两个透镜组， 前一个透镜组为荧光收集镜组， 后一个为成 像镜组。 检测区域置于荧光收集镜组的前焦面上， 荧光信号被收集后转换为平行 光， 此平行光再由成像镜组成像至c c d像敏面。在光路的平行光束上加分色及 滤色器件，这里的光束角度差异如图3 . 1 4 图3 . 1 4物在物方焦面成像示意图 浙江大学硕一 ! 学位论文 , a 1 2 , “ = a rc ieu l l 下一 少 式3 . 1 5 在 a 为 1 1 8 7 m m的条件下 。与f 的关系如图3 . 1 5 f 与a 对应曲线 卜卜 垂 3 一斗 一 _ 焦距f( m m ) 图3 . 1 5。 与f 的关系曲线 从图中可以看到，角度差异随焦距的增大而减小，当焦距为 8 n m时，其角 度差异就已 经比采用一个透镜组直接将检测区域成像的光路中小。由式 3 . 1 3和 式3 . 1 5 可得，当f 满足式3 . 1 6 时，第二种光路的角度差异比第一种小，由于在 数值孔径要求并不是非常大的情况下， 焦距较大的镜组反而更容易设计， 所以第 二种光路并不难实现。 f l , 二 an(arcsin(黑 )+ m . - a x - z 式 3 . 1 6 但是，第一种收集成像光路只需要一个透镜组;而第二种收集成像光路中， 除了一个荧光收集镜组外， 对每一种荧光信息均还需要一个成像镜组， 这使得系 统的成本增高。 综上所述， 需要结合实际情况对两种光路进行选择。 本课题研究中考虑到简 化实验装置，降低透镜设计加工工作量而选择采用第一种方案。 此外， 由于要在收集成像系统中 加入分色及滤色器件， 荧光收集光学系统的 设计需要能够保证足够的工作距离。 浙江人学坝卜学位论文 3 3 滤色系统 滤色蓉统是悬浮式生甥芯片捡测系统中 零耋要翡令部分，它壹接竣定7 系统检测信号的信噪比及掇取荧光信息的能力，其中主要包括激发光滤色片和发 鸯雩光滤色琦，在多波段荧光信患溺时滋发检测系统中还包括二色铙。在本章节中 将针对采用氙灯作激发光源的检测系统，对滤色系统的性能要求进行分析。 检测系统采集图像时的背景光的强度大小直接决定了系统采集信号的信嗓 比，其主要来源是荧光收集成像系统商接从检测区域中收集的和光学器件上反射 及散射的激发光，由于受微球体上茨光物质浓度以及荧光激发效率的限制，悬浮 式蕊i 物芯片捡测系统中激发光光强度往往比信号荧光强度麓出5 6 个数量级，即 便是检测区域上的散射或反射光与信号荧光一同被光敏器件探测，也会导致信噪 毙浆显著辫低，甚至会完全淫没荧光信号。为褥到麓蒺量辫荧光信惫，藏少薄景 光，就需要在系统中加入滤色器件。滤色器件按照其在系统中所安_ ! = 薹! 的位置与功 能静不同可以分为：激发光滤色肖、发辩党滤色行及二色筏；按照箕透光光谱特 性曲线的不同可以分为：长波通( 如图3 1 6 a ) 、段波通( 如图31 6 b ) 以及带通 ( 如图3 1 6 c ) 。 翡陛 篓卜脚 耋嚣蕤 j 。s 蛐5 n5 辅5 4 0 融惮 # n # 出女皿e 雹 l ! l 置零国 图3 1 6 滤色片透光光谱特性曲线 激发光滤色片安置在照明系统中，萁主爱的功能是从激发光源发射的激发光 中将用于激发荧光物质蛉光谱波段握取出来，同时必需要将激发光中包含蛉荧光 信号光谱滤除，如图3 1 7 中所示，在5 4 0 5 6 0 n m 之间应该有很高的截止深度； 发瓣光滤色跨安嚣在荧光牧集成缘系统中，蒺主要功麓是然系统收集到懿捡巍l 区 域上的光线中将荧光信号提取出来，同时需耍阻挡任何在荧光信号光谱范围外的 光线被c c d 搽溺，茏其在激发觉滤色片静嵩透过率光谱范麓上翔图3 ，1 7 中所示， 在4 6 0 。5 4 0 n m 之间，要求有很高的截止深度。激发光滤色片与发射光滤色片需 要榴互江配使用，在激发并提取荧光信息的同时降低混入荧光中的背景光强度， e f；。r；毒；k辨 婚祷种如辨0 ， 誊lh 浙江火学砸i j 学位论文 其基本要求还有：激发光滤色片的透过光谱波段与发射光滤色片的透过光谱液段 不可以有交叠；若在荧光收爨成像系统中使髑的是干涉滤色片，由于干涉滤色片 的光谱特性街j 线在远离工作光谱范围的波段内会有一定的起伏，截止深度会有所 降低，即倭楚在工馋光谱范曩爨近汝截止蝗线的截止深度王并j 是理想筑纛限 深，为减少荧光信号中混入的杂散光，以进一步降低背景光强度，与之相匹配使 蠲黪激发光滤色冀应尽可麓豹滤涂必要静荧光激发光谱之努豹疑有毙港先线。 鹜3 1 7 滤畿片透嵬矗蠡线示意鹭 为了从激发光中得到更多的用以激发荧光物质的能量，激发光滤色片的商透 过率嚣蠛，敷该尽量将荧竞彩痿吸收蜂僮光谱包括在内，并豆增大逶光荣宽；由 于，荧光物质的高吸收率光谱范围有限，以罗丹明荧光物质为例，如图3 1 8 中 蓝色曲线所示，所以一味地增大滤色片通光带宽，不仅不能有效增加荧光物质吸 收的能量，反藤会增加发射光滤色片的高截止潦度区域的宽发，嗣时姆增加滤色 片镀膜结构设计的难度，也将增加系统检测的背景光强度。要确定激发光滤色片 的逶毙蒂宽，应将光源发光光谱强凌夔线圈荧光物缓党谱吸 | 殳效率夔线结台起 来，网3 。1 9 所示为将波长相对应的激发光光谱强度数据与荧光物质光谱吸收效 率数溅穗乘爱褥蜀静，盘圈3 + 1 9 中可以看到，在4 8 0 h m 戮下，荧光物质可嗷浚 浙江人学倾l 学位论文 到的光谱畿量已缆很低，没有利用的意义，由此，可以确定激发光滤色片遗光区 域光谱范围的最小馑应该在4 8 0 n m 附近。 为了从荧光物质所发射的荧光中得到更高的荧光信号能量，发划光滤色片的 意透过率区域应该尽量烤荧光物质发射峰德光谱雹括在内，荠且增大运光带宽； 由于，荧光物质的高发射强度光谱范围有限，如图31 8 中红色曲线所示，所以 嗾蕊增大滤色冀逶毙带宽，不仅不链有效懿增翔荧毙信号熬强菠，反而会增热 激发光滤色片的高截止深度区域的宽度，同时将增加滤色片镀膜结构设计的难 渡。蕊銎3 + 18 中霹以看密，在6 5 0 n m 鬻遥，荧光光谱强度已经下降到较低的位 置，由此，可以将发射光滤色片透光区域光谱范围的最大慎确定在在6 5 0 h m 附 近。 圈3 1 8 纵坐檬为螺对丁蓝线为荧光姆质光谱吸收效率相对健 橱对j 二红线为荧党莉质受激教射荧光光谱强度鞘对值 浙江犬学删1 j 学位论文 5 1 口 5 口 ； 避 4 0 06 0 0 6 0 07 0 0 凌长僦) 圜3 1 9 纵坐标为相对t - 监线为荧光物质光谱吸收效率相对值 相对予红线为荧光锪廪受激发射荧光竞谮强凄穗对值 考虑到部分荧光物质的s t o k e s 位移很小，吸收光谱曲线与发射光谱曲线峰值 非常接近( 掴差3 0 n m 以下) 并且峰值两侧的荫线迅遮下降，如图3 1 8 中两黼线 峰值相差约为2 0 n m ，而滤色片透光光谱特性曲线在从赢透过率区域到截止区域 的曲线变化边沿不是突变而怒一个大约2 0 n m 宽的渐变区域，由于激发光滤色片 与发瓣光滤色片的透过光谱范圈不可以袁交蘩，这将导鼗啜收与发羹砉光港酋线戆 峰值光谱无法同时保证处于滤色片高透过率光谱区。荧光物质发射的荧光强度是 与啜收酶激发光强震残叠三吃豹，若毽两个滤色片懿遴过光港范闺之闯的分界线 ( 如图3 1 7 中红线所示) 偏离，虽然荧光物质吸收的激发光能量增加了，发射 出的荧光强畿增加了，但是，擒取出的荧光信号能量占总荧光麓量豹比重减小了； 若使分界线偏低，虽然提取出的荧光信号能量占总荧光能量的比重增大了，但鼹， 荧光物质吸收的能量减小了，发射的荧光强度也减小了，因此，该分界线的确定， 零要绦证在激发光照鼹强度教荧光物矮浓瘦定斡祭 譬下获褥最大黪荧光信号 强度。 e = e 。( 矗) 瓦。( 五) ，c o 。( 彳) 疋a ( 五) i ( 2 ) d a d 2 式3 ，1 7 式3 1 7 中，x 。蚶，为发射光滤色片逢光光避范匿上限，x 曲l 为激发光滤色片 透光光谱范围下限，c 。( ) 为荧光物质发射光谱效率，c a b ( ) 为荧光物质吸收 浙江人学顺：卜学位论文 光谱效率，t 。( 九) 为发射光滤色片光谱透过率，t 曲( ) 为激发光滤色片光谱透过 率。if x ) 为激发光光谱强度，以上皆为预先确定的条件；e 为荧光信号憩量， d 为分界线波长。当 d 变化时，e 将随之变化，可以在计算机中通过数值演算 蛉方法，确定e 为最大僮时，1 的位置。 罗丹明的滤色片的设计参数，根据上述分析，对激发光进行滤色的激发光滤 色蔑透过光漤豹最小谴选掭为4 6 0 n m ，蹲荧光遂季亍滤色熬发射光滤蕊片煞邂过壳 谱最大值选择为6 6 0 r i m 。由于，罗丹明吸收、发射数据以及氖灯光谱光强分布数 攥鬻是臣数疆靛形式绘出的，为了确定分界线波长值，褥三三个曲线的数据输入到 计算机中，编写程序，首先将氙灯光谱光强分布曲线与罗丹明吸收光谱效率曲线 对应相乘，得到如图3 1 9 曲线。 假设分界线在5 0 0 n m 与6 2 0 n m 之闯，由于，滤色片蛇设诗中将可能存在1 n m 的误差，因此，以l n r n 为步长，对陔范围进行数德计算。其过程为，首先以预 先稳定蛉激发光滤彘片透光光谱最小 妻、发瓣光滤色片透光光谱最大蓬醚及每次 计算的分界线作为参数，假设透过率为9 0 ，透过率曲线上升或下降沿的宽度为 2 0 r i m ，模羧出滤色片透光叠蠡线，如强3 。2 0 中所示懑。 波长( n m ) 浚长( n n l ) 图3 ，2 0 群序中的滤色片模j 掣示意图 然后，将激发光滤色片透光赭线与翔前灞中所示蓝线对应相乘，将发射光滤 色片透光战线与罗丹明发射光谱盐线对应螺暴，然愿对锝到的薅条热线分别进行 数德积分，得到罗丹明吸收的光能爨的虚拟数值与发射并被探测到的荧光能遂效 率鲍赢拟数馕，将这两个数傻耀象，缮到探测到的荧光能燕的痘戥数嬗。按照 l n m 的步长，在假设范围进行多次计算后，得到如图3 2 1 曲线。 浙江火学埘j 学位论文 波长( r i m ) 嬲3 2 i 数值计算褥剿的分器线变化导致收集别靛荧光耱鼙变化 从图中可以看到，存在荧光能量最大值，对应分界线波长为5 4 5 n m 。 在实际滤色片竣诗燕工中，考虑副逶光繁宽拘滤色片设计难瘦较大，采弼下 述方案。 图3 2 2 实际滤色方案透光曲线示意剀 铷i 强人学硕1 。学位论义 如图3 2 2 ，采用一片透光曲线如图中篮色线酌红外滤色片，萁与透光滴线如 豳中红色线的短邋滤色片b 对，实现对激发光的滤色；采耀片透光蓝线如图中 绿色线的长通滤色片，实现对荧光的滤色，以两片用于激发光滤色的滤色片的高 截止区域配合，降低混入荧光中款光源光线的强度。 在使用多探测器对多波段荧光信号同时检测的系统中，在发射光滤色片之前 簧瑟烟有分色器 譬。分色嚣件主要为二色镳，箕透光盘漕特性帮蓬长波逮鬣者短 波通曲线。检测区域中不同的荧光标记物发射出的荧光信号被系统同时收粲后， 需要使瘸二色镜对各静荧光信号遂行分离，分离后瀚每条光束中分剐只包台一。j 孛 荧光信号光谱，再以相应的滤色片分别单独进行滤波并以c c d 探测。由于长波 通或者短波通滤色片的透过率、截止深度以及透过率院变边沿等性能较优予带通 滤色片，所以可以将二色镜作为荧光信号光谱滤选中的短波通或长波通滤色片， 然后在其后配以相对应的长波通或短波通滤色片进行滤色。 本瀑蹙实验中，只对一赣波段荧光信号进行捡溪，采鼷罗努弱馋鬼荧光标记 物，如上所述进行设计加”r ，滤色片的实际通光曲线如图3 2 3 所示，左边两幅 爱为红乡 滤色片与疆逶滤琶片胶合螽实测所得益线，右边两梧鹜为长逶滤色片实 测所得曲线。 幽32 3 滤色片实际通光曲线 第四章氙灯照明系统设计 本章将豳绕氤灯照明系统的设计展开论述，首先对氤灯自身的部分特性进行 分析，讨论箕对系统照明的影响，在此基础上为了能够更有效的进行氙灯照明系 统的设计，采用a s a p 软 孛对氖灯发光结梅避行模拟分援；在照鼹方案教设计过 程中，利用a s a p 中建立的氙灯模型对方案避行模拟，在计鳟机模拟的基础上对 方案遴行评徐并袭送，最后溪将方案付诸实施。 本课题研究的悬浮式生物芯片的c c d 荧光检测系统的实验中，微球的赢径 为5 镞寒左右，残豫分辨搴设定为个强塔采用至少4 4 个豫素藏豫，选撵韵 c c d 为5 1 2 7 6 8 阵列的9 9 微米像素，使用一个数值孔径为0 3 4 7 3 1 6 5 的透 镜组将宽度为l m m 的液流通道上长度为0 6 5 m m 的一段液流场放大7 储成像予c c d 像敏蕊。选用的氙灯为h a m a m a t s ux e n o nf l a s hl a m ps e r i e sh i g hp o w e r t y p ew i t hb u i l t i nr e f l e c t o rl 4 6 3 4 ( 15 w , c o l l i m a t i n gt y p e ) ( 文中简称l 4 6 3 4x e n o n l a m p ) 。 4 】氙灯特性分析 本章节中陈述本系统所选用的l 4 6 3 4x e n o nl a m p 的部分性能特性，并对系 统照明中应用及蹶可能产尘躲影孵进行分柝，氨灯的相关数据资料寒囊予 h a m a m a t s ux e n o nf l a s hl a m ps e r i e s 院明书。图4 1 为l 4 6 3 4x e n o n l a m p 实物照片。 图4 1 僦灯灯管实物照片 4 1 1 氚灯发光脉冲及萁触发特性 l 4 6 3 4 x e n o n l a m p 黩脉冲发光颞率最毫可以达到1 0 0 h z ，葵光辣冷甄可隧囱 l 4 6 3 4x e n o nl a m p 控制电路的内置时钟信号触发，也可以出外来信号触发。c c d 塑坚叁堂堕! ：堂些堡苎 的图像采集频率为每秒5 - 3 0 幅，低于脉冲发光的最高频率，可将c c d 电路系统 输出的图像采集同步信号引入l 4 6 3 4x e n o nl a m p 触发系统作为l 4 6 3 4x e n o n l a m d 光脉冲的触发信号，就可以实现l 4 6 3 4x e n o nl a m p 脉冲发光与c c d 曝光 积分的同步进行。 l 4 6 3 4x e n o nl a m p 光脉冲的触发信号电压要求为3 5 1 5 v ，且信号波形的高 电平要求维持5 微秒以上。c c d 电路系统输出的图像采集同步信号为5 v 的方波 信号，如图4 2 ，因此可以直接将同步信号引入l 4 6 3 4x e n o nl a m p 触发系统作 为脉冲触发信号。 一堕堡墨壅型塑! - j；_ ! ! ! - i 5 v 图42 c c d 同步信号波形 l 4 6 3 4x e n o nl a m p 的发光脉冲光强变化曲线如图4 3 中b u i l t - i nr e f l e c t o r h i g h p o w e r t y p e 曲线所示( l 4 6 3 3 型号的氙灯与l 4 6 3 4 的唯一区别在内置反射镜 上) 。可以看到，氙灯光脉冲长度小于4 n s ，