（光学工程专业论文）基于cmos的μtas荧光检测系统的开发.pdf

浙江大学硕 万 论文 摘 要 本文所有工作是围绕基于 c mo s的图像采集处理系统在微流控分析芯片中 的应用开发展开的。 首先对微流控分析芯片作了 简单的介绍， 主要包括微流控分 析芯片的发展和现状， 基本的组成结构， 工作原理和特点， 然后着重介绍了微流 控分析芯片的检测系统， 特别是荧光检测系统， 分析了荧光的产生机理， 荧光检 测的原理和方法。目 前微流控分析芯片发展趋势是微型化、 集成化和便携化， 这 就对它的检测系统提出了更高的要求。 当前微流控芯片的检测系统在微型化、 集 成化方面还不能达到微流控分析芯片发展的要求，而 c mo s图像传感器己 经能 获得和c c d 产品相似的图像质量， 且在功耗、 集成度上都取得了很大突破。 本文 在这样的背景下提出了将 c mo s图像传感器应用到微流控芯片的检测系统中， 并设计了相应的实验来初步的验证本文的想法。 然后本文尝试着针对微流控芯片 的荧光检测的特点，开发一套完整的基于c mo s图 像传感器的嵌入式图像采集 处理系统， 希望能通过这样的方法来实现微流控芯片的微型化、 集成化和便携化。 本文在完成对系统总体方案设计的基础上， 主要作了以下两部分工作， 一部 分是利用电子目 镜 ( 它的核心部分就是c mo s图像传感器)在显微镜下对微流 控芯片进行了 成像分析，通过这样的实验分析，给c mo s传感器在微流控芯片 的荧光检测系统中的应用可行性提供具体的实验依据;另一部分为本文的重点， 即基于c mo s的图像采集处理系统的开发，通过比较目 前嵌入式图像采集和处 理系统常用的 几种实现方法， 本文提出了由c m o s , f p g a 和d s p 共同 组成一套图 像采集处理系统的方案。充分发挥 f p g a的控制能力强， d s p 系统指令丰富，软 件开发灵活， 具有很好的可扩展性的 优点。 主要的工作包括整个系统的硬件设计 和软件设计， 硬件设计部分除了整体的方案设计外， 还有各个主要组成部分的硬 件接口 设计，软件部分的开发主要包括f p g a 的开发和d s p 在c c s 开发环境下的 软件设计，以及d s p 和p c 机的串口通信软件设计。 通过本课题的研究，基于 c m o s的嵌入式图像采集处理系统在未来微流控芯 片的应用中，应有广阔的应用前景。 关键词: 微流控芯片，荧光探测， c mo s图 像传感器， 数字信号处理器， 现场 可编程逻辑门阵列 浙江人学n t i. 论文 abs tract f ir s t l y , t h i s p a p e r g a v e a s im p l e i n tr o d u c t i o n a b o u t m i c r o fl u i d i c a n a l y t i c a l c h ip , w h ic h i n c l u d e s it s d e v e l o p m e n t a n d a c t u a l i t y , s t r u c t u r e , p r i n c i p l e a n d c h a r a c t e r i s t i c s . a n d t h e n w e d e s c r i b e d t h e t h e d e t e c t i o n s y s t e m o f m i c r o fl u i d i c a n a ly t i c a l c h i p , e s p e c ia l l y t h e fl u o r e s c e n t d e t e c t i o n s y s t e m . m o r e o v e r , w e a n a l y z e d h o w fl u o r e s c e n t w a s p r o d u c e d , t h e p r i n c i p l e a n d m e t h o d s o f fl u o r e s c e n t d e t e c t i o n . a c c o r d in g t o t h e a c t u a l it y o f t h e d e t e c t i o n s y s t e m o f m i c r o fl u i d i c c h i p , w e r e a l i z e d t h a t t h e p e r f o r m a n c e o f t h e c u r r e n t d e t e c t i o n s y s t e m c a n n o t m a t c h t h e r e q u e s t o f t h e m i c r o fl u i d i c c h i p o n m i c r o m a t i o n a n d in t e g r a t i o n . i n o t h e r w a y , c mo s i m a g e s e n s o r d e v e l o p e d q u i c k l y a n d i t s im a g e q u a l i t y i s c l o s e t o c c d , f u r t h e r m o r e , i t s c o n s u m p t i o n i s l e s s a n d m o r e p r o p i t i o u s t o i n t e g r a t i o n . s o w e c h o s e t o u s e c mo s i m a g e s e n s o r i n t h e d e t e c t i o n o f m i e r fl u i d i c c h i p , a n d h o p e t h a t t h e d e t e c t io n s y s t e m c a n b e s i m p l e r t h r o u g h u s in g c m o s i m a g e s e n s o r t o a c h i e v e i m a g i n g w i t h o u t l e n s . o u r j o b m a i n l y i n c l u d e s t w o p a r t s . o n e i s t o e l e c t r o - o c u l a r t o a c q u i r e t h e i m a g e o f m i c r o fl u i d i c c h i p w i t h t h e h e l p o f m i c r o s c o p e a n d a n a l y z e t h e i m a g e . t h e n w e p u t o u r e m p h a s e s o n d e v e l o p i n g i m a g e c o l l e c t i n g a n d p r o c e s s i n g s y s t e m b a s e d o n c mo s i ma g e s e n s o r . a ft e r c o m p a r i n g t h e u s u a l m e t h o d s t o b u i l d e m b e d d e d i m a g e c o l l e c t i n g a n d p r o c e s s i n g s y s t e m , w e w o r k e d o u t t h e s c h e m e w h i c h i s t o u s e c mo s , f p g a a n d d s p t o b u i ld t h e s y s t e m . t h i s m e t h o d e x e r t s t h e s tr o n g p o i n t o f f p g a a n d d s p . a s w e k n o w , f p g a h a s g o o d p e r f o r m i n c o n t r o l , a n d d s p i n s t r u c t i o n s a r e a b u n d a n t , s o ft w a r e d e v e l o p in g i s fl e x i b l e . d s p a l s o h a s g o o d e x p a n s ib i l i t y a n d u p g r a d e . i n t h i s p a r t , o u r t a s k c o v e r s t h e d e v e l o p m e n t o f h a r d w a r e a n d s o f t w a r e . o n d e v e l o p i n g h a r d w a r e , d e s i g n i n g t h e c o n n e c t i o n o f a l l t h e h a r d w a r e i s i m p o r t a n t . s o ft w a r e d e v e l o p m e n t c o n s i s t s o f t h e s o ft w a r e o f f p g a a n d d s p , a n d t h e c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n d s p a n d c o m p u t e r t h r o u g h t h e r e s e a r c h w o r k o n t h i s p r o j e c t , w e b e li e v e t h a t t h e e m b e d d e d i m a g e c o l l e c t i n g a n d p r o c e s s i n g s y s t e m b a s e d o n c m o s i m a g e s e n s o r w i l l h a v e a g o o d p r o s p e c t i n t h e f i e l d o f m i c r o fl u i d i c a n a l y t i c a l c h i p . k e y w o r d s : mi c r o fl u i d i c a n a l y t i c a l c h i p , f l u o r e s c e n t d e t e c t i o n , c mo s i ma g e s e n s o r , d i g i t a l s i g n a l p roc e s s o r , f i e l d p r o g r a m m a b l e g a t e a r r a y 浙江人学硕士论文 第一章序 论 夸 1 . 1 微流控芯片的总体介绍 1 . 1 . 1 微流控芯片的发展和面临的挑战 科学技术的发展向分析科学提出了新的挑战，2 1世纪生命科学与信息科学 的发展， 要求分析科学用更低的消耗、 更简便的方法和设备、 更快的速度提供更 准确的有关物质成分与结构的信息。微流控化学分析( m i c r o fl u i d i c c h e m i c a l a n a ly s i s ) 正是九十年代新兴的、与这一目 标相适应的 分析技术，到现在已 有了 多 种名称， 如:微流控系统( m i c r o fl u i d i c s y s t e m ) , 微全分析系统( m i c r o t o t a l a n a l y s i s s y s t e m ， 即 p t a s ) ， 微诊断系 统( m i c r o d i a g n o s t i c s y s t e m ) ， 平板芯片系 统( p l a n a r c h i p s y s t e m ) , 微加i化学分析系统( m i c r o f a b r i c a t e d c h e m i c a l a n a l y s i s s y s t e m ) ， 小型化 学分 析系统( m i n i a t u r i z e d c h e m i c a l a n a l y s i s s y s t e m ) ， 芯片实 验室 ( l a b o n a c h i p ) 等。 该分析技术采用微细加工技术制成具有微结构的芯片， 将试样的采集、预处理、 分离、 反应、 检测等部分集成在几平方厘米的面积内，从而高效、 快速地完成试 样的分离、分析及检测。 在分析系统微型化、 集成化的 基础上， p t a s 的 最终目 标是实现分析实验室的 “ 个人化” 、 “ 家用化” ，从而使分析科学及分析仪器可以 走出 化学实 验室， 进入千家万户。 其中 微流 控芯片 ( m i c r o fl u i d i c c h i p s ) 是当 前 p t a s中最活跃的领域和发展前沿。p t a s作为一个高度学科交叉的领域， 它既 依赖于许多分析技术的发展， 又依赖于微加工技术的支持与发展， 同时还依赖于 应用 对象 ( 当 前主要是生命科学) 的 发 展 和融入。 除 此之外， 材料、 电 子、 光学 仪器、 计算机等科学领域的发展与介入，也是ja s 取得不断进展与成功所不可 缺少的条件。 从当前的发展水平看， 微流控芯片已经突破其发展初期在加工技术及基本流 控技术上的主要难关， 进入一个开展更深入的基础研究、 广泛扩大应用领域， 及 深度产业化的转折时期。预计这一时期不会很长，最晚到2 0 0 8 年，以微流控芯 片为核心的微分析系统将取代当前化学分析实验室的很多设备， 使化学分析进入 病房、 生产现场甚至家庭。 在此基础上再经过三五年， 能监测自 身生化指标及基 因变异、 食品卫生及环境状况的便携式“ 个人化验室” 将可能成为现实。 我国在 浙江大学硕 卜 论文 微流控分析系统方面的研究，虽然起步较国外晚了4 -5 年，但在多个相关的学 科领域具有足够的积累与优势， 而且， 继生物芯片之后， 微流控分析系统也正在 引起多方面重视。 相信通过不懈的努力， 微流控芯片在我国的蓬勃发展形势也会 很快形成。 1 . 1 . 2 微流控芯片的基本概念和特点 1 . 1 .2 . 1 微流控芯片的基本概念 微流控分析芯片【 ， 是通过微细加工技术将微管道、 微泵、微阀、微储液器、 微电 极、 微检测元件、 窗口 和连接器等功能元器件像集成电路那样， 使它们集成 在芯片材料 ( 基片)上的微全分析系统。它具备下列结构和加工特点: . 以微管道为网络， 将微泵、 微阀、 微储液器、微电极、微检测元件等 连接在一起， 对加入微通道中的液体进行控制与分离测定，以完成多 种分析功能，如采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等。 . 微流控芯片的面积约为几平方厘米。 . 微管道宽度和深度为微米级，因此，虽然它的加工方法起源于微电子 工业微机电 加工技术， 但它又不同于以 硅材料二维和浅深度加工为主 的集成电路芯片加工技术。 微管道的加工宽度和深度比集成电路芯片 大得多，加工精度要求则相对较低。 . 芯片材料已从硅片发展到玻璃、石英、有机聚合物等，因此也发展了 有机聚合物材料的加工技术。 在传统的光刻和蚀刻的基础上发展了模 塑法、热压法、激光烧蚀法、l i g a技术和软光刻等新方法。 1 . 1 .2 . 2 微流控芯片的特点分析 分析系统通过在微米级通道与结构中实现微型化， 不仅带来了分析设备尺寸 上的变化， 而且在分析性能上也带来众多的优点。 另一方面， 微型化也带来了对 设备加工的特殊困难，这些困难限制了微流控芯片的发展。 微流控芯片的优点包括以下几方面: 1 )微流控分析系统具有很高的效率; 许多微流控芯片可在数秒至数十秒时 间内自 动完成测定、 分离或其他更复杂的操作。 分析和分离速度常高于相对应的 浙江大学q ; 七 论文 宏观分析方法一至两个数量级。 其分析或处理的快速既来源于微米级通道中的高 导热和传质速率 ( 均与通道直径平方成反比) ，也直接与结构尺寸的缩小相关。 2 )微流控分析的 试样与试剂消耗已 降 低到微升水平，并随着技术水平的 提高， 还有可能进一步减少。 这既降低了分析费用和贵重生物试样的消耗， 也减 少了对环境的污染。 3 )用微加工 技术 制作的 微流 控芯片部 件的微小尺寸 使多个部件与功能有 可能集成在数平方厘米的芯片面积上。在此基础上易制成功能齐全的便携式仪 器，用于各类现场分析。 4 )微流控芯片的 微小尺寸使材料消耗甚微。 当实现批量生产后芯片成本可 望大幅度降低，从而有利于普及。 目 前微流控分析芯片的局限性体现在以下几方面: 1 )作为w t a s 的主要发展前沿， 当 前的微流控芯片系统总体上既不够“ 微” ， 分析功能也远达不到“ 全” 。 主要原因是集成度不够高， 多数检测器的体积过大， 实现集成化还有很长的路要走。 2 )在目 前加工条件下， 微流控芯片制作的成本还难以 满足有关成果推广应 用的要求。一块供研究用的标准玻璃芯片价值 1 0 0 2 0 0美元，一块供分析 1 2 个试样的一次性专用芯片售价 1 0 美元。 3 )当前报道的大部分微流控芯片分析系统不包括试样的前处理功能， 即功 能不够全， 为了解决实际试样的分析， 这方面的研究尚需在应用领域中大力加强。 1 . 1 . 3 微流控芯片的检测系统 微流控芯片检测系统的作用是测定被分析样品经微流控芯片分析系统分离 或处理后有关组分的组成及其含量。 检测系统的总体性能将影响整个微流控芯片 分析系统的检出限、 检测速度、 适用范围、体积等指标， 是微流控芯片分析系统 的一个关键部分， 有关检测方法和检测系统的研究己 经成为微流控领域的一个重 点和热点。 1 . 1 .3 . 1 微流控芯片检测系统的性能要求 与传统的仪器分析系统相比， 微流控芯片分析系统对检测系统有一些特殊的 要求: 浙江大学硕 丁 论文 . 更高的灵敏度和信噪比 在微流控芯片分析过程中，由于可供检测物质的试样体积微小 ( 微升、 纳升 甚至皮升级) ，且检测的区域一般非常小，所以要求检测系统应具有更高的检测 灵敏度和信噪比。 . 更快的响应速度 由 于芯片上的通道较短， 许多混合及分离过程往往在很短的时间内( 秒级甚 至更短)即可完成，因此要求检测系统有更快的响应速度。 . 特殊的结构 由于微流控芯片检测系统要与芯片的微通道尺度相匹配， 还要考虑分析系统 的总体微型化， 所以检测系统的结构、 体积、 重量等方面应利于集成化或至少有 利于同芯片的藕合。 . 多重平行检测功能 目 前微流控芯片分析的一个发展趋势是在单个芯片上进行通道的高度集成 化， 形成多个并行的分析单元或通道阵列， 从而大大提高分析速度， 为此还要求 检狈 ( 系统具有多重平行检测的功能。 . 便于携带 为了适应仪器便于携带的需要， 要求微流控芯片检测系统性能稳定可靠、 坚 固耐用、体积小。 . 成本低 要实现整个微流控芯片分析系统的低成本， 作为整个分析系统的一部分的检 测系统也必须要降低成本。 1 . 1 .3 .2 微流控芯片检测系统的分类 微流控芯片分析的检测方法种类繁多，区别主要在于检测原理不同。因此， 对微流控芯片的检测系统一般都是按照它的检测原理来进行分类， 主要存在以下 几种，光学检测系统、电化学检测系统、质谱检测系统等，如图1 -1 所示。 其中光学检测的种类比较多， 本文将在后面的章节重点介绍其中的荧光检测 法。 电 化学检测是一大类常用的分析测试方法， 不论何种电化学检测方法， 都是 采用电极作为传感器， 直接将溶液中待测组分的化学信号转变为电信号。 电化学 浙江大学硕 了 论文 检a一向以其灵敏度高而著称， 同时， 加上超微电极的广泛使用， 使得微流控芯 片与电化学检测器连用后，可望得到一个灵敏且真正集成化和微型化的分析装 置。由于微电子加工技术在电极、电路、 和微细结构制作上的优势， 通过对微流 控电化学检测芯片系统的集成化和微型化， 最有希望得到一个体积小， 甚至是便 携的装置。 图i 一i 微流 控芯片检测系统分类 由于使用激光诱导荧光检测常常需要进行荧光衍射， 因此质谱仪正在成为微 流控芯片研究中最受关注的检测器之一。 质谱检测的基础是生物质谱， 生物质谱 作为生物化学分析的重要技术内 容， 能够提供试样组分中生物大分子的基本结构 和定量信息。 通过为质谱分析提供良好的样品前处理及分离途径设计可极大地提 高处理容量， 质谱检测在微全分析领域正逐步展现其作为芯片检测系统的巨大潜 力。 核磁共振检测依赖核磁共振波谱 n mr ) ，这种波谱可以提供化合物的许多 结构信息， 将n m r仪器作为芯片分析系统的检测系统， 可以 进行化合物结构的 鉴定， 从而扩展微流控芯片分析系统的应用领域，目 前这方面的研究工作尚处于 浙江大学硕 一 论义 起步阶段。 妇. 2嵌入式微流控芯片荧光检测系统开发背景 微流控分析芯片的荧光检测系统通常由激发光源、 光学滤波器、 芯片和光学 探测器四部分组成。 其主要工作原理是光源发出激发光， 经过光学滤波器产生满 足芯片中荧光试剂对激发光要求的光， 受到激发光作用的荧光试剂产生特定的荧 光信号， 然后由光学探测器来检测产生的荧光信号， 最后对光学探测器所采集到 的荧光信号进行处理从而得到检测的结果。 日 前在微流控芯片中应用较多的荧光 检测系统是激光诱导荧光检测系统 ( l a s e r i n d u c e d f l u o r e s c e n c e , l i f )。l i f 是当 前灵敏度最高的检测方法之一， 灵敏度一般可达1 0 - m o l / l - 1 0 - m o l / l 。 近 年来， l e d 凭借其能简化荧光检测系统的结构，促进其集成化，降低其成本等优 点，在微流控芯片的荧光检测系统中的应用越来越多。 在微流控芯片分析系统的微型化和集成化进程中， 除了激发光源的微型化之 外， 光学探测器部分的微型化同样也是非常重要。 过去微流控芯片荧光检测系统 的常用光学探测器主要是c c d 和光电倍增管，虽然这两种探测器具有较高的检测 灵敏度， 较好的满足了微流控芯片荧光检测系统的要求。 但是它们同样也存在着 体积大， 不利于荧光检测系统的集成化和微型化的缺点， c m o s 图像传感器则很好 地弥补了它们在这方面的缺点。 完整的微流控分析芯片实验系统中， 由c m o s 图像传感器采集得到微流通道内 荧光试剂的真实的荧光图像，最终的实验结果需进行必要的图像处理与数据分 析。 通道内荧光标记的测试样品溶液浓度的大小则表现为荧光图像中对应象素灰 度值。 系统的采集部分控制c m o s 图像传感器采集信号，以及信号的输出存储; 然 后由系统的图像处理部分完成对荧光图像数据的处理。 图像处理算法的效果对实 验的结果产生直接的影响，因 此优化算法能够提高系统检钡 ( 的灵敏度和精度。 微流控分析芯片的荧光图像处理主要包括两个方面:第一是图像增强，主要 目的是滤除荧光图像中的噪声; 第二是图像分割， 将荧光图像中对实验有效的部 分准确地分割出来， 使它与背景分离， 以便进行下一步的数据分析， 如计算荧光 图像的灰度值等。 图像的处理就是对图像信息进行加工以满足应用需求的行为。 图像处理的手 段有光学方法和电子学 ( 数字) 方法。 前者已经有很长的发展历史， 从简单的光 浙江大学0 1 i : 论文 学滤波到现在的激光全息技术，光学处理理论已经日 趋完善，而且处理速度快， 信息容量大， 分辨率高， 又很经济。 但是光学处理图像的精度不够高， 稳定性差， 操作不便。随着电子技术和计算机技术的发展，数字图像处理也迅速发展起来， 应用的范围也越来越广。 所谓数字图 像处理2 就是利用数字计算机或其他数字硬 件，对从图像信息转换得到的电信号进行某些数学运算，以提高图像的实用性。 但是数字图像处理的数据量非常庞大， 处理速度相对较慢， 限制了数字图像处理 的发展和应用。 随着现代电子技术和大规模集成电路技术的发展， 数字图像处理速度慢的缺 点将逐步得到解决。如以d s p为代表的通用数据处理器件，凭其强大的数据处 理功能和极高的运算速度， 使其在数字图像处理领域蕴含着巨大的应用潜力。 通 用 d s p图像处理电路有以下优点:电路结构相对简单，图像处理算法丰富，智 能化程度高， 体积也较为小巧。 尤其是1 9 9 7 年t i 公司发布的t m s 3 2 0 c 6 x 系列， 运算速度高达 1 6 0 0 mi p s ，加上灵活的e mi f和h p i 接口，以及4 个d ma数据 传输通道等，都使得构建小型实时化的数字图像处理成为可能。 本文采用t ms 3 2 0 c 6 7 1 1 芯片为核心组成图像的处理部分，配合相应的软件 完成对荧光图像的数字化处理。 同时选用近年来发展迅速的可编程逻辑器件来控 制整个系统的图像采集和存储，使得d s p无需管理图像采集部分的控制，专注 于图像的处理，提高整个系统的速度和性能。 1 . 3课题的提出和研究工作 上世纪9 0 年代初以 来， 微流控分析系统( m ic r o fl u i d ic a n a l y t i c a l s y s t e m ) 作为 微 全分 析系 统 m i c r o t o t a l a n a l y t i c a l s y s t e m ) 的 主流 形式， 发 展成为分 析科学 一 个重 要的前沿领域。 微流控分析芯片是微流控分析系统的核心部件。 十多年来， 人们 在微流控分析芯片的研制中取得了很大的 进展，邮票大小、功能各异的微型化、 集成化芯片不断问世。 相比之下， 与微流控分析芯片配套的高灵敏度微型检测器 的研制却相对落后。目 前在微流控分析系统应用较为普遍的激光诱导荧光检测 器，虽然具有很高的灵敏度，但却远远没有达到微型化和集成化的要求。 微流控分析系统的总体尺寸减小主要受到了光源和探测元件大小的限制， 为 此光学读出元件的微型化非常迫切， 且具有重要的价值， 本文提出了使用图像传 感器的两大主流产品之一一一 c m o s 图像传感器的技术方案。 当前的c m o s己经能 浙江大学o il l 一 论文 获得和c c d 产品相似的图像质量， 且在功耗、 集成度上都取得了很大突破。 c m o s 图像传感器具有许多优点， 如芯片内部集成了a / d 转换器、 输出为数字信号、 外 围线路简单、工作时不需要相位驱动脉冲、价格便宜等等。但是仅仅依靠一个 c m o s 图像传感器还是不够的， 还需要通过使用光学滤波器来提高光谱分辨性能， 本文提出将光学滤波器直接做于 c mo s成像面上从而形成多波长探测阵列的方 案。这种滤波方法己经被应用到单系统超光谱成像中。带有滤波装置的 c mo s 成像阵列使得在缩小光谱仪器大小的时候， 能够获得流通通道中试液的较高分辨 率的成像。 基于上述的优点， c m o s 图 像传感器成为缩小微流控芯片检测系统尺 寸的一个很好的选择图 。 本文选择c mo s图像传感器的另外一个原因是，c mo s图像传感器作为一 个成像探测阵列， 可以 直接控制单个象素的 操作， 一般来说成像阵列的大部分是 用不到的，所以c mo s 具有更快的响应时间和更长的积分时间。 在本文设计基于c mo s的图像采集处理系统时， 希望能够设计一个嵌入式的 图像采集处理系统月 来满足前面所提到的系统要求。 嵌入式图 像采集与处理系统 具有可靠性高、 速度快、 成本低、 体积小、 功耗低和环境适应性强等优点。目 前 嵌入式图像采集和处理系统实现的方法有很多种，如基于f p g a 的，基于专用或 通用数字信号处理器的，基于单片机的。基于f p g a 的嵌入式图像采集和处理系 统虽然并行处理程度高， 可以实现图像的高速处理， 但如果处理算法比较复杂时， 开发的难度就比较高了。 基于单片机的方式， 它的缺点在于速度比较慢， 不过它 的成本相对较低， 在一些要求比较低的场合还是有一定的应用价值的。 至于基于 d s p 的 方式， 优点在于系统指令丰富， 软件开发灵活， 具有很好的可扩展性、 可 升级性和易维护性。本文综合了d s p 和f p g a 的优点，将两者结合起来，共同组 成一套图像采集和处理系统。 基于以 上的情况，本文将 c m o s图像传感器应用到微流控芯片上，取代微 流控芯片的传统光学检测元件， 推动微流控芯片整体的进一步微型化做了一些尝 试性的研究，设计了一套完整的基于 c mo s图像传感器的嵌入式微流控芯片荧 光检测系统。这个系统主要由以 下三个部分组成:( 1 )单片集成l e d阵列，这 是作为微流控芯片检测系统的光源， 近年来l e d的发展也很快，出现了白 光、 蓝 光等各种波长范围的 l e d ，这样就为微流控芯片检测系统光源部分的微型化 浙江大学硕 卜 论文 和集成化提供了条件;( 2 ) 微流控芯片的设计加工，以及光学滤波层的设计， 特 别是光学滤波层设计好坏直接关系到整个系统的灵敏度和精度， 这一部分还要依 靠微加工技术的进步，如me ms 加工工艺的发展;( 3 )基于c mo s 图像传感器 的图像采集处理系统的设计。 本文的主要工作包括总体方案的设计， 然后根据光度学、 光谱学以及荧光成 像的理论， 用显微物镜和电子目 镜设计了一个成像实验系统。 通过电子目镜来观 察和分析微流控芯片中的显色反应， 对采集到的图像作了一定的处理和分析。 其 次针对微流控芯片荧光信号的特点，使用d s p , c m o s和f p g a建立图像采集 和处理系统，并用此系统来采集微流控芯片的荧光所成图像。 浙江大学硕 ! 一 论文 第二章 荧光检测的理论基础和荧光成像介绍 2 . 1荧光检测理论基础 2 . 1 . 1荧光的产生机理 荧光是由荧光团或荧光染色体分子吸收光后产生的， 这些分子吸收光后， 它 们的能级跃迁到激发态， 当处于激发态的分子衰减到低能级， 它们就发射出荧光。 整个荧光产生的 过程气 b ， 如图2 -1 所示。 当激发光源如灯或激光所提供的能量为b y 。的光子被荧光团吸收后， 它就产 生了 一个不稳定的电 子能量态 ( 5 , ) 。 此过程就将荧光和化学发光区别开来了。 荧光团的激发态的寿命是很短的， 通常只有几十亿分之一秒。 在这么短的时间内， 处于激发态的分子跃迁到最低振动能级， 在这一过程中， 有一部分能量转化为热 能而损失掉了 ( 如图2 -1 中过程2 ) e ry a ii i 图2 -1 荧光的产生过程 当一个染色体分子从激发态跃迁到低能级时， 就会发出一定波长的光。 发射 出来的光子的能量h v e m是两个能级之间的能量差，这个能量差就决定了激发光 的 波 长( k e m ) o a t, 一 %、 ( 2 一 1 ) e :两个能级之间的能量差; h :普朗克常数; c :真空中的光速; 使用激光扫描仪器或 c c d可以 侧量荧光的强度，然后就可以得到样品的数 字图像。 浙江人学硕上 论文 2 . 1 . 2荧光染色体的特性分析 1 ,激发光谱 激发光谱表示了荧光染色体被给定波长的入射光激发的概率， 这个光谱就是 所有发射荧光和激发光的波长图 图 2 -2 a ) ，它与荧光染色体厂商所提供的吸 收光谱是非常接近的。 处于激发光谱波峰光子的能量等于荧光染色体基态( s o ) 和第一激发态( s , ) 的振动能级之间的能级差 ( 图2 -3 a ) o 激发光谱的带宽说明荧光染色体分子可以 处于基态能级中的振动能级或转 动能级中的任意一个能级水平上， 然后跃迁到激发态中的振动能级或转动能级中 的任意一个能级水平上。 在实际情况中， 当激发光的波长处于激发光谱的顶点附 近时，荧光染色体被激发的效率最高。 e .? 5t 51 3 5 1s z a 5 3 2日丁 s uo-颐娜-声因 。二月一。击 d 忆 幻 日0煞 盆巴 ， ， d 0. 4 5 0 9 a 5 m c o n , m i - wb wl e n g t h ( a ) w a v e l e n g t h ( n m 1 ( b ) 图2 -2 三种不同 物质的激发光谱和发射光谱 2 、发射光谱 如图2 - 2 b 所示， 荧光染色体的发射光谱描述了发射光子处于各个特定波长 的概率， 发射光的强度是发射光波长的函数。 当发射光的能量等于激发态的基础 能级和基态的振动能级之间的能量差时， 它的波长就处于发射光谱的波峰位置附 近 ( 如图2 -3 a ) o 如果激发态和基态的电子振动结构相似， 那么发射带的形状差不多等同于最 长波长的吸收带的镜像 ( 如图2 -3 a ) 。从理论上讲，激发时的跃迁 i 和发射时 的 跃迁1 相应的光的波长应该一致。 但是， 在实际情况中， 由于溶剂的弛豫效应， 前面所说的两个波长有一定的偏差。 发射光谱相对于激发光谱总是向 长波长方向 有一个移位。 发射光谱的波峰和 激发光谱的波峰位置的偏差被称为 s t o k e s 位移。波长位置偏移了，也就意味着 浙江大学硕1论文 能量的偏差， 发射光的能量减少了， 减少的能量在激发产生的荧光没有发射之前， 激发态还存在的时候就以热能的形式损失掉了。 s t o k e s 位移对于荧光技术的灵敏 度是非常重要的， 因为它使我们可以将一些背景噪声从激发光中滤除掉而不影响 发射光子的探测。 已0一坦二口翎5留巴刀多 老-叭u马ul . 代号r r r1亡 jl 目目 李 田 a 7sa之公t侣5 4 3 2 7 r 2 - a . a 日 ，e mi l . h o n 图2 -3荧光染色体分子的能级图 3 . 荧光强度 不同的荧光染色体它所产生的荧光强度是不一样的。 这一点非常重要，因为 这直接影响到荧光染色体的探测灵敏度。 影响荧光染色体所产生的荧光强度的两 个主要因素是: 1 、荧光染色体的吸收光的能力 ( 消光系数) 2 、将吸收光转换成发射荧光的效率 ( 量子效率) 染色体所产生的荧光强度与它的消光系数和量子效率成比例，关系如下: b r i g h t n e s s 一 e 中 染色体的消光系数就是它所吸收的特定波长的光的数量。 摩尔消光系数就是 在1 摩尔的染色体溶液中通过l e m 光程后的光强。在分子标记中常用的染色体， 它在吸收波峰处的摩尔消光系数大概在千分之十。 染色体受激产生荧光的概率就是它的量子效率，定义如下: 发射光子数 吸收光子数 ( 2 一2 ) cd的 值 在。 到1 0 0 % 之 间 。 例 如 ， 荧 光 素 的中为。 9 , c 户 5 的中为。 . 3 。 实 际 浙江大学b p i 卜 论文 上，小通常都是指的在吸收波峰处的量子效率。荧光素 ( e .-7 0 0 0 0 , cd、 0 . 9 ) 和c y 5( e 七 2 0 0 0 0 0 , c)- 0 . 3 ) 都是强度大的 染色体。 虽然它们的量子效率和 消光系数相差很大， 但是它们的荧光强度却很相近。 这就证明在评价一种新的染 色体的时候，同时考虑消光系数和量子效率的重要性。 荧光强度同样也受随机辐射所产生的光的强度的影响， 虽然从理论上说， 激 发光源越强， 激发产生的荧光强度就越大， 但在实际情况中， 高强度的光照射时 间过长，样品就会发生光裂解。 4 、环境的影响 荧光染色体的量子效率、 激发光谱和发射光谱受到很多环境因素的影响， 如 温度、离子强度、p h值、激发光强度和持续时间长短等。因此，许多供应商都 会提供它们的荧光试剂在不同条件下的特性。 另外一个重要的影响因素光裂解， 是由荧光染色体受激发时的剧烈的化 学反应产生的。 处于激发态的荧光染色体的化学活性要比处于基态时强得多， 处 于激发态的荧光染色体分子的一个小小的分裂， 就可以参与改变染色体分子结构 同时生成只能产生更少荧光的分子的化学反应。 2 . 1 . 3 荧光探测的基础荧光强度与浓度的关系 荧光既然是荧光染色体在吸收光子之后的辐射，因此荧光强度f 正比于被荧 光染色体所吸收的激发光束的辐射功率: f = k( i a 一 l ) ( 2 一3 ) 式中，l 和工 分别是入射光束的辐射功率、 透射光束的 辐射功率，常数k 取 决 于 荧 光 量 子效 率。 把 l a m b e r t - b e e r 定 律的 另 一 形式 : i = 几 。 一 。 0 76 , 代 入 式 2 - 3 , 得到 f = k , ( 1 一 e 2 .30 ,b , ) ( 2 - 4 ) 将上式中的指数项展开，并在 b c 从全球范围来看，生产d s p 芯片的 厂家主要有美国的德克萨斯仪器公司 ( t i 公 司 ) 、 a t 公司、 a t 卜 论文 序 。 a c h e 或数据 c a c h e 来使用 ( 5 ) 流水处理 除了多功能单元外， 流水技术是提高d s p s 程序执行效率的另一个主要手段 流水技术使两个或更多不同的操作可以重叠执行， 在处理器内， 每条指令的执行 分为取指、 解码、执行等若干个阶段， 每个阶段称为一级流水， 流水处理使得若 干条指令的不同执行阶段并行执行，因而能够提高程序执行速度。 3 . 4 . 2 d s p 芯片的主要性能指标 由于各个 d s p s 厂商的d s p s 芯片结构差别很大，因而数据传输能力也相差 很大， 因 此d s p s 的性能不能像p c 机那样可以 用c p u的时钟频率和型号来表征， 而必须采用可比的性能指标来衡量。 d s p s 的综合性能指标除了与芯片的处理能力直接相关外， 还与d s p s 的片内、 片外数据传输能力有关。 d s p s 的数据处理能力通常用d s p s 的处理速度来衡量; 数据传输能力用内部总线和外部总线的配置， 以及总线或i / 0口的数据香吐率来 衡量。 ( 工 ) mf l o p s :百万次浮点操作/ 秒。其中浮点操作包括浮点乘法、加法、 减法、 存储等操作。 m f l o p s 是表征浮点d s p s 芯片处理性能的重要指标。 用户 选用d s p s 芯片时要注意厂家提供的通常是峰值指标， 因此系统设计时要留一定 余量。t ms 3 2 0 c 6 7 x x 可以达到1 g f l o p s 的峰值性能。 ( 2 ) mo p s ;百万次操作/ 秒，这里的操作，除了包括c p u的操作外，还包 括地址计算、 d ma访问、数据传输、 i / 0操作等。 mo p s 可以对d s p s 的综合性 能 进 行 描 述， 2 0 0 m h z 时 钟的t m s 3 2 0 c 6 2 0 1 峰 值 性 能 可以 达 到2 4 0 0 m o p s o ( 3 ) mi p s :百万条指令/ 秒，3 0 0 mh z时钟的 c 6 2 0 3峰值性能可以达到 2 4 0 0 mi p s o ( 4 ) m b p s : 百万位/ 秒， m b p s 用于衡量d s p s 的数据传输能力， 通常指某 个总线或 i / 0 口的带宽，它是对总线或 1 / 0 口数据吞吐率的量度。对于 t m s 3 2 0 c 6 0 0 0系列外部总线接口， 如果总线时钟选择2 0 0 m h z ， 则总线数据吞 吐率为8 0 0 m字节/ 秒( 3 2 位数据总线) ， 即6 4 0 0 m b p s o 由于以上这些指标不可能完全表征处理器完成特定算法的处理能力， 所以只 是作为系统设计时的参考。 特别是随着d s p 。 结构的多样化、复杂化，这些指标 浙江大学硕 卜 论义 越来越不能反映d s p s 的综合性能，不同厂商的指标甚至不具可比性。 对于一些 常用的d s p 算法， 可以 参考d s p s 厂商提供的基准( b e n c h m a r k ) 。 在系统设计时， 要想得到具体参数下的精确指标， 则必须通过软件仿真器、 软件评估模块等开发 工具，在d s p s 上进行实验。 3 . 4 . 3 d s p 芯片的选择 设计d s p 应用系统，选择d s p 芯片是非常重要的一个环节，只有选定了d s p 芯片，才能进一步设计其外围电路及系统的其他电路。总的来说， d s p 芯片的选 择应根据实际的应用系统需要而确定， 不同的d s p 应用系统由于应用场合、 应用 目的等不尽相同， 对d s p 芯片的选择也是不同的。 一般来说， 选择d s p 芯片时应 考虑到如下诸多因素: 1 , d s p 芯片的运算速度 运算速度是d s p 芯片的一个最重要的性能指标， 也是选择d s p 芯片时所需要 考虑的一个主要因素。d s p 芯片的运算速度可以用以下几种性能指标来衡量: ( 1 )指令周期:即执行一条指令所需的时间， 通常以n s( 纳秒) 为单位。如 t m s 3 2 0 l c 5 4 9 - 8 0 在主频为8 0 m h z 时的指令周期为1 2 . 5 n s ; ( 2 ) m a c时间:即一次乘法加