（外科学专业论文）hil10基因修饰骨髓间充质干细胞对大鼠异种肝移植的影响.pdf

一 ! ， ， f 世衄删删删舢删删 y18,rjll8|r rlll5l i i f 0 i i i i i1 8 i i i16lll i | 1 。 论文图片3 4 参考文献4 1 综述4 7 攻读硕士学位期问发表的学术论文：5 8 临床培训小结：5 9 致谢6 l 论文独创性声明6 2 论文使用授权声明一6 2 论文审阅认定书6 3 徐州医学院硕士学位论文 缩略词 g v h d t n f n d m e m e l i s a f b s f c m c d l 讧l 1 0 h e i l i f n - 3 , m h c h l a m s c s o d 乃 d a p i u v 英文全称 缩略词表 a b b r e v i a t i o n g r a f tv e r s u sh o s td i s e a s e t u m o rn e c r o s i sf a c t o r h e l p e rt c e l l 中文全称 移植物抗宿主病 肿瘤坏死因子 辅助性t 细胞 d u l b c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m达尔伯克必需基本培养基 e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附实验 f e t a lb o v i n es e r u m f l o wc y t o m e t r y 胎牛血清 流氏细胞仪 c l u s t e ro fd i f f e r e n t i a t i o n细胞分化群 h u m a ni n t e r l e u k i n1 0人白细胞介素1 0 h e m a t o x y l i n e o s i n苏木素一伊红 i n t e r l e u k i n白细胞介素 i n t e r f e r o n - 7 m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s o p t i c a ld e n s i t y h e l p e rt c e l l 4 ，6 - d i a m i n o - 2 一p h e n y li n d o l e u l t r a v i o l e t 干扰素吖 主要组织相容性复合体 人类白细胞抗原 间充质干细胞 光密度值 辅助性t 细胞 4 , 6 二氨基一2 一苯基吲哚 紫外线 徐州医学院硕士学位论文 hll - io 基因修饰骨髓间充质干细胞对大鼠异种肝移植的 影响 中文摘要 目的1 成功建立豚鼠对大鼠非协调性异种肝移植模型。2 探讨人白介素1 0 ( h u m a ni n t e r l e u k i n1 0 ，h i l 1 0 ) 基因修饰的骨髓间充质干细胞( m a r r o w m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 对大鼠原位异种肝移植的免疫反应的作用及其机 制。 方法1 通过对传统“二袖套 法肝移植手术在灌注、吻合等方面进行改良， 建立稳定的豚鼠至大鼠的非协调性异种肝移植模型，并分预实验和正式试验两组 进行手术时间和手术成功率的比较。2 通过f i o c l l 分离法分离骨髓单个核细胞， 体外贴壁培养扩增出m s c 并对其鉴别。复苏h i l 1 0 修饰的m s c s 进行培养，用 d a p i 染色剂进行荧光标记，并在构建肝移植模型过程中分组施加不同的处理方式 ( 生理盐水+ 地塞米松、m s c + 地塞米松、h i l 1 0 m s c + 地塞米松) ，分别为空白对 照组、m s c 组和h i l 1 0 m s c 组。观察受鼠的存活时间、肝功能情况，对术后2 4 小时移植肝组织的i l 2 、i l 4 、i l 1 0 、i l 1 2 、i l 1 5 、i l 1 8 、t n f q 进行检测。 在术后1 天、3 天分别对h l l 1 0 m s c 组受鼠肝脏组织进行病理切片，并在荧光显 微镜下观察。 结果1 通过对传统“二袖套”法进行改良，并在大量手术的基础上，使肝移 植模型的建立大大缩短了手术时间，提高了手术成功率，并成功建立了稳定的豚 鼠对w i s t a r 大鼠的非协调性异种肝移植大鼠模型。2 通过观察以及各项指标的检 测发现，h l l 1 0 m s c 组与空白组、m s c 组相比，大鼠生存时间延长、肝功能好转、 细胞因子i l 2 、i l 1 2 、i l 1 5 、i l 1 8 、t n f q 表达明显降低，i l - 4 、i l 一1 0 表达显 著升高。而且通过肝脏组织病理切片发现肝组织结构有一定恢复，并可发现大量 荧光染色细胞。 2 一- 一一 徐州医学院硕士学位论文 结论1 本实验通过大量手术操作经验的积累以及对手术方式的改进，明显提 高了手术成功率，可用作大鼠异种肝移植实验可靠动物模型的制作。2 h i l 1 0 修饰 的骨髓间充质干细胞对移植肝脏的保护作用可能通过其可抑制i l 2 、i l 1 2 、i l 1 5 、 i l 1 8 、t n f a 细胞因子的表达以及促进细胞因子i l 4 、i l 1 0 的表达来实现。 关键词间充质干细胞；h i l 一1 0 ；异种肝移植；免疫耐受 徐州医学院硕士学位论文 a ne x p e r i m e n t a ls t u d yo nt h er o l eo fh l l - 1 0 - m e s e n c h y m a l s t e mc e l l si nr a tl i v e rx e n o t r a n s p l a n t a t i o n a b s t r a c t o b j e c t i v e 1 t oe s t a b l i s ht h en o n c o o r d i n a t i o nr a tm o d e lo fl i v e r x e n o t r a n s p l a n t a t i o n 2 t oo b s e r v et h ei n f l u e n c eo f1 1 i l - 10 - m e s e n c h y n a ls t e mc e i l so n r e j e c t i o nf o l l o w i n gl i v e rx e n o t r a n s p l a n t a t i o ni nr a t s m e t h o d s 1 b yi m p r o v i n g t h et r a d i t i o n a l t w o - c u f f m e t h o do fl i v e r t r a n s p l a n t a t i o no np e r f u s i o n ，a n a s t o m o s i se t e ，w ee s t a b l i s h e das t a b l em o d e lo ni i v e r x e n o t r a n s p l a n t a t i o nf r o mc a v i at or a t ，a n dd i v i d e dt h ea n i m a li n t op r e l i m i n a r ya n d f o r m a lt e s t st oc o m p a r et i m ea n ds u c c e s sr a t eo fo p e r a t i o n 2 m o n o n u c l e a rc e l l s ( m n c s ) w e r es e p a r a t e db yc e n t r i f u g a t i o ni nf i c o l ls o l u t i o nf r o mb o n em a n o w , t h e nb m s c s w e r ei s o l a t e da n d p u r i f i e db y t h e w a l l a d h e r i n g m e t h o d w er e c o v e r e d l l i l - 10 一m e s e n c h y n a ls t e mc e l l sa n dm a r k e dt h ec e l l s 埘t l ld a p if l u o r e s c e n td y e ，t h e g r o u p sw e r ed e v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p m s c sg r o u pa n dl l i l - 10 一m s c sg r o u p s u r v i v a l t i m ea n dl i v e rf u n c t i o no fr e c i p i e n t sw e r eo b s e r v e da n dc o n c e n t r a t i o no fi l - 2 ，i l 4 ， i l - l0 ，i l l2 ，i l - l5 ，i l 一18a n dt n f ae x p r e s s i o ni nl i v e r sw e r em e a s u r e db ye l i s a2 4 h o u r sa f t e rt r a n s p l a n t a t i o n t h el i v e rp a t h o l o g i c a le x a m i n a t i o nw e r ep r o c e e d e di n l 讧l - 10 一m s c sg r o u pla n d3d a y sl a t e r r e s u l t s i b ym e a n so fi m p r o v i n gt h et r a d i t i o n a l ”t w o - c u f f m e t h o do fl i v e r t r a n s p l a n t a t i o na n dl o t so fo p r a t i o n a le x p e r i e n c e ，t h eo p e r a t i n gt i m eh a db e e ns h o r t e n l a r g e l ya n dt h es u c c e s sr a t eo fo p e r a t i o nw a si m p r o v e d 2 c o m p a r i n gt ot h ec o n t r o la n d m s c sg r o u p s ，t h eh i l 一10 - m s c sg r o u p ss u r v i v a lt i m ew a sp r o l o n g e d ，l i v e rf u n c t i o n w a sb e t t e r , t h ec o n c e n t r a t i o no fi l 一2 ，i l 12 ，i l 一15 ，i l - 18a n dt n f g tw e r es i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d ，b u ti l - 4 ，i l 一10w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d f r o mt h el i v e rb i o p s yw ef o u n d t h a tt h es t r u c t u r eo ft h el i v e rh a sac e r t a i nr e c o v e r y , a n dal a r g en u m b e ro ff l u o r e s c e n t c e l l si nt h el i v e r c o n c l u s i o n1 1 1 1 es t a b l en o n - c o o r d i n a t i o nr a tm o d e lo fl i v e rx e n o t r a n s p l a n t a t i o n w e r ee s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y 2 h i l - 10 - m s c sc a np r o t e c tt h ei m p l a n t e dl i v e rf r o m r e j e c t i o nb y m e a n so fd e c r e a s i n gt h ee x p r e s s i o no fi l 一2 ，i l 一12 ，i l - 15 ，i l 一18 ，a n d t n f c 【a n di n c r e a s i n gi l - 4a n di l - 10i nt h el i v e r 4 徐卅医学院硕士擎侄琵= 爻一一1 一 1 乓 翩舌 近年来移植技术的发展为一些终末期疾病、恶性肿瘤等多种难治性疾病提供 了一个突破性的治疗方案。目前由于肝移植的迅猛发展，供肝不足的矛盾越来越 突出，异种肝移植有望解决此矛盾。移植医学正在发生着从应用化学免疫抑制剂 向调节细胞和组织功能特性的典型转变，异种移植对临床医学家、移植免疫学家 提出更高挑战的。成功的移植物依赖许多因素，为减少移植后排斥反应的发生， 常在移植前使用免疫抑制剂或以亚致死剂量放射线照射受体，给受者造成很大的 伤害，且未能收到理想的效果，而且在移植后也要长期使用免疫抑制剂。但临床 应用后的毒性作用以及长期应用后潜在的致命副作用要求我们探索新的、特异的 治疗手段。近几年基因治疗应用于器官移植领域引起广泛关注，大量研究使得转 移基因在特异器官的表达、细胞类型及载体类型、给予途径、毒性、启动子特性 等多方面的应用更为理想。基因治疗方法学与移植免疫学这两个并行发展领域的 交叉为提高临床移植病人的免疫抑制疗效提供了巨大潜力。 间充质干细胞( m s c s ) 是一类非造血干细胞，在适宜的条件下可以分化为多 种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、神经细胞等【l 】。存在于骨髓中 m s c 称为b m s c s 。近些年的研究发现m s c s 除具有多向分化，支持造血并促进体 内造血重建功能外，还具有下调同种异体免疫反应及降低移植物抗宿主反应( g r a f t v e r s u sh o s tr e a c t i o n d i s e a s e ，g v h 刚d ) 发生的作用【2 羽。小鼠的移植实验及临床的l 、 i i 期研究都发现，m s c s 与造血干细胞共输注可以降低异基因造血干细胞植入引起 的g v h d 。b a r t h o f o m e w t 6 1 等亦发现体内静脉输注m s c s 则能延长灵长类动物同种 异体皮肤移植物的存活时间，提示m s c s 在体内可发挥免疫抑制效应，抑制同种 异体排斥反应。现在利用m s c s 的低免疫原性和抑制免疫反应的功能，在细胞移 植、器官移植等方面的应用研究己成为热点。 白介素1 0 ( i n t e r l e u k i n1 0 ，i l 1 0 ) 最初是由f i o r e n t i o n 等【7 1 于1 9 8 9 年发现的一种 6 徐州医学院硕士学位论文 由t h 2 分泌的细胞因子，能抑制t h l 细胞株细胞因子m r n a 的转录。i l 1 0 是一 个多效性细胞因子。近年来对i l 1 0 的研究重点集中在它的免疫抑制活性上，并以 此为基础来确定i l 1 0 在移植、肿瘤和艾滋病中的作用。i l 1 0 由多种细胞，包括 淋巴细胞与非淋巴细胞白发或在多种因素影响下产生【8 1 ，能显著抑制移植排斥反 应中i l 2 、i l 1 2 、i l 1 5 、i l 1 8 、t n f a 等t h l 型细胞因子的表达，促进t h 2 型 细胞因子i l 4 的表达，使免疫反应由t h l 型向t h 2 型偏移，从而降低免疫排斥反应 【9 1 。i l 1 0 能抑制a p c 合成分泌i l 1 2 和t n f a 的能力，降低单核细胞的粘附能力， 降低i f n - y 或i l - 4 诱导的单核细胞m h ci i 类抗原和i c a m - 1 ( c d 5 4 ) 、b 7 一i ( c d 8 0 ) 及b 7 2 ( c d 8 6 ) 等共刺激分子的表达，抑制单核细胞分泌多种因子，从而抑制抗原 提呈细胞功能，促使t 细胞无能，诱导免疫耐受的形成【1 0 1 。q i n 等【1 l 】发现逆转录 病毒转染i l 1 0 可以延长大鼠心脏移植物的存活。 随着分子生物学的发展，基因治疗用于诱导移植免疫耐受的研究取得了很大 进展，选择合适的治疗性目的基因是基因治疗研究的关键。此外，选择恰当的载 体，使目的基因靶向、可控并有效地表达也是影响基因治疗成功的因素。m s c s 具 有独特的细胞增殖分裂模式，可使外源基因易于导入和表达【1 2 1 。i l 1 0 是重要的负 调节细胞因子，而m s c 仅少量分泌i l 1 0 ( 7 8p g m l ) t 1 3 1 。人、鼠的i l 1 0 有高度 的同源性和多种相同的生理功能，但鼠i l 1 0 却没有人i l 1 0 的一些t 细胞刺激活 性。人i l 1 0 可作用于鼠细胞，而鼠i l 1 0 对人细胞并不起作用4 1 。如果将在免疫 调节中像h i l 1 0 起负调节的细胞因子的基因导入m s c s ，以获得m s c s 对该因子 的高表达。再将其输注如供体体内，即可获的对m s c s 免疫抑制作用的放大，或 能成为抗抑制排斥治疗新途径。 本研究通过改良“二袖套 法建立稳定的大鼠异种肝移植模型，成功复苏培 养h i l 1 0 基因修饰的m s c s ，并在建立模型过程中将修饰的细胞加入到受鼠体内， 探讨h i l 1 0 基因修饰的m s c s 作为降低异种移植免疫排斥反应的基因治疗的可行 性，并为进一步实验提供研究基础。 7 第一部分豚鼠至大鼠异种肝移植模型的建立 自1 9 6 3 年s t a r z l 实施世界上第一例人体肝移植以来，肝移植已成为治疗终末 期肝病以及肝癌的有效手段。然而供体来源短缺是器官移植发展的一大瓶颈，因 此异种移植的发展越来越受到关注。豚鼠至大鼠原位异种肝移植是非协调性异种 肝移植研究的常用模型。本实验中我们在传统“二套袖”法【1 5 1 基础上进行改进， 在积累大量手术经验的基础上成功建立稳定异种肝移植模型，为后续试验提供坚 实基础。 材料和方法 1 材料 1 1 实验动物 供体采用清洁级雄性豚鼠，体重1 6 0 - 2 0 0 9 ；受体为清洁级雄性w i s t a r 大鼠， 体重1 8 0 - 2 2 0 9 ( 徐州医学院动物中心提供) 。体重增至2 5 0 - 3 0 0 9 后可作为供受体 ( 受体体重高于供体约5 0 9 左右) 行异种肝移植术。 1 2 实验器具 显微外科手术器械包上海医疗器械集团有限公司手术器械厂 s a t i n s k y 钳 上海医疗器械集团有限公司手术器械厂 5 - 0 的丝线上海医疗器械有限公司 7 0 用无损伤缝合线上海医疗器械有限公司 5 f 和7 f 的心导管外鞘上海医疗器械有限公司 硬膜外麻醉导管上海医疗器械有限公司 1 3 试剂 乳酸林格氏液浙江济民制药有限公司 肝素纳 万邦医药 8 徐州医学院硕士学位论文 地塞米松 硫酸庆大霉素 氯胺酮 乙醚 2 方法 2 1 动物分组 福建古田药业 万邦医药 万邦医药 万邦医药 实验将5 0 只豚鼠及5 0 只大鼠通过随机法配对，并分为手术练习( 1 0 对) 和 实验组( 4 0 对) 两组进行异种肝移植手术，其中实验组又分为预实验( 2 0 对) 和 正式实验( 2 0 对) 两组。 2 2 术前准备 2 2 1 套管制备：门静脉及肝下下腔静脉套管分别用5 f 和7 f 的心导管外鞘的外鞘 制成，套管长度均为3m n ，套管中间刻浅凹槽以利结扎，均留有约1 5i u l l 的套 管柄以利于夹持；胆道支架管用硬膜外麻醉导管制成，长约4m m ，外径约1 0n l l l l ， 两端剪成斜形 2 2 2 动物准备：供受体术前禁食12h ，不禁水。术前3 0 m i n 经尾静脉注射地塞米 松( 3 m g k g ) 。供体麻醉用盐酸氯胺酮按l o o m g k g 行腹腔注射，受体麻醉用半量 氯胺酮( 5 0 m g k g ) 腹腔注射并辅以乙醚半开放式吸入麻醉。双人裸眼直视下清洁 手术。 2 3 供体手术 豚鼠取仰卧位固定于手术台上，术区备皮，碘伏消毒。取“十字 切口入腹， 充分显露肝脏。分离腰静脉，注射肝素钠等渗盐水2 m l ( 1 0 0 u m 1 ) ，使全身肝素化。 分离肝脏：顺次离断镰状韧带、左三角韧带，分离并结扎左膈下静脉。离断肝 胃韧带，游离尾状叶，结扎左肝至食管的交通血管，游离肝右侧所有韧带。胆 总管支架置入：翻起肝叶，游离胆总管，于左右肝管汇合处5 m m 处切开胆管前壁， 向近端方向置入胆总管支架，5 - 0 丝线固定，切断胆总管远端。肝下下腔静脉和 9 一一一 一一一一 一。一一 徐州医学院硕士学位论文 门静脉的处理：游离门静脉至脾静脉处，用无损伤缝线紧贴门静脉结扎幽门静脉 并切断。结扎切断肝动脉。游离肝下下腔静脉及其分支的周围结缔组织，靠近主 干结扎切断左肾静脉。结扎左肾上腺静脉。保留足够长度右肾静脉和右髂静脉， 约分叉后5 m m 。肝脏灌注：分离腹主动脉，刺入头皮针，用血管夹固定( 在髂 总动脉上方将腹主动脉及下腔静脉一并钳夹阻断) ，持续注入4 。c 灌注液，作为灌 注道。剪开膈肌，用止血钳钳夹阻断胸主动脉。在右髂静脉处剪开下腔静脉作为 流出道i 。剪开膈肌进入胸腔，贴近膈肌剪断肝上下腔静脉，作为流出道i i 。此 时肝脏逐渐变为土黄色。取出供肝：结扎切断胃十二指肠动脉、胃左动脉、脾 动脉，于肠系膜上静脉于脾静脉汇合处切断门静脉，切断右肾静脉及髂静脉，将 供肝完整取出，置于4 * c 孚l 酸钠林格氏液中保存。 2 4 修肝及袖套制作 操作位于4 乳酸钠林格氏液水域中进行。剪除肝下下腔静脉及门静脉周围脂 肪组织，仔细分离右肾上腺并去除，剪去多余膈肌及肝上下腔静脉，保留其前壁 膈肌环l m m 左右。管套于门静脉断端，管柄位于门静脉前方，将门静脉壁外翻套 于套管上( 幽门静脉线节翻出于套管外壁) ，丝线结扎固定。于右肾静脉和右髂静 脉之间剪开形成喇叭口，常规完成肝下下腔静脉套管安装。完毕后置于4 c 孚l 酸钠 林格氏液保存备用。 2 5 受体手术 大鼠取仰卧位固定于手术台上，术区备皮，碘伏消毒。取正中切口入腹，用 自制拉钩牵拉左右腹壁，用湿纱布覆盖肠管及肝脏。分离肝脏方法同供鼠。游离 胆总管，近肝门处结扎，结扎切断肝动脉。游离门静脉至幽门静脉水平，游离肝 下下腔静脉，结扎切断右肾上腺静脉。用血管夹靠远端阻断肝下下腔静脉和门静 脉，自此开始计算肝缺血时间。自门静脉左右分叉处穿刺推入4 c 生理盐水2 m l ， 以将肝脏内血液输入体内。用s a t i n s k y 钳将肝上下腔静脉连同部分膈肌一并上钳 阻断，用橡皮泥固定s a t i n s k y 钳。依次剪断肝下下腔静脉、门静脉、肝上下腔静 1 0 一一 徐州医学院硕士学位论文 脉，移除肝脏。将供肝移入肝床，仔细吻合肝上下腔静脉。封闭血管前用自制小 钩针向肝上下腔静脉内推注生理盐水以排除血管及肝脏中的气泡。袖套法吻合门 静脉，结扎固定，放开门静脉血管夹及s a t i n s k y 钳，恢复入肝血流，结束无肝期。 袖套法吻合肝下下腔静脉，结扎固定。将胆总管支架远端插入受体胆总管，结扎 固定，并将大网膜覆盖于胆管套管周围。用温生理盐水冲洗腹腔、排列肠管，确 认无活动性出血后关腹。经尾静脉注射硫酸庆大霉素2 1 0 4 u 及地塞米松3 m g k g 。 灯照保暖复苏。受鼠术后lh 即可饮水，2 4h 恢复饮食。术后保持饲养环境清洁， 室温在2 5 左右。( 图1 ) 2 6 移植中 分别对肝移植术中的供体手术时间、修肝时间、无肝期、肝上下腔静脉阻断时 间、肝上下腔静脉吻合时间、冷缺血时间、受体手术时间进行计录。 2 7 移植后 密切注视、观察大鼠自主活动、呼吸动度和频率、对刺激的反应，若大鼠死 亡后均常规作尸解。术后存活2 4 h 判为手术成功。 3 统计学分析 所有统计学处理采用s p s s1 3 0 统计软件处理，结果用均数标准差( x s ) 或百分率( ) 表示，两样本均数的比较采用单因素方差分析( o n e w a ya n o v a ) ：多 样本均数的两两比较采用两因素方差分析( t w o w a y a n o v a ) ；两独立样本率的比较 用x2 检验，p 0 0 5 表示差异有显著性意义。 徐州医学院硕士学位论文 结果 l 手术成功率比较 实验通过改良二袖套法进行豚鼠至大鼠非协调性异种肝移植。试验组中操作 练习手术1 0 对，手术成功2 对，成功率2 0 ；预实验手术2 0 对，手术成功9 对， 成功率4 5 ；正式手术2 0 对，手术成功1 5 对，成功率7 5 。正式试验组与预实 验组相比较，正式试验成功率显著高于预实验( 尸 0 0 5 ) 。实验组中手术失败共1 6 对，失败原因总结如下。( 表1 ) 表l实验动物死亡原因统计 2 手术时间比较 通过对供受体术中各个时间计录可以看出，正式试验实验阶段的供体手术时 间、修肝时间、无肝期、肝上下腔静脉阻断时间、肝上下腔静脉吻合时间、冷缺 血时间和受体手术时间均显著低于预实验阶段( 尸 o 0 5 ) ，有统计学意义。( 表2 ) 1 2 一+ 徐州医学院硕士学位论文 一 一 表2 试验组相关时间统计 手术时间预实验( ，2 = 2 0 )正式试验( ，z = 2 0 ) 供体手术时间( m i n ) 5 3 5 5 34 8 5 3 5 修肝时间( m i n ) 1 6 6 1 61 4 8 1 4 无肝期( m i n ) 1 6 5 2 11 5 0 0 5 幸 肝上下腔静脉阻断时间( m i n )2 2 7 2 31 9 7 1 3 毒 肝上下腔静脉吻合时间( m i n ) 1 3 2 3 2 9 2 3 5 幸 冷缺血时间( m i n ) 9 2 3 4 1 8 5 8 3 6 幸 受体手术时间( m i n ) 4 0 3 5 33 8 5 3 8 幸 注相对于预实验组p 0 0 5 1 3 徐州医学院硕士学位论文 讨论 肝移植已应用于临床，但目前仍有很多问题有待解决。成功建立异种肝移植 模型无论是在临床实验，还是在基础研究中都具有重要的意义，要建立一个稳定 的实验动物模型并非易事，常需要系统的培训以及较长时间的手术训练。动物模 型的成功率和稳定性对基础研究有着最直接的影响，因此它是进行基础研究前必 须完成的首要任务。然而手术操作程序的复杂，血管吻合困难，无肝期有限的时 间操作以及排斥反应等在很大程度上限制了异种肝脏移植模型快速成功建立和广 泛推广。因此，本实验在以往的基础上进行改进与实践，现就对异种肝移植模型 建立过程中的一些影响因素及操作体会阐述如下。 1 排斥反应 异种肝移植术后所遇到的第一道难关即是超急性排斥反应，其时间仅以分钟 或小时来计算。异种移植排斥反应基本原理是人体在进化过程中逐渐形成和完善 了最快、最直接地抵御外来物侵袭的三大屏障：补体反应；天然抗体反应( n a ) ； 内皮细胞激活反应。异种器官重新建立血流后，天然抗体即与异种抗原结合， 激活补体系统对移植器官细胞产生溶解作用，同时激活内皮细胞，产生微血栓。 补体系统还可通过旁路途径由种间分子激活，内皮细胞也可通过种间分子激活。 此外，体液免疫、细胞免疫等也参与排斥反应作用。有研究表明，肝脏较其他的 器官更能耐受抗体介导的免疫损害【1 6 1 。在非协调性异种移植中，补体为其免疫排 斥反应一大主要免疫障碍，但当补体与靶细胞抗原为同一种系时，则失去溶解靶 细胞毒作用，肝脏作为补体系统产生的主要场所，当受体原有种系补体随时间推 延而消除后，新产生的补体与移植肝脏为同一种系，对移植物则失去作用。异种 排斥反应是异种移植后受鼠死亡的重要原因，我们在术前及术后均使用地塞米松 静脉注射 】，减少了机体的细胞免疫及体液免疫，减少了抗体的生成，并从一定 程度上增强机体对肝移植手术的耐受性，抑制了排斥反应作用，提高了动物术后 1 4 徐州医学院硕士学位论文 生存率。 2 麻醉 现大鼠肝移植麻醉剂主要有氯胺酮、戊巴比妥钠、水合氯醛以及乙醚四种【1 8 】， 前三者一腹腔注射为主，乙醚为吸入麻醉。戊巴比妥钠和水合氯醛具有较高的肝 脏毒性【1 9 l ，可影响术后肝功能和实验结果，故现已较少使用。氯胺酮肝脏毒性较 小，但有代谢慢的特点而使术后复苏时间延长【2 0 j 。乙醚具有容易控制麻醉深度、 追加剂量方便、苏醒快等特点，但因是吸入麻醉药，易使呼吸道分泌物增加而而 增大手术危险性。本实验供鼠选用氯胺酮腹腔注射麻醉，受鼠先用半量氯胺酮腹 腔注射麻醉诱导再辅以乙醚半开放式吸入麻醉，既保留了氯胺酮麻醉效果稳定， 肝脏毒性较小的优势【2 ，又可以在无肝期过程中用乙醚控制麻醉深度，减少大鼠 死亡率。 3 灌注 冷灌注目的是洗净血管内残存的血液以免微血栓形成，并保护肝组织以防止 退行性变，延长器官的生存能力，充分、均匀、压力适当的冷灌注是获取高质量 供肝的重要保证【2 2 2 3 1 。与以往的门静脉插管灌注不同，我们采用经腹主动脉头皮 针穿刺持续灌注，使肝脏得到来自肝动脉和门静脉的双重灌注，降温更迅速，灌 注更加均匀和彻底。在灌注过程中应注意：应理顺肠道、复位扭转的肝叶后再行 灌注；先排尽灌注管道中的气体，以免空气栓塞门静脉分支，造成灌注不良。 固定穿刺针时将腹主动脉和下腔静脉阻断，使灌注更充分。 4 解剖 豚鼠有以下解剖特点：( 1 ) 有胆囊，肝动脉非常细，门静脉较粗，门静脉血供占 9 0 以上；( 2 ) 右肾上腺和右肾紧贴下腔静脉和肝右下叶，不易分离；( 3 ) 下腔静脉 和膈肌环很薄，游离和吻合时容易撕裂；( 4 ) 左、右髂静脉汇合点较高，与右肾静 脉相距紧密。因豚鼠的下腔静脉干很短，直径较细，高位便分出左右肾静脉和髂 血管，我们采用先结扎左肾静脉，在右肾静脉及骼血管之间剪开血管，使血管呈 1 5 徐州医学院硕士学位论文 喇叭状，以便于套管。因右肾上腺紧贴肝下下腔静脉，我们在取肝时一并将右肾 上腺取下，在修肝时仔细分离并去除右肾上腺，这样可减少术中损伤腔静脉致大 出血的可能，提高手术成功率。 5 无肝期 无肝期的长短是决定手术成败的重要因素洲，其中肝上下腔静脉的吻合更是 受体手术的难点，良好的暴露是吻合成功的前提。本实验在s a t i n s k y 钳阻断肝上 下腔静脉时，在保证不影响呼吸的前提下尽量下拉肝脏，连带部分膈肌一并钳夹， 使受体肝上下腔静脉暴露充分。我们在以往“两点法 2 5 1 吻合基础上进行改进来 吻合肝上下腔静脉，即供受者的肝上下腔静脉在一个平面上，吻合前将肝上下腔 静脉用无损伤缝线向四个方向牵拉，先固定血管左右两端再行连续外翻缝合，吻 合后壁时将前壁吊起，连续缝合3 针再一起收线，前壁缝闭前一定往血管内注射 少量液体排气，以防空气栓塞。门静脉和下腔静脉套管安装前应少许放血，以排 除可能的血栓，安装血管袖套时应以幽门静脉和右肾静脉断端为确定血管方位的 标志，以免血管吻合后扭转。此外，在门静脉阻断后，穿刺门静脉注射2 m l 乳酸 林格液，使受肝变为灰白色，起到自身血液回输的效果，以增大大鼠在无肝期对 循环血量锐减的耐受性。 总之，异种肝移植模型的建立是一个精细复杂的手术过程，术者熟练地手术 操作、无肝期地缩短是提高手术成功的关键。本实验在以往豚鼠至大鼠肝移植模 型建立的基础上，经过一定的技术训练和改进，能够建立稳定可靠的异种肝移植 模型，可为后期进行肝移植基础实验研究提供较好的模型平台。 1 6 一_ 一_ 一 - -。 一 一 徐州医学院硕士学位论文 第二部分h i l 1 0 修饰的m s c s 对异种肝移植的影响 随着分子生物学的发展，基因治疗用于诱导移植免疫耐受的研究取得了很大 进展。i l 1 0 是重要的负调节细胞因子，而m s c s 在具有下调同种免疫排斥反应的 作用的同时又具有良好的载体细胞条件。通过基因工程使二者的免疫负调节作用 结和，进而用于诱导移植免疫耐受具有良好的可行性。前面部分的实验通过慢病 毒载体系统修饰豚鼠m s c s ，使其获得了对l l i l 1 0 高表达。本部分实验通过对冻 存h i l 1 0 修饰m s c s 的复苏、标记，并应用在豚鼠至大鼠的肝移植模型中，探讨 h i l 1 0 基因修饰的m s c s 作为降低异种移植免疫排斥反应的基因治疗手段提供实 验基础。 材料和方法 1 材料 1 1 试剂 l d m e m 培养基 f b s ( 胎牛血清) 胰酶细胞消化液 鼠淋巴细胞分离液 c d 2 9 、c d 3 4 、c d 4 4 、c d 4 5 抗体 d a p i 染色液 p b s 缓冲盐 i l 2e l i s a 检测试剂盒 i l 4e l i s a 检测试剂盒 i l 1 0e l i s a 检测试剂盒 i l 1 2e l i s a 检测试剂盒 1 7 美国g i b c o 公司 杭州四季青公司 江苏碧云天公司 天津血液病研究所 美国e g 公司 江苏碧云天公司 北京中杉金桥公司 美国r & d 公司 美国r & d 公司 美国r & d 公司 美国r & d 公司 徐州医学院硕士学位论文 i l 1 5e l i s a 检测试剂盒 i l 18e l i s a 检测试剂盒 t n f qe l i s a 检测试剂盒 1 2 仪器 低速离心机 恒温培养箱 超净工作台 倒置显微镜 手术器械 低温冰箱 荧光显微镜 电热恒温水浴箱 1 3 实验动物 美国r & d 公司 美国r & d 公司 美国r & d 公司 科大创新股份有限公司 苏州医疗器械设备厂 苏州净化集团安泰公司 日本o l y m p u s 公司 上海手术器械厂 日本s a n y o 公司 日本o l y m p u s 公司 上海医用恒温设备厂 供体采用清洁级雄性豚鼠，体重1 6 0 2 0 0 9 ；受体为清洁级雄性w i s t a r 大鼠， 体重1 8 0 - 2 2 0 9 ( 徐州医学院动物中心提供) 。体重增至2 5 0 - 3 0 0 9 后可作为供受体 ( 受体体重高于供体约5 0 9 左右) 行异种肝移植术。 2 方法 2 1 豚鼠m s c s 的提取及培养 2 1 1 利用密度梯度离心法得到含有大量m s c s 的单个核细胞 1 ) 选用健康豚鼠一只，雌雄不限，颈椎脱臼法处死后用碘伏浸泡消毒5m i n 2 ) 无菌条件下切开皮肤、皮下，分离两侧股骨胫骨，注意勿损伤骨质，保持 骨髓腔封闭无菌状态，用p b s 液洗涤骨三遍，除去多余软组织。 3 ) 血管钳小心夹持股骨中段，用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端，暴露骨髓腔，用 5 m l 注射器吸取5 m l 含1 0 胎牛血清( f e t a lb o v i n es e r u m ，f b s ) 的 l d m e m ( 1 0 w - d u l b c c o sm o d i f e de a g l em e d i u m ) 培养液( 每1 0 m l 含肝素5 0 m g ) 反复 冲洗骨髓腔3 5 次，从骨髓腔中冲洗出骨髓，将收获的全部骨萌用注射器反复抽吸， 1 8 徐州医学院硕士学位论文 以打散组织成为细胞悬液。 4 ) 细胞悬液2 0 0 0 r p m 离心5 1 0 m i n ，弃上清，以除去脂肪细胞。 5 ) 加入等量含1 0 f b s 的l d m e m 重新悬浮沉淀的细胞。 6 ) 并将细胞悬液贴壁轻轻加入到预置大鼠淋巴细胞分离液的离心管中，使细 胞悬液悬于上层，保持界面清楚。2 0 0 0 r p m ，离心3 0 分钟。收集云雾状白膜层的 单个核细胞于另一离心管中。 7 ) 用含1 0 f b s 的l d m e m 培养液洗涤细胞两遍，每次1 0 0 0 转分钟，离 心5 分钟。弃上清。即获得单个核细胞。 8 ) 用含1 0 f b s 的l d m e m 重悬用血球计数板计数细胞，调整细胞浓度为 l x l 0 6 1 0 9 个m l 。进行下一步贴壁培养。 2 1 2 经贴壁培养纯化和扩增m s c s 将调整细胞浓度为1 0 6 - - 1 0 9 个m l ，接种于2 5 c m 2 培养瓶中，置于5 c 0 2 恒温 培养箱于饱和湿度、3 7 。c 、p h 7 2 条件下培养并标记为原代( p a s s a g e0 ，e o ) 。第3 5 天第一次换液，全量换液，用p b s 液洗涤培养瓶两遍，加入含1 0 f b s 的l d m e m 培养液后于3 7 c 、5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养。以后每周换液两次，换液 时保留部分培养液，去除悬浮细胞，倒置显微镜逐日观察，此即为原代细胞培养。 至原代长至8 0 1 0 0 融合时进行首次传代，细胞为p l 代，再传代则为p n 代， 如此类推。由于细胞贴壁性能不同，通过贴壁培养法，每次换液弃除悬浮生长的 造血细胞，贴壁细胞主要是m s c s ，从而使m s c s 得到纯化。 2 1 3 细胞形态观察： 在原代、传代的细胞培养过程中，于倒置显微镜下逐日观察细胞生长、增殖 情况及形态特征，并随时拍照记录。 2 1 4 流式细胞仪鉴定免疫学表型 ( 1 ) 收集p 3 代细胞，p b s 洗涤两次，并用p b s 重悬制成单细胞悬液，调整细 胞浓度为l 1 0 6 个m l 。 ( 2 ) 取7 管1 0 0 u l 细胞悬浮液，分别加入f i t c 标记的小鼠抗豚鼠c d 2 9 、c d 3 4 、 1 9 一徐州医学院硕士学往；分文 c d 4 4 、c d 4 5 抗体各2 0 u l ，充分混匀，并设阴性对照，做好标记。室温避光孵育 2 0 m i n ，放入4 。c 冰箱3 0 m i n 。 ( 3 ) 用p b s1 5 0 0 r p m 离心5 m i n 后弃上清，洗涤两次，洗去未结合荧光抗体。 ( 4 ) 用p b s 重悬细胞，1 多聚甲醛固定后用流式细胞仪检测c d 2 9 、c d 3 4 、 c d 4 5 、c d 9 0 抗原的表达。 2 2h i l 1 0 m s c s 的准备 本实验所用h i l 1 0 m s c s 为前部分实验所得，是将h i l 1 0 克隆基因片断，经 双酶切后定向插入慢病毒载体质粒( p l o x - c w g f p ) ，慢病毒三质粒用脂质体法转 染2 9 3 t 包装细胞，获得含有l l i l 1 0 的重组慢病毒，并通过其来介导h i l 一1 0 修饰 豚鼠m s c s ，获得稳定表达h i l 1 0 的m s c s ( 本实验室已成功构建) 。取处于对数 生长期的h i l 1 0 m s c s 冰冻于液氮当中。 2 2 1h l l 1 0 m s c s 的复苏 1 ) 将冻存有l l i l 1 0 m s c s 的冻存管用镊子从液氮中取出后，立即放入3 7 。c 水 浴中，轻轻摇动冻存管，使其在1 分钟内全部融化。 2 ) 将细胞转至超净台，在无菌条件下将细胞转移至离心管，1 2 0 0 9 m i n 离心 5 m i n 。 3 ) 超净台中弃去上清液，加入2 0 f b s 的l d m e m 约2 m l ，混匀，接种于 两个2 5 c m 2 培养瓶中，再往每个培养瓶中加入2 0 f b s 的l - d m e m 至铺满瓶壁， 置于3 7 。c 、5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养。 2 2 2h i l 1 0 一m s c s 的培养 第3 5 天第一次换液，全量换液，用p b s 液洗涤培养瓶两遍，加入含1 0 f b s 的l d m e m 培养液后于3 7 。c 、5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养。以后每周换 液两次，换液时保留部分培养液，去除悬浮细胞，倒置显微镜逐日观察。至长至