（分析化学专业论文）细胞电化学及dna生物传感器的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 化学生物传感器的研究已经成为分析化学和生物化学领域中个非常重要 和令人感兴趣的课题，人们对此作出了深入广泛的研究。细胞作为卜命的基本单 位，对基体的生长发育，生理功能的维护起着极其重要的作用，细胞在电刺激的 作用下会产生特殊的电信号，人们已经开始着手深入探讨这种生理现象。而d n a 和r n a 是遗传信息的传递者，在维持物种的稳定性方面有着不可替代的作用。 真核细胞的d n a 广泛的存在于细胞核内的染色体上，由于核膜的选择性通透作 用，使d n a 无法分散到其它细胞的亚器官，加之细胞膜的隔离效果，d n a 更难 扩散到细胞外基质( 如组织液或血清) 中，因此细胞外基质中d n a 含量的增加 往往也会预示某些疾病的发生。d n a 的突变是癌症发生的一个重要原因，癌症 的产生往往伴随着某些特定基因片段的序列改变，或是缺失，从而使抑癌基因表 达失调，细胞恶性增殖。d n a 可以自发突变，但是其概率相对较小，当d n a 和 外界物质相互作用，或是某些氧化压力存在的情况下，d n a 会发生甲基化，突 变或是断裂。同时，生物工程中d n a 的分离，纯化，转基因载体的构建等也需 要对d n a 和其它物质的相互作用进行表征。电化学具有简单，快速，方便的优 点，因此，可以用电化学手段研究细胞活性，评估药物对细胞活性的抑制作用， 构建d n a 生物传感器以检测目标d n a 或考察d n a 与其它物质的相互作用。 基于上述分析，本文开展了以下三方面工作： 1 用电化学循环伏安和电位溶出技术对乳腺癌细胞m c f 7 的活性进行了表 征，并且评估了药物对该癌细胞的活性抑制作用，同时用形态学和染色技术进行 了验证。 2 用纳米碳管一壳聚糖膜构建了检测鱼精双链d n a 的生物传感器，考察了 纳米碳管的信号放大作用( 即对d n a 指示剂氧化还原的催化作用) ，膜的稳定 性，人血清白蛋白的干扰。 3 用电化学阻抗和循环伏安技术研究了d n a 和表面活性剂的相互作用。以 修饰d n a 的金电极为d n a 传感器，亚甲蓝和铁氰化钾分别为探针，用循环伏 安和电化学阻抗技术对五种不同种类的表面活性剂与d n a 的相互作用进行研 究。同时结合紫外检测技术，对上述五种物质与d n a 的作用作了验证。 关键词：细胞；d n a ；循环伏安；电化学阻抗；电位溶出法；紫外检测；传感器 缭胞电纯学每d n a 生物传感嚣斡磷变 a b s t r a c t t h ed e s i g no fc h e m o b i o s e n s o r si sa ni m p o r t a n ta n di n t e r e s t i n gs n b j e c ti n a n a l y t i c a lc h e m i s t r ya n db i o c h e m i s t r ya n dh a sb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e d c e l l sa st h e b a s i cu n i t so ft h el i f e ，a r ev e r yn e c e s s a r yf o rt h ed e v e l o p m e n t a la n dp h y s i o l o g i c a l p r o c e s so ft h eo r g a n i s m u n d e rt h ee l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n ，e l e c t r i c a ls i g n a lw i t lb e g e n e r a t e di nt h el i v i n gc e l l s 。d n aa n dr n a e n c o d e dg e n e t i cm e s s a g ea r ei m p o r t a n t f o rk e e p i n gt h es t a b i l i t yo ft h es p e c i e s i ti sw e l l k n o w nt h a tf o re u c a r y o t i cc e l l s ， d n ai sl o c a t e di nt h ek a r y o na n dc a nn o tp e n e t r a t et ot h ec y t o c h y l e m aa n dt h e t i s s u ef l u i db e c a u s et h ec e l lm e m b r a n ec a na c ta sb a r r i e r sf o rd n a t r a n s p o r t a t i o n t h e r e f o r e ，t h ea p p e a r a n c eo fd n ai nc e l lm a t r i xa n dt h es e r u mc a ni n d i c a t et h a t s o m ed i s e a s e sh a v et a k e np l a c e am a i nr e a s o nf o rc a n c e ro c c u r r e n c ei st h em u t a t i o n o fd n a ，i tm a yc a u s et h e c h a n g eo ft h es e q u e n c e a n de x p r e s s i o no fc a n c e r s u p p r e s s o rg e n e s t h eu l t i m a t er e s u l ti st h a tt h ep r o l i f e r a t i o no fc a n c e rc e l l si so u t o fc o n t r 0 1 h o w e v e r ，t h ep r o b a b i l i t yo fd n am u t a t i o nu n d e rn a t u r a lp r o c e s si sv e r y l i t t l e ，w h e r e a st h i s c o u r s ec a nb ea c c e l e r a t e di nt h ep r e s e n c eo fm a n yc h e m i c a l a g e n t so ru n d e ro x i d a t i o np r e s s u r e o nt h eo t h e rh a n d ，t h es e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n o fd n aa n ds e e k i n gf o rd n ac a r r i e sa l s oc a l lf o rt h ei n v e s t i g a t i o no fi n t e r a c t i o n b e t w e e nd n aa n do t h e rs u b s t a n c e s e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u ei sv e r ys i m p l e ，r a p i d a n dc h e a p t h e r e f o r e ，i tc a nb ee a s i l yu s e dt os t u d yt h ec e l lv i a b i l i t y , d r u ge f f e c to n l i v i n gc e l l s ，d n ac o n c e n t r a t i o na n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n c h e m i c a l sa n dd n a ， t h em a i nw o r ko ft h i st h e s i s ，w h i c hw a sb a s e do nt h ea n a l y s i sm e n t i o n e da b o v e ， i ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fb r e a s tc a n c e rc e l l sw a ss t u d i e do nag r a p h i t e e l e c t r o d eb yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n dp o t e n t i o m e t r i cs t r i p p i n ga n a l y s i s ( p s a ) ， t h ep e a ka r e ai np s aw a su s e dt oc h a r a c t e r i z et h eg r o w t ho ft h ec e l l sa n dt h ee f f e c t o fd i o s g e n i no nm c f - 7c e l l s t h er e s u l t sw e r ea l s ov e r i f i e db yt r y p a nb l u ed y e i n g a n dm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n 2 ab i o s e n s o rb a s e do nc h i t o s a nd o p e dw i t hc a r b o nn a n o t u b ew a sf a b r i c a t e dt o d e t e c ts a l m o ns p e r md n a m e t h y l e n eb l u e ( m b ) w a se m p l o y e da sd n ai n d i c a t o r c a r b o nn a n o t u b e sc a ne n h a n c et h ee l e c t r o a c t i v es u r f a c ea r e at h r e et i m e sa n d a c c e l e r a t et h er a t eo fe l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nt h er e d o xa c t i v em ba n dt h e e l e c t r o d e 。t h ei n t e r f e r e n c eo fh u m a ns e r u ma l b u m i na n dt h es t a b i l i t yo ft h e h 硕士学位论文 c h i t o s a n c n tm e m b r a n ew e r ea is oi n v e s t i g a t e d 3 t h ei n t e r a c t i o no fd n aw i t hf i v ed i v e r s es u r f a c t a n t sw a ss t u d i e db yc y c l i c v o l t a m m e t r ya n d e l e c t r i c a l i m p e d a n c e d n am o d i f i e dg o l d e l e c t r o d e sw e r e p r e p a r e d a n dm e t h y l e n eb l u ea n d f e r r i c y a n i d e w e r eu s e da st h er e d o xp r o b e s ， r e s p e c t i v e l y t h eu vd e t e c t i o nw a sa l s oe m p l o y e d t o p r o v e t h eo c c u r r e n c eo f i n t e r a c t o nb e t w e e l ld n aa n dt h es u r f a c t a n t s k e y w o r d s ：c e l l s ；d n a ；c y c l i cv o l t a m m e t r y ；e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e ；p s a ； u vd e t e c t i o n ；s e n s o l i i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在一年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 日期： o 列。年f 月乃日 日期渤f 年占月f 口日 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 细胞的化学研究进展 细胞是组成生命体的基本单位，具有非常重要的生物学意义。传统检测细胞 方法往往采用计数的方法，该方法虽然简单，但是需要操作人员具有丰富的经验， 因此存在一定的人为误差。关于细胞活性的检测方法，生物学上往往采用细胞染 色的方法，即用t r y p a nb l u e 或m t t 染色”3 ，然后进行形态学观察，根据被染 色细胞数目的多少来确定细胞的生物活性，或用s u l f o r h o d a m i n eb 对细胞的总蛋 白染色，通过细胞总蛋白的多少问接反映细胞的活性”1 。随后的生物学技术发展 到利用更为全面的手段，多方面表征细胞的生物活性或细胞受到外界环境改变时 所产生的复杂变化。例如，细胞中乳酸脱氢酶( l d h ) 的活性和细胞活性密切相关， 因而，采用l d h 试剂盒就可以判断细胞不同生长阶段l d h 的活性，从而阃接 的反映细胞的生物活性或化学品对细胞的毒性作用。如果细胞发生程序性死亡， 其d n a 和r n a 的含量都会发生显著变化，因此，采用琼脂糖”或变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳就可以对这种变化进行监测【引，流式细胞仪也可对这种变化进行表征 ”1 ，反映出细胞的生长周期。凋亡细胞还能通过特殊的酶联免疫试剂盒进行确定 ”3 。但是，不管是酶试剂盒、免疫试剂盒、还是电泳仪和流式细胞仪，都需要配 备专门的仪器，不仅价格昂贵，而且操作程序复杂。细胞在不同生长阶段，或接 触不同化学试剂后其活性的改变往往伴随着细胞内部某些蛋白的表达异常，因 此，采用聚丙稀酰胺凝胶电泳，结合w e s t e r n 杂交阳1 或特异性的蛋白免疫试剂盒 “、酶联免疫分析( e l i s a ) 目 i 可对某些蛋白的表达作出准确判断“，深入微观领 域了解化学品或外界环境对细胞生长的影响，但是由于免疫反应属于抗原一抗体 特异反应，而抗体的获取较为复杂，价格昂贵，该方法也存在一定的局限。利用 蛋白质融合技术，把荧光蛋白与目标蛋自融合形成荧光标记蛋白，通过荧光信号 的改变，或荧光信号所处的位景即可以反映出细胞的代谢途径，或是细胞生长过 程某些物质的变化“。虽然方法的灵敏度比较高，而且可以提供关于蛋白在亚 细胞单位中的定位信息，但是操作过程很复杂，特别是需要融合蛋白或表达相应 融合蛋白的基因。 正是由于生物学技术存在着很多应用局限，所以，越来越多的化学分析手段 逐渐应用于生物领域。细胞的某些化学信号与细胞的数量。活性密切相关，因此， 根据这些信号的变化同样可以反映出细胞的生长状态。其中，压电信号、电化学 阻抗信号、循环伏安信号、氧气消耗量、电化学扫描显微技术已经被广泛的应用 细胞屯化学与d n a 生物传感器的研究 于细胞活性的测定。当某蝗药物或化学品对细胞作用后，导致细胞膜上离子通道 的改变，引起k + 、n a + 、c a “等离子电流发生变化，运用膜片钳技术，可以很容 易地监测这种电流信号的改变。下面就几种细胞研究的化学手段进行介绍。 1 1 1 电化学阻抗技术研究方法 电化学阻抗技术是一种以小振幅的正弦波( 或电流) 为扰动信弓的电化学测 量方法。由于以小振幅的电信号对体系扰动，一方面可以避免刑体系产生大的影 响，另一方面也使得扰动与体系的响应之间近似呈直线关系，使得测量结果的数 学处理变得简单。同时，电化学阻抗方法又是一种频率域的测量方法，它以测量 范围很宽的阻抗谱来研究电极系统，因而能比其它常规电化学方法得到更多的动 力学信息及电极界面结构的信息。如：可以通过阻抗结果中含有的时间常数个数 及其数值大小推测影响电极过程的状态变量的情况；从阻抗结果观察电极过程中 有无传质过程的影响等等。即使对简单的电极系统，也可以从测得的一个时间常 数的阻抗结果中，在不同的频率范围得到有关从参比电极到工作电极之问的溶液 电阻，电双层电容及电极反应电阻的信息“。贴壁生长的细胞在不同生长阶段， 其附着在基质上的数目是不同的，当细胞面i 临毒性试剂，化学品，或生物方法处 理后，其形态学发生改变“4 “1 ，粘贴在基质上的能力会发生改变“”。，并且数 目也会产生明显的变化。如果基质为电极传感材料，那么细胞的上述变化都会导 致电极表面性质的改变。正是由于电化学阻抗可以灵敏的反映这种改变，所以， 电化学阻抗已经发展成为一种有效的监测细胞活性及药物对细胞作用的方法。 x i a o 等人用电化学阻抗技术研究纤维原细胞的生长状况，以及毒性试剂对该细 胞的活性影响“。他们将工作电极和对电极( 均为金电极) 置于培养瓶底部， 加入培养基后，整个回路的阻抗由两个金电极和培养基质问的界面电阻和培养基 质的电阻组成，但是由于对电极的面积远远大于工作电极的面积，因此，对电极 表面的阻抗可以忽略，整个回路的阻抗主要由工作电极表面的阻抗来决定。因此 阻抗的改变即可反映细胞生长状态的改变。加入细胞毒性试剂，如c d c l 2 、 n a h a s s 0 4 或b a k ，都会导致测量阻抗值得下降，表明细胞的生长受到了抑制。 同时，根据该方法，它们还拟合出上述三种物质对细胞杀伤一半所需要的量，即 半数致死量。活细胞的电场效应主要集中在细胞膜上，定量评估这一效应可以提 供很多有用的化学信息。s o t o y a m a 等利用多功能微电极( m m e ) 系统在线分析 了烟草细胞b y - 2 的膜电阻。“。通过电容和电阻组成的线性回路模型，对m m e s ， 细胞间的膜电阻，以及细胞与基质之间的膜电阻分别为3 0 0m q ，1 7g q 和4 7 6 0 m q 。x i n g 等基于电化学阻抗技术发展了一种实时电子传感系统，可以监测细胞 的活性以及药物的细胞毒性。“。他们将金电极做成阵列形式，固定于培养板底 部，细胞状态的改变可以以电化学阻抗参数的变化得到反映。他们成功的评价了 硕+ 学位论文 砷化物，汞和重铬酸盐的细胞毒性，并发现，该方法具有中性红吞噬实验一样的 灵敏度。而且可以监测快速作用的药物毒性，提供药物的相关动力学参数。除了 直接监测细胞的生长状况之外，还可以对电极表面进行修饰，即修饰某些细胞表 面表达的抗原的抗体，再通过免疫反应吸附细胞，从阻抗的改变检测细胞。y a n g 等首先将0 1 5 7 ：h 7 的抗体非常方便的固定在i t o 电极( 阵列) 表面，然后根据 免疫反应直接检测细胞的数目”“。 1 1 2 压电化学技术 压电化学是一种非常灵敏的检测技术。在压电晶体表面交联待测微生物的抗 体，通过抗体与微生物之间的特异性结合，导致晶体负载增加，使谐振频率发生 变化，从而可以对微生物进行检测。其中，质量响应和非质量响应都得到了应用。 质量响应方面主要是晶体上修饰了待测微生物的抗体，微生物的特异结合导致了 晶体质量负载增加。如用抗i g g 修饰的电极测定葡萄球菌和衣原体“。2 “。由于微 生物生长不同时期，其代谢产物，培养基质的物理化学性质存在不同，压电的非 质量效应可以对这些变化产生响应，从而反映微生物的生长状态，实现检测。 h e 等基于培养基溶液化学性质的改变，用串联式“”和单脱开式”“压电传感器检 测了大肠杆菌的数目及其生长速度，测定范围为1 0 一1 07 c e l l m l 。b a o 等基于培养 基的凝固，提出了一种测定细菌的方法，并以此测定了大肠杆菌和溶壁微球菌的 生长”7 2 。t a n 等研制了p q c 氨传感器，测定普通变形菌的生长过程中产生的 氨气，来间接反映其生长状况”，还测定了细菌对抗生素的敏感性和抗生素的 最低有效限制浓度”。根据a 一淀粉酶对淀粉的水解原理，通过在培养基中加入 水溶性淀粉，用压电阻抗法监测了枯草杆菌的生长过程，推导了细菌生长的阻抗 模型，得到了一系列的生长动力学参数，分析了a 一淀粉酶在细菌生长过程中的 活力变化“。分子印记技术( m i p ) 已经成为一种非常成熟的分离技术。它可以 模拟自然界抗原和抗体的相互作用，取代天然的抗原或抗体，在分析领域得到，。 泛应用。通过表面印记，可以把细胞固定在电极表面，再通过压电的质量响应实 现对细胞的检测。d i c k e r t 等合成了固定整个酵母细胞的分予印记膜，对酵母细 胞的检测线性范围达到1 0 4 1 0 9c e l l s m l ，检测的灵敏度为3 0 0 0 4 0 0 0c e l l s 1 k h z 【32 l 。 1 1 3 电化学扫描显微镜技术 扫描电化学显微镜是8 0 年代末由b a r d d 、组提出和发展起来的一种扫描探针 显微技术。它是基于7 0 年代末超微电极及8 0 年代初扫描隧道显微镜的发展而产生 出来的一种分辨率介于普通光学显微镜与s t m 之间的电化学现场检测新技术。由 于其具有化学灵敏性，因而不但可以研究探头和基底上的异相反应动力学及探头 和基底之间溶液层中的均相反应动力学，分辨电极表面微区的电化学不均匀性等 o 细胞电化学与d n a 生物传感器的研究 信息，而且可以提供更多的直接电化学信息f 3 3 】。其主要由两部分组成：一是电 化学部分，二是s t m 部分。电化学测量由三电极系统构成，三者放在一个电解池 中。通过恒电位仪，对发生在电极表面的化学反应进行监控、测量电荷传递、物 种变化、动力学及热力学参数，也可以通过加工控制系统，对材料表面进行原子 级加工等”“。癌细胞和正常细胞的氧化还原状态可能存在不同，用扫描电化学 显微技术就可以对细胞内部的这种不同进行表征。f e n g 等首次采用扫描电化学显 微镜，并结合荧光显微镜对恶化的乳腺癌细胞( m d a m b 一2 3 1 ) 和未恶化的人乳 腺上皮细胞( m c f - 1 0 a ) 的氧化还原位点分布进行了深入研究，揭示了两种不 同细胞的形态学以及氧化还原活性点的密度分布区别”3 。l i u 等人的扫描电化学 研究结果表明，乳腺癌细胞内部的氧化还原物质活性可以在细胞无损伤的情况 下，通过氧化还原传递中间体的再生得到反映。而细胞内氧化还原中心的活性物 质浓度，膜对传递体的渗透速率都会影响测量结果。不同细胞中电子传递的速率 或不同电子传递中间体在同一细胞中的电子传递速率可以通过对扫描电化学测 量结果的动力学分析得到。从而对癌症细胞的恶化程度做出初步判断。”1 。c a i 等 人分别以疏水和亲水的电化学活性中间体，用扫描电化学对r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 细菌进行研究，计算了电子的跨膜传递通道及其传递速率，结果显示， 细胞膜对不同的物质的渗透力是不同的，而且其渗透通道存在不同。“。 1 1 4 循环伏安技术 循环伏安是一种常用的电化学技术，是以快速线性扫描的方式将激发电压施 加于极化池上，从起始电位开始，电位沿某一方向线性变化至终止电位，然后立 即换向回到起始电位。如果没有停止命令，上述过程将不断重复。循环伏安曲线 包括上下两个部分，上部分是电化学活性物质的还原态氧化形成的氧化波，被称 为氧化分支或阳极分支；下部分为还原分支或阴极分支。通过物质的循环伏安行 为可以判断电极过程、电极吸附过程等电化学现象。细胞内部或表面及细胞代谢 物存在有电活性的物质，因此，通过循环伏安技术，就可以对这种电活性的物质 进行初步表征。也j 下是由于细胞的活性和这些电信号之间存在着非常密切的关 系，所以利用循环伏安技术就可以检测细胞的数目或对细胞的生长状况进行监 测。m a t s u n a g a 研究小组首先运用该技术对s c e r v i s i a e 进行了研究，发现s c e r v i s i a e 溶液在0 7 4 v 左右存在一个氧化峰( 工作电极为热裂解石墨电极) ，没有还原峰出 现，而且这个氧化峰电流随扫描图数的增加反而下降，表明，s c e r v i s i a e 的电极 行为是不可逆的。氧化峰电流的大小和细胞的浓度有一定的线性关系”。f e n g 等人成功的利用循环伏安技术记录了t s h a n g h a i e n s i s 的生长曲线，并且评估了一 些药物对该微生物的生长抑制作用”。s u b r a h m a n y a m 等用类似的方法研究了 a s p e r g i l l u st e r r e u s 的生长情况，但是它们采用的工作电极是金电极。另外，它们 坝士学位论文 发珊s p e r g i l l u st e r r e u s 不像其它已经报道的微生物那样在p b s 中可以产生电化学 信号，而是必须在培养基中才有电信号。当然，这种循环伏安信号也是不可逆的 ”。既然微生物可以产生循环伏安信号，那么动物细胞或许也具有类似的性质。 还是m a t s u n a g a d x 组第一次报道了动物细胞的循环伏安行为，以老鼠的嗜碱性白 细胞( r b l 1 ) 为检测对象，热裂解石墨电极为工作电极。发现，r b l l 细胞可 以在0 3 4v 和0 6 5v 给出两个不可逆的氧化峰。0 3 4v 处的氧化峰电流与r b l 一1 的数目有一定的线性关系，而且根据峰电流大小可以判断过敏性反应“。随后， f e n g 研究小组报道了白血病细胞株u 9 3 7 在电极表面的循环伏安行为，评价了咖 啡酸的抑癌作用( 针对u 9 3 7 细胞) ，结果表明，u 9 3 7 细胞在0 6 4v 存在不可逆的 氧化峰，峰电流大小和细胞状况有关，咖啡酸对u 9 3 7 具有比较明显的抑制作用 “。l i d 组发现，骨髓红细胞的氧化峰出现在0 7 3 0 0 3 和0 8 3 0 0 2v ，骨髓白 细胞的氧化峰出现在0 3 2 0 0 3v 。但是当白血病人经过一段时间治疗后，其红 细胞o 8 3v 处的氧化峰消失，表明，红细胞的氧化还原行为与白血病的最初状 态有很大的关系，因此，根据这个现象，可以快速、简单的诊断白血病“。但 是，无论是微生物还是其它白血病细胞、淋巴细胞，生长状态都是悬浮的，贴壁 生长细胞的循环伏安电化学报道较少。虽然循环伏安对仪器要求较低，操作过程 简单，而且不需要把传感元件放入培养箱中，但是，该技术不能对细胞的生长进 行在线检测。 1 1 5 膜片钳技术 细胞间与细胞内的通信，依靠其膜上的离子通道来进行。离子和离子通道是 细胞兴奋性的基础，也是产生生物电现象的基础，与细胞的活性也有很大的关系。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作胞内记录，自4 0 年代末细胞膜和离子学说 建立以来，细胞的电活动的研究逐渐深入。1 9 7 6 1 9 8 1 年期间，两位德国细胞生 物学家开创了膜片钳技术，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化。 膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接 可测量多种膜通道电流，其值可以小至t j p a 级，是一种典型的低噪音测量技术， 达到了当今电子测量的极限。膜片钳技术发展至今，已成为现代细胞电生理研究 的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且在间接或直接为临 床医学服务方面，正在产生积极的效果。其原理为，利用负反馈电子线路，将微 电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通 过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。技术的关键是在玻 璃微电极间断边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达1 0 一1 0 0g q 。由 于该电阻值很高，故基本上可看作绝缘，其上的电流可看成为零。细胞膜上离子 的流动引起电流变化，通过负反馈电流可以反映该电流大小。冷强等，用膜片钳 硕士学位论文 发现一s p e r g i l l u st e r r e u s 不像其它已经报道的微生物那样在p b s 中可以产牛电化学 信号，而是必须在培养基巾爿有电信号。当然，这种循环伏安信号也是不可逆的 “。既然微生物可蚍产生循环伏安信号，那么动物细胞或许电具有类似的性质。 还是m a t s u n a g a z j x 组第一次报道了动物细胞的循环伏安行为，以老鼠的嗜碱性白 细胞( r b l 1 ) 为检测对象，热裂解石墨电极为工作电极。发现，r b l 1 细胞可 以在0 3 4v 和0 6 5v 给m 两个不可逆的氧化峰。0 3 4v 处的氧化峰电流与r b l 1 的数目有一定的线性关系，而且根据峰电流大小可以判断过敏性反应“。随后， f e n g 研究小组报道了白血病细胞株u 9 3 7 在电极表面的循环伏安行为，评价了咖 啡酸的抑癌作用( 针对u 9 3 7 细胞) ，结果表明，u 9 3 7 细胞在0 6 4v 存在不可逆的 氧化峰，峰电流大小和细胞状况有关，咖啡酸对u 9 3 7 具有比较明显的抑制作用 ”1 。l 孙组发现，骨髓红细胞的氧化峰出现在0 7 3 - - 0 0 3 和0 8 3 0 0 2v ，骨髓白 细胞的氧化峰出现在0 3 2 - - 0 0 3v 。但是当自血病人经过一段时间治疗后，其红 细胞0 8 3v 处的氧化峰消失，表明，红细胞的氧化还原行为与白血病的最初状 态有很大的关系，因此，根据这个现象，可以快速、简单的诊断白血病。4 “。但 是，无论是微生物还是其它白血病细胞、淋巴细胞，生长状态都是悬浮的，贴壁 生长细胞的循环伏安电化学报道较少。虽然循环伏安对仪器要求较低，操作过程 简单，而且不需要把传感元件放入培养箱中，但足，该技术不能对细胞的生长进 行在线检测。 1 ，1 5 膜片钳技术 细胞问与细胞内的通信，依靠其膜上的离子通道来进行。离子和离子通道是 细胞兴奋性的基础，也是产生生物电现象的基础，与细胞的活性也有很大的关系。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作胞内记录，白4 0 年代末细胞膜和离子学说 建立以来，细胞的电活动的研究逐渐深入。1 9 7 6 1 9 8 1 年期间，两位德国细胞生 物学家开创了膜片钳技术，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化。 膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接 可测量多种膜通道电流，其值可以小到p a 级，是一种典型的低噪音测量技术， 达到了当今电子测量的极限。膜片钳技术发展至今，已成为现代细胞电生理研究 的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且在间接或直接为i 临 床医学服务方面，正在产生积极的效果。其原理为，利用负反馈电子线路，将微 电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通 过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。技术的关键是在玻 璃微电极间断边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达1 0 - 1 0 0g q 。由 于该电阻值很高，故基奉上可看作绝缘，其上的电流可看成为零。细胞膜上离了= 的流动引起电流变化，通过负反馈电流可以反映该电流大小。冷强等，用膜片钼 的流动引起电流变化，通过负反馈电流可以反映该电流大小。冷强等，用膜片钼 细胞电化学与d n a 生物传感器的研究 技术全面记录了蚕豆保卫细胞原生质体内向钾离子电流，并探讨了乙酰胆碱对该 电流的影响。与此同时，乙酰胆碱受体的拮抗剂d 一管箭毒和阿托品的抑制作用也 得到揭示”“。山莨菪碱可以影响家兔心室肌细胞l 一型钙通道。当山莨菪碱浓度低 于0 1m m o l l 时，其对该通道影响不明显，但是当浓度高于o 2m m o l l 时，其对 该通道有抑制作用，并随着浓度的增大，作用增大“。谷贵山等人报道了阿霉 素对骨肉瘤及其耐药细胞钙离子通道的影响，结果表明，阿霉索对两种细胞的钙 离子通道都有抑制作用“。王丽娟等研究了灯盏花素对豚鼠单一心室肌细胞钙 离子电流的影响。发现，灯盏花素可以明显抑制心室肌细胞的钙离子通道，使钙 离子电流减小，而且此作用有明显的电压依赖性，剂量依赖性和可复性，在峰电 流作用下最明显，而对反转电位无明显影响”“。 11 ，6 其它非生物技术的活细胞研究 动物细胞以及好氧微生物在生长代谢中会消耗基质中的氧气，从而导致培养 基中溶解氧的浓度发生改变。因此，可以采用氧电极来判断细胞生长对氧气的消 耗，间接的反映细胞的生长状态。该方法非常简单，只要将氧电极浸入培养基中 检测氧气浓度即可，同时又可以实现在线检测。s o u s a 等利用氧电极评价了 c i p r o f l o x a c i n 对g i a r d i al a m b l i a ( a t c c3 0 9 5 7 ) 的毒性，并结合了t r y p a nb l u e 染色和 形态学观察( 光学显微镜和透射电镜) 技术。结果显示，细胞的代谢与氧气的消 耗密切相关，药物加入后，氧电极的检测信号发生明显变化，而且其变化是药物 浓度依赖性的”“。p h o e n i x 等把藻青菌放入硅士或硅酸盐溶液中进行生物矿化研 究。培养1 2 天后，溶液中形成了5u m 厚的矿石簇。主要是由于微生物的存在， 加速了f e s i 溶液的矿化过程，除了用透射电镜可以揭示这一过程之外，这些微 生物细胞的生物活性也通过氧电极进行了实时监测，发现，这些过程与光照有密 切关系1 。 把电极浸入细胞培养瓶底部，当细胞吸附之后，体系的开路电压与没有细胞 的时候存在很大不同，而不同生长时期的细胞，黏附在电极上的细胞数目，形态 也不同，当药物作用细胞后，其表面的状况也不会相同，因此，可以通过体系的 开路电压来反映细胞的生长过程。w o o l l e y 等就根据这个原理发展了实时监测细 胞生长及药物毒性的装置，成功地评价了一种铂类抗癌药物和抗生素对人卵巢癌 细胞a 2 7 8 0 的杀伤作用“。 磁传感器可以反映特别细微的质量改变，也是一种非常灵敏的传感元件。该 法的优点是可以对目标实现远距离离线检测，而不需要任何有线装置，这就使得 在线或离线检测变得非常简单易行，与表面声波传感器相比，价格相对较低，但 是灵敏度相当。尽管如此，磁传感器还是具有一定的缺点，即外界磁场的轻微改 变即可产生干扰。r u a n 等首先将大肠杆菌的抗体固定在基质上，通过免疫反应 硕士学位论文 结合待测的大肠杆菌，利用磁传感元件在1 0 2 1 0 6c e l l s m l 之间成功检测了大肠杆 菌的浓度”“。 毛细管电泳也是研究单细胞的一种非常有效的方法。如果在电泳液中加入- 定的促细胞裂解化合物，如s d s ，洋地黄皂苷等，便可以检测细胞内某些物质或 器官的变化，尤其是可以检测细胞在接受外界刺激后，特定酶的变化情况。d u f f y 等人首次报道了从不同细胞中分离出的线粒体在毛细管中的迁移行为，提供了一 种研究亚细胞器官的行之有效的方法”“。利用细胞的内吞作用，f u l l e r 等把荧光 颗粒植入到鼠骨肉瘤细胞的酸性细胞器中。再通过毛细管电泳进行细胞裂解，器 官分离，从而达到检测细胞微器官的目的，并计算了相关的动力学常数。 z a b z d y r 等发展了一种分离检测单细胞内r n a 和蛋白质的毛细管电泳方法”“。 g u n a s e k e r a 等基于毛细管电泳技术，首次提出了在毛细管中进行单细胞的核酸分 析，先采用洋地黄皂苷处理细胞，然后再进行检测。其中，核酸结合蛋白的表达 有效的增加了检测的灵敏度，这也为研究亚细胞的不均一性提供了有效的方法。 h u 等也采用毛细管电泳技术研究了单细胞的周期依赖性蛋白的指纹图谱，发现， 在不同的细胞周期，蛋白表达的种类也不一致，而且同种蛋白的表达量也是不相 同的“。a n d e r s o n 等用激光诱导荧光毛细管电泳研究了道诺霉素作用癌细胞 n s 1 后，其浓度及其代谢产物的改变。细胞在毛细管中裂解可以减少细胞在毛 细管外处理带来的目标物损失，从而增加了检测的准确性“。s u n 等运用毛细管 电泳在线检测了单个红细胞内部葡萄糖6 磷酸脱氢酶的活性，其检测限达到了 1 3z m o l ，为研究细胞内部特定酶与细胞活性之间的关系提供了一种行之有效的 方法1 。 1 2d n a 生物传感器的研究进展 d n a 是一种重要的生命遗传物质，在保持生物稳定性方面起着积极的作用。 d n a 的突变研究也是揭示疾病发生的一个重要方面，往往由d n a 毒性试剂，辐 射等外界条件引起。生物上常常先通过凝胶电泳对目标d n a 或r n a 进行分离， 提纯，回收，然后用p c r ( 聚合酶链式反应) ，r t - p c r 对目标物进行扩增，再 反复提纯回收，最后进行d n a 或r n a 测序，从而找到基因的突变位点。最近 发展的一种酵母突变体，可以对细胞中p 5 3 突变基因进行监测。其原理是，酵母 基因上接有一段p 2 1 基因片段，该片段是腺嘌呤表达基因的增强子，如果待测基 因是野生型p 5 3 ，那么它会和p 2 1 基因结合，导致腺嘌呤表达，但是如果p 5 3 基 因发生突变，那么腺嘌呤的表达就被抑制，其表现形式是，酵母菌的颜色不同”。 根据此原理，即可判断p 5 3 基因的突变。虽然这种检测手段比较准确，直观，但 缺点是需要特殊的酵母突变株，而且操作复杂。相比于生物学手段，化学手段往 往可以快速，简单的提供一些有效信息，为生物学的深入研究提供指导。因此， 细胞电化学与d n a 生物传感器的研究 d n a 生物传感器的构建已经越来越受到化学研究者的关注，主要应用于d n a 的 检测及d n a 一物质相互作用的研究。 1 2 1d n a 传感器用于突变、杂交研究 d n a 的杂交是研究目标基因片段的重要方法，按所检测到信号的不同，d n a 传感器主要可以分为消失波传感器、声波传感器、光纤传感器、电化学传感器、 荧光检测器等。 12 11d n a 杂交消失波传感器 表面等离子共振就是一种常见的消失波传感装嚣。主要是检测折射指数的改 变，从而来预测d n a 在界面的杂交过程。为了增强s p r 的共振信号，金属纳米 粒子被广泛的应用于s p r 技术中。h e 等把纳米金颗粒修饰到传感表面，使得共 振信号的偏移增大了十倍，而最终的d n a 杂交检测结果显示，纳米会修饰后， d n a 杂交灵敏度扩增了1 0 0 0 倍左右，检测限达到了1 0p m ”。o l o f s s o n 等通过 生物素一生物亲和素的特异性反应把纳米金固定到了石英表面，再根据杂交前后 界面折射指数的改变定量的研究了d n a 的杂交以及错配”。h u t t e r 等人先通过 真空喷镀的方法把纳米金颗粒修饰到玻璃基质表面，然后通过自组装固定探针， 再杂交巯基标记的目标d n a ，接着再和纳米金颗粒自组装，由于进行了多层组 装，基质表面的折射指数发生很大的变化，从而可以灵敏的检测d n a 杂交“。 n e l s o n 等根据表面等离子成像技术对d n a 和r n a 在d n a 阵列上的吸附，杂交 过程进行了监测，并且定量检测了未标记的短链d n a ，同时也首次检测了从大 肠杆菌中分离出的1 6 s 的核糖体r n a ”“。与一般d n a 杂交检测不同，g o o d r i c h 等人并不是将探针固定在石英表面，然后根据杂交后界面物理性质的改变实现 d n a 杂交检测，而是先把r n a 以阵列形式固定在晶体表面，然后与目标d n a 杂交，杂交后，再加入r n a s eh 酶，由于该酶可以消化分解r n a - d n a 或r n a ， 所以会导致d n a r n a 复合物分解，r n a 从传感元件表面脱落，而d n a 不会损 失，继续和r n a 杂交，导致复合物再分解，周而复始，直到表面没有可以再利 用的r n a 为止。通过上述反复循环，最终界面的折射指数发生明显改变，根据 这一变化，便可以预测目标溶液中特定的d n a 片段，而不需要对目标基因进行 p c r 扩增“”。类似于表面等离子技术，m a l i c k a 等发展了d n a 检测的新方法， 即表面等离子耦合发射谱( s p c e ) 。它是根据处于激发态的荧光基团在基质表面 的不同发射状况来确定表面性质的变化”“。e k g a s i t 等把s p r 与荧光光谱技术结 合，精确的检测了固定在传感元件表面的双链d n a ，为d n a 的突变研究提供了 一种有效途径”“。r o b e l e k 等把量子点运用到表面等离子荧光成像技术中，成功 地检测了标记有量子点的目标d n a 。“。 - 8 硕+ 学位论文 1 2 12d n a 杂交声波传感器 厚度剪切模式