（园林植物与观赏园艺专业论文）盐碱胁迫下羊草相关基因及蛋白质的表达谱研究.pdf

摘要 羊草( l e y m u sc h i n e n s i s ) 是一种广布于东北盐碱地区的优良牧草，对盐碱胁迫具有较 强的耐受性，其中蕴藏着大量的抗逆基因和相关蛋白质。大规模分离、鉴定e d n a 克隆 及获得蛋白质表达谱，对进一步丰富抗逆功能基因资源库、探明植物耐受盐碱分子机理 具有重要意义。本文以羊草为试验材料，对苹草盐碱胁迫耐受相关基因群及蛋白质表达 谱进行了以下研究： 1 盐碱胁迫下羊草消减文库的构建及差异基因片段的筛选分析 以黑龙江省青冈县天然盐碱地( p h9 5 ) 草场生长的羊草地上部分e d n a 为试验方 ( t e s t e r ) ，同期r 光温室培养土( p h5 - 6 ) 条件下生长的8 周龄非盐碱条件下生长的羊草地 上部分c d n a 为消减方( d r i v e r ) ，利用抑制性消减杂交技术( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n , s s h ) 构建了盐碱胁迫下羊草消减文库。从消减文库中共筛选1 9 2 0 个阳性 克隆，p c r 鉴定插入片段大部分集中在3 0 0 1 0 0 0b p 之日。去冗余后得到的5 5 2 个非重 复序列，将这些序列与g e n b a n k 数据库中的序列进行比对，发现其中有5 4 8 条与数据 库中的序列有同源性，其中功能已知序列3 3 9 个，功能未知序列2 0 9 条；另外有4 条序 列在数据库中未发现其同源序列。功能已知的基因种类涉及代谢、能量、细胞生长及分 化、转录、蛋白质合成、蛋白质定位及贮存、细胞运输、细胞结构、转座子、信号转 导、细胞胁迫及防御。消减文库中获得的基因其中包括已报道的在其他植物体中获得的 盐碱胁迫相关的基因，如单脱氢抗坏血酸还原酶基 ( m o n o d e h y d m a s e o r b a t er e d u e t a s e ， m d a r ) 、t 谷氨酰半胱氨酸合成酶基因( g a m m a g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e ，r - e c s ) 、铁 蛋白基因( f e r r t i n ，f e r ) 、水孔蛋白基因( a q u a p o r i n ，脚) 、脱水素基因( d e h y d r i n ， d h n ) 、硫氧还蛋白还原酶基因( t h i o r e d o x i nr e d u c t a s e ，r r ) 、1 4 3 3 蛋白基因等，其功能 涉及活性氧清除、渗透调节、离子转运、基因调控等。 2 利用e d n a 微阵列检测羊草盐碱胁迫下基因的表达 消减文库获得的5 5 2 个非重复序列经p c r 扩增后，制备c d n a 微阵列。在反转录 过程中，利用引物序列中包含的c y 3 、c y 5 荧光染料捕获序列标记盐碱胁迫下生长的羊 草和温室培养羊革( 非盐碱胁迫) 的c d n a ，按照3 d n aa r r a y 9 0 0 睁试剂盒中相应步骤完成 芯片杂交，用s c a n a r r a y4 0 0 0 。芯片扫描仪扫描芯片。芯片的扫描根据添加的外标调整 c y 3 与c y 5 的信号强度，使信号均一化后通过s a m 软件分析上述样品基因表达差异的 显著性。芯片杂交进行了三次生物学重复，杂交结果显示出的变化倍数超过2 倍的认为 是具有显著表达差异的基因。三次获得的差异表达基因个数分别为1 9 8 、1 9 7 、1 9 2 个。 三次杂交显著上调表达的基因个数分别为t 9 5 、1 4 4 、1 9 2 个，显著下调的基因个数分别 为3 、5 3 、0 个。上调基因中部分基因为已报道与豁碱胁迫相关基因，如脱水素基因、 单脱氢抗坏血酸还原酶基因、硫氧还蛋白基因、铁蛋白基因、水孔蛋白基因、1 4 3 3 蛋 白基因等。另外一些上调基因荠没有其与赫碱胁迫相关的报告。 东北林业人学博l 掌位论义 3 盐碱胁追下上调基因p i p 、i l i d a r 、f e r 、1 红硒在羊草植株中表达分析 羊草植株用浓度为2 0 0m m o l l 的n a 2 c 0 3 溶液进行胁迫处理。处理时i 日j 分别为2 、 6 、1 2 、2 4 、4 8 和7 2h ，提取各处理样品的总r n a ，利用特异探针进行n o r t h e r n 杂交， 分析水孔蛋白基因、单脱氢抗坏血酸还原酶基因、铁蛋白基因、1 4 3 3 蛋白基因在不同 胁迫处理时间段内的表达情况。结果表明：在盐碱胁迫条件下，4 个基因均被诱导表 达，且随盐碱胁迫处理时问的延长而呈上升表达的趋势，但表达特性并不完全一致。 p i p 、m d a r 、f e r 基因的表达量在测定范围呈递增趋势，而，4 0 0 蛋白基因从2 h 开始至7 2h 表达量明显增加，1 2 h 、2 4 h 达到最高值，随后表达量丌始下降。从这些结 果中可以看出，这些基因都受豁碱胁迫诱导，在赫碱胁迫条件下表达量增加，功能基因 的表达与调控基因的表达方式有所不同。 4 利用二维液相色谱分析盐碱胁迫条件下羊草特异蛋白质的表达 共设四组试验材料：处理组i f 盐碱胁迫) 为温室内栽培的8 周龄羊草，用2 0 0m m o l l n a 2 c 0 3 浇灌7 2 h 后的植株，对照组i ( 非豁碱胁迫) 材料为温室内栽培的8 周龄羊草；处 理组i l ( 黼碱胁迫) 为豁碱地草场自然生长的羊草：对照组i i ( 非盐碱胁迫) 为同期取回的天 然生长的植株重新种植在温室栽培土条件下的羊草。用三氯乙酸一丙酮沉淀法提取总蛋 白，蛋白质沉淀裂解后，采用第一维色谱聚焦、第二维反相高效色谱的组合模式进行二 维液相色谱分离。第一维分离中将等电点( p i ) 在8 5 4 0 范围内的蛋白质样品分离为每间 隔0 3 个p i 梯度的组分。第维分离组分接下来根据蛋白质的疏水性进行第二维分离。 等电点8 5 4 0 范围内的蛋白质样品经过二维分离后利用p r o t e o v u e 软件将所有组分按 照等电点排序后即可获得蛋白质表达谱。本试验获得了处理组i 、i i 和对照组i 、i i 的羊 草豁碱胁迫及非盐碱胁迫下植物的总蛋白质表达谱，在整个p h8 5 4 0 范围内条带清 晰，蛋白质分布呈现为两个主要部分，p 1 为6 1 4 0 和8 5 7 0 两个区段范围内，其中p i 为6 2 - 4 0 范围内蛋白质表达量高于p i 为8 5 7 2 范围内蛋白质，即蛋白质集中在酸性范 围内。但是p i 为6 2 - 4 0 范围内蛋白质疏水性接近导致蛋白质条带区分并不清晰，p i 为 7 2 8 5 范围内蛋白质的分离效果要好于前者。处理组蛋白质中性、碱性蛋白质的表达量 要稍高于对照组中性、碱性端蛋白质表达量。 利用d e l m v u e 软件将色谱峰比值大于2 倍的蛋白质初步定为存在表达差异的蛋白 质组分。处理组i 与对照组i 比较后获得的总差异表达蛋白质组分9 0 个，等电点为8 5 6 4 范围差异表达蛋白质组分5 8 个，其中对照组高于处理组的差异表达蛋白质组分共3 7 个，处理组高于对照组的差异表达蛋白质组分共2 1 个。处理组i i 与对照组i i 比较后获 得的总差异表达蛋白质组分4 6 个。等电点为8 5 ，6 4 范围差异表达蛋白质组分2 3 个， 其中对照组高于处理组表达量的差异表达蛋白质组分共1 2 个，处理组高于对照组的差 异表达蛋白质组分共1 1 个。其中大部分差异表达蛋白质组分的差异倍数均集中在2 倍 左右，少数蛋白质变化倍数在5 倍以上。对差异蛋白质的鉴定工作有待迸一步研究。 关键词羊草；盐碱胁迫；抑制性消减杂交；e d n a 微阵列；二维液相色谱 a b s t r a c t l e y m u sc h i n e n s i s ( t r i n ) t z v e l ，ah i g hq u a l i t yp l a n tf o rg r a z i n g ，a d a p t st oa l k a l i n e s o d i c s o i lc o n d i t i o n sa n dd i s t r i b u t e sw i d e l yi nt h en o r t h e a s to fc h i n a t h i ss p e c i e sh a sd e v e l o p e d m o l e c u l a ra n dp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s m sd u r i n gt h ec o u r s eo fe v o l u t i o n ，w h i c hi n v o l v el o t so f a n t i s t r e s sg e n e sa n dp r o t e i n st oa d a p ts t r e s sc o n d i t i o n s t oi d e n t i f ya n dc h a r a c t e r i z et h e c o m p l e x i t yo ft h i sa d a p t a t i o n , i ti si m p o r t a n tt oi d e n t i f yg e n e sb yl a r g e s c a l es e q u e n c i n go f e d n ac l o n e sa n dr e l a t e dp r o t e i n s t h ee d n ac l o n e sa n dr e l a t e dp r o t e i n sa r ee x p e c t e dt o e n r i c ht h es t r e s sr e l a t e dm o l e c u l a rr e s o u r c e sa n dr e v e a lt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，s t u d i e sw e r em a d eo nt h es t r e s s r e l a t e dg e n e sa n dp r o t e i n se x p r e s s i o np r o f i l eo f l e y m u sc h i n e n s i ss h o o t su n d e rs a l i n e a l k a l i n es t r e s s 1 t h ee o n s t r u c t i o no fs u b t r a e t i v el i b r a r yo f l e y m u sc h i n e s i su n d e rs a l i n e - a l k a l i n es t r e s s u s i n gc d n a sf r o ml e y m u sc h i n e n s i ss e e d l i n g sg r o w no nt h en a t u r a lh a b i t a to fs a l i n e - a l k a l i n es o i lw a sr e g a r d e da st e s t e ra n de d n af r o ms e e d l i n g si nn o r m a lg r o w t ha sd r i v e r , s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) w a se m p l o y e dt oc o n s t r u c te d n as u b t r a c t e d l i b r a r y o f t h e1 9 2 0e d n ac l o n e ss h o w e dh i g hq u a l i t ys e q u e n c e s t h es i z eo f i n s e r t sw a s3 0 0 1 0 0 0b a s ep a i r sa si tw a sd e t e r m i n e db yp c r i nt h es u b t r a c t i v el i b r a r y ，5 5 2c l o n e sw e r en o n - r e d u n d a n t ，o fw h i c h3 3 9h a dh o m o l o g yt ot h ek n o w nt r a n s c r i p t s ，a n d2 0 9w e r eu n k n o w no r u n c l a s s i f i e d t h er e m a i n i n g4e s t sh a dn oh o m o l o g yi nt h ed a t a b a s e ss e a r c h e d t h es u g g e s t e d f u n c t i o n se s t sw h i c hh a v et h ea n n o t a t i o ni nt h ed a t a b a s ei n c l u d em e t a b o l i s m ，e n e r g y ，p r o t e i n s y n t h e s i s ，p r o t e i ns t o r a g e ，d i s e a s e d e f e n s e ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，t r a n s p o r t e ra n dt r a n s p o n s e q u e n c ec o m p a r i s o no ft h e s ec l o n e su s i n gb l a s t nl e dt ot h ei d e n t i f i c a t i o no fs e v e r a lp u t a t i v e s a l i n e a l k a l i n es t r e s sr e l a t e dg e n e s ，s u c ha sm o n o d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e ( m d a r ) ， g a m m a g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e ( 7 - e c s ) ，t h i o r e d o x i nr e d u c t a s e ( r r ) ，f e r r t i n ( f e r ) ， a q n a p o r i n ( ，p 炉) ，d e h y d r i n ( d h n ) a n d1 4 3 - 3p r o t e i n t h es u g g e s t e df u n c t i o no ft h ee s t s i n v o l v e da c t i v eo x y g e ne l i m i n a t i o n ，o s m o t i ca d j u s t m e n t ，i o nt r a n s p o r ta n dr e g u l a t i o no ft h e g e n e s t h ep u t a t i v ee s t sw i l ls e r v ea su s e f u ir e s o u r c et od e m o n s t r a t et h em o l e c u l a rb a s i so f s a l i n e - a l k a l i n es t r e s sr e l a t e dg e n e sa n df o rt h ef u r t h e rs t u d yo fg e n ee x p r e s s i o ni nl e y m u s c h i n e n s i s w ec o n s i d e rt h a ts o m eo f t h e s eg e n e sa n dt h e i rm e t a b o l i s m sa r ep o s s i b l yi n v o l v e di n t h ep r o c e s so fs a l tt o l e r a n c ei nl e y m u sc h i n e n s i s 2 g e n ee x p r e s s i o np r o f i l eo fl e y m u sc h i n e n s i su n d e rs a l i n e a l k a l i n es t r e s sd e t e c t e db y e d n am i e r o a r r a y t h ei n s e r t sa m p l i f i e df r o m5 5 2s e q u e n c e so fl e y m u sc h i n e n s i ss s hl i b r a r yc l o n e sw e r e s p o t t e do ns l i d e st og e tc d n am i c r o a r r a y s a l i n e a l k a l i n es t r e s sa n dn o n s t r e s sm r n aw e r e l a b e l e d 、v i t l lc y 3 o rc y 5 一f l u o r e s c e n c ed y er e s p e c t i v e l yd u r i n gr e v e r s et r a n s c r i p t i o na n dt h e n 1 1 1 东北林业人学磷j 学位论义 m i x e da st a r g e t s m i c r o a r r a yh y b r i d i z a t i o nw a sa c c o m p l i s h e df o l l o w i n gt h ed i r e c t i o no fu s e r m a n u a lo f3 d n a9 0 0 画t h ea r r a yw a ss c a n n e db ys c a n a r r a y4 0 0 0 m i c r o a r r a ys c a n n e r f o r s t a n d a r d i z a t i o n ，t h ec y 3a n dc y 5s i g n a li n t e n s i t i e sw e r ea d j u s t e dt of i te x t e r n a lc o n t m l s t h e m i c r o a r r yw a sh y b r i df o rt h r e et i m e s u s i n gs a ms o f t w a r et oa n a l y z et h es i g n i f i c a n c eo f d i f f e r e n c eo f t h em i c r o a r r a yg e n e s ，1 9 8 ，1 9 7 ，a n d1 9 2s i g n i f i c a n tr e g u l a t e dg e n e sw e r ed e t e c t e d i nt h et h r e eh y b r i d i z a t i o n s , r e s p e c t i v e l y a m o n gt h es i g n i f i c a n tr e g u l a t e dg e n e st h e r ew e r e3 ， 5 3 0d o w n r e g u l a t e dg e n e s r e s p e c t i v e l y i nf u n c t i o n k n o w ng e n e si n c l u d e dm o n o d e h y d r o - a s c o r b a t e r e d u c t a s e ，g a m m a - g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e ，f e n t i n , a q u a p o r i n ，d e h y d r i n ， t h i o r e d o x i nr e d u e t a s ，a n d1 4 - 3 3p r o t e i n s ，a l lo fw h i c hw e r ek n o w nt ob er e l a t e dw i t hs t r e s s t o l e r a n c e t h e r ei sn or e p o r tf o ro t h e ru p r e g u l a t e dg e n e s 3 e x p r e s s i o no fu p - r e g u l a t e dg e n e s ，m d a r ，f e r ，p l p a n d1 4 3 - 3 si n v e s t i g a t e db y n o r t h e r nb l o t t i n g f i r s t l y ，t ob l a s tt h es e q u e n c eo tm d a r ，f e r ，p l p ，、4 3 3 sw i t ht h er e l a t e dg e n e so f o t h e r p l a n t si nd a t a b a s et od e s i g nt h ep r i m e r t h es p e c i a ls e q u e n c e so ft h ef o u rg e n e sw e r el a b e l e d b yt h ed i g m a r kt og e tt h ep r o b e n l es e e d l i n g so ft r e a t e dw i t h2 0 0m m o l ln a 2 c 0 3f o r2 6 ，1 2 ，2 4 ，4 8a n d7 2 hw e r eu s e df o re x t r a c t i o no f r n af o rn o r t h e mb l o t t h ee x p r e s s i o no f f o u r g e n e sw a sd e t e c t e di nt r e a t m e n t s m d a r ，f e r ，p i p 、a n d1 4 - 3 3 st r a n s c r i p t o m ei n c r e a s e dw i t h t h ed u r a t i o no ft h et r e a t m e n t b u tt h eg e n e ss h o w e dd i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n s i n1 4 3 3 s e x p r e s s i o np a t t e m ，t h el a r g e s ta m o u n tw a so b s e r v e di ns e e d l i n g st r e a t e df o r1 2 ha n d2 4 h ，a n d t h e nt h ee x p r e s s i o na m o u n td e c r e a s e d 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e dt h eg e n e si n d u c e db ys a l i n e a l k a l i n es t r e s s y e tt h ef u n c t i o ng e n e sa n dr e g u l a t i o ng e n e ss h o w e dd i f f e r e n te x p r e s s i o n p a t t e r n s 4 p r o t e i n e x p r e s s i o np r o f i l e o fl e y m u sc h i n e n s 豇w i t ht w o - d i m e n s i o n a l l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t h e r ew e r ef o u rg r o u p so fl e y m u sc h i n e n s i sp l a n t ss e e d l i n g sc o l l e c t e df r o mt h en a t u r a l h a b i t a t ( t r e a t m e n ti ) ，s e e d l i n g sp o u r e dw i t h2 0 0m m o l ln a 2 c 0 3a f t e r7 2 h ( t r e a t m e n ti i ) ， s e e d l i n g si nt h en a t u r a l h a b i t a tp l a n t e di nt h en o n - s a l i n e - a l k a l i n es o i l ( c o n t r o li ) ，a n de i g h t - w e e k - o l ds e e d l i n g sg r o w ni nt h eg r e e n h o u s ew i t h o u ta n ys t r e s s ( c o n t r o l1 1 ) t o t a lp r o t e i n sw e r e e x t r a c t e d b yt c a a c e t o n ep r e c i p i t a t i o nm e t h o d p r o t e i n s w e r ef r a c t i o n a t e di nt h ef i r s t d i m e n s i o nu s i n gc h r o m a t o f o c u s i n g ( c f ) s u b s e q u e n t l yt h ef r a c t i o n sw i t hp hv a l u eb e t w e e n 8 5a n d4 0c o l l e c t e da l t e rf i r s td i m e n s i o ns e p a r a t i o nw e r ef u r t h e rf r a c t i o n a t e db yh i g l p e r f o r m a n c er e v e r s ep h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p r p ) t h ep l a j vm a ps h o w e dt h a tt h e p r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l i n go fl e y m u se h i n e n s i sw a sg e n e r a t e db yp r o t c o v u es o f t w a r e i nt h e e x p e r i m e n t ，f o u rp r o t e i ne x p r e s sp r o f i l e sw e r eg u tf r o ms a m p l e so fe a c ho ft r e a t m e n t si ，i i ， c o n t r o li ，a n di i t h ep r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l em a p ss h o w e dc l e a rb a n d sa n dg o o d q u l i t yf r a c t i o n 1 1 1 e i v c o n t r i b u t i o no ft h ep r o t e i nf r a c t i o nf o c u s e do np lr a n g e6 1 - 4 0a n d8 5 - 7 0 t h ea m o u n to f p r o t e i ni np i6 2 4 0w a sh i g h e rt h a nt h a ti n8 5 7 2 ，i n d i c a t i n gm o s t l ya c i d i cp r o t e i n s b u tt h e p r o t e i n sw i t hp ii n6 2 4 0h a d t h es i m i l a rh y d r o p h i l i c i t y t h ee x p r e s s i o na m o u n to f n e u t r a la n d b a s i cp r o t e i n si nt r e a t m e n t sw a sh i g h e rt h a nt h a to f t h ec o n t r o l s t og e tt h ed i f f e r e n t i a lp r o t e i n su n d e rt h es a l i n e a l k a l i n es t r e s s ，p r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l e s o fc o n t r o l sa n dt r e a t m e n t sw e r ec o m p a r e db yd e l t a v u es o f t w a r e p r o t e i n sw h i c ht h ep e a k h e i g h to fc o n t r o l sa n dt r e a t m e n t sw a sa b o v et w ow a sd e c i d e dt h ed i f f e r e n t i a lo n e s t h e r ew e r e 9 0d i f f e r e n t i a lp r o t e i n s 。i ne a c ho fc o n t r o lia n dt r e a t m e n ti ，a n d4 6i ne a c ho fc o n t r o li ia n d t r e a t m e n ti i i np i8 5 6 4 t h e r ew e r e5 8d i f f e r e n t i a lp r o t e i n si nc o n t r o lia n dt r e a t m e n ti t h e h i g h e ra m o u n t so f d i f f e r e n t i a lp r o t e i n si nc o n t r o lw e r e3 7 ，a n dt h a ti nt r e a t m e n tw e r e2 1 a n d i nc o n t r o l1 1a n dt r e a t m e n ti it h e r ea r e2 3d i f f e r e n t i a lp r o t e i n s 1 1 1 eh i g h e ra m o u n to f d i f f e r e n t i a lp r o t e i n si nc o n t r o lw e r e12 ，a n dt h a ti nt r e a t m e n tw e r el1 t h ep e a kh e i g h tr a t i oo f m o s t l yd i f f e r e n t i a lp r o t e i n sw e r ea b o u tt w o , w i ms o m eo b s e r v a t i o n ss h o w i n gh i g h e rt h a nf i v e f u r t h e rs t u d i e sr e m a i nt ob em a d eo ns u c hu st h ei d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n t i a lp r o t e i n s t h e d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np r o t e i ni si m p o r t a n ti no r d e rt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mu n d e rs a l i n e a l k a l i n es t r e s s k e y w o r d sl e y m u sc h i n e n s i s ；s a l i n e a l k a l i n es t r e s s ；s u p p r e s s i o ns u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i o n e d n a m i c r o a r r a y ；t w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文q 。不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也巧i 包含为获得壅韭盐些盘鲎或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中千# 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：瑚 签字日期： 口7 年多月，口闩 学位论文版权使用授权书 本学位沦义f 1 ：者完伞j ，解壅! 垦签些盘芏有天保留、1 史1 1 j 学位沦文的规 定，仃权“甾外刚幽豕仃灭部f j 或机构魃父论义的曼l i l 能们，九l fi l 义f 从t + f 阅和借 j ； | 。本人授奉义壅! ! 盎些盘生可以将学位论文的金部或部分内容编入订 天数据库进行榆索，n j 以采刚影印、缩印或扫摘等复制下段保存、卅：编学位沦 史。 ( 保密的学位沦文在解密后适j 4 j 本授权书) j j 位【l - 义作栉掺私 骄 f j ：夕年钏川。 i 州。单位 也i j i j 也划一 d 7 句二6 j f 口 ) 嘶t ：i 易 f 净77 孑 邮编：十加够。 1 绪论 1 1 盐碱胁迫下植物研究现状及应用情况 1 1 1 盐碱胁迫生境现状及其对植物的影响 盐碱土壤是地球陆地上广泛分布着的土壤类型之一，是能土、盐化土壤以及碱土、 碱化土壤的总称，又称箍渍土壤i 】。我国广袤的土地上，从滨海到内陆，从低地到高原 都分布着不同类型的盐碱土壤，总面积达到9 9 1 3 3 万公顷1 2 j 。我国的靛碱土，主要是由 n a + 、c a 2 + 、m 9 2 + 三种阳离子以及c 0 3 2 _ 、h c 0 3 一、c i 一、s 0 4 四种阴离子组成的1 2 种 熊土，另外还存在较小面积的硝酸赫赫土。大面积现存的赫碱土壤及土壤的盐碱化愈演 愈烈的趋势形成了危害植物生存、生长的主要胁迫条件盐碱胁迫。 环境胁迫对植物的影响非常复杂且涉及到很多的方面。当胁迫因子作用于植物时， 往往首先直接使生物膜受害，导致透性改变，产生原初直接伤害；膜受到伤害后，进一 步导致植物代谢作用失调，影响正常的生长发育，导致原切间接伤害。另外，一些胁迫 因子往往还可以引起新的胁迫，从而造成次生胁迫伤害，如氧胁迫、营养胁迫等。盐碱 胁迫对植物的影响主要为渗透胁迫、离子胁迫、氧化胁赳1 ”。 渗透胁迫主要指当土壤中离子浓度过高时，土壤溶液的渗透势降低，植物吸水困 难，严重时还造成细胞组织的水分外渗，抑制植物的萌发与生长【2 】。 离子胁迫是离子本身产生的离子毒害。当植物生活在离子胁迫的生境中，外界大量 的捻离子( n 矿、c i 一) 涌入细胞，破坏了植物细胞中的n a + 和c 1 - 的平衡状态，而且也影响着 k + 、c a 2 + 及其它离子的吸收，造成体内离子不平衡。另外，阴离子之l 日j 的竞争，如c r 使p 0 4 孓的吸收受到抑制。磷的吸收减少【5 j ，最终造成n a + 与c i 过量以及c 与c a 2 + 离子 的亏缺。与此同时也破坏了抗盐碱植物细胞原有的跨膜电化学势梯度，还破坏了细胞中 一些具有重要生理功能的生物大分子，如n a + 抑制了各种酶的活性，同时导致一些生物 大分子如d n a 降解，使植物细胞正常生理代谢遭到严重干扰1 4 ，6 - 9 1 。 氧化胁迫主要是指当环境胁迫长期作用于植物体时，产生的活性氧超出了活性氧清 除系统的能力时，破坏了产生的活性氧与其清除系统之耳j 的平衡，弓l 起活性氧累积产生 氧化伤害。活性氧的氧化能力，对不饱和脂、蛋白质、核酸等生物分子具有作用破坏， 可引起酶失活、色素脱色、蛋白降解和脂质过氧化等反应。从而导致生物膜被破坏，选 择透性丧失，功能改变，细胞内的钾、磷和有机质外渗【孔。过多的活性氧还会导致膜脂 过氧化，并进一步引起d n a 断裂，导致基因突变。活性氧通过d n a 损伤使维持细胞 基本生理功能的基因失去其表达活性，进而导致细胞衰老。活性氧还可损伤光合系统的 细胞器，使光合电子传递系统失活，进而引起光抑制。 出于植物生长的固定性，在不良环境或逆境到来的时候，植物只有对其作出响应， 增强其抗逆性，适应生存环境从而维持其生存。虽然盐渍土壤严重威胁人类生存、发 展，但在这片土地上生存、生长的抗盐碱植物为我们提供了宝贵的抗盐碱植物资源。正 是主要以抗盐碱植物为研究对象，人们对抗盐碱植物的发现和认识仍在不断的补充中， 探究其抗盐碱特性方面的内容，丰富盐碱抗性资源，得以深入研究植物抗盐碱分子机理 及抗盐碱特性。 1 1 2 盐碱胁迫下植物的生理学研究 植物与其生长的坏境是一个统一的整体，环境对植物的长期作用影响了植物的形态 建成使植物形成了适应环境的形态结构、生理功能以及生念特征。长期以来，形念学、 生理学方面的研究是认识抗哉碱植物的重要手段，对不同类型抗盐碱植物的生理学研究 广泛而深入。由于盐渍环境的多样性，抗枯碱植物表现出多种多样的形态结构和生理功 能等的适应特点。植物的生长发育依赖于维持细胞_ i f 常生理代谢的离子平衡和渗透( 水) 平衡”州“。因此，植物必须采取多种适应机制以维持j 下常的代谢水平，以最大限度地降 低盐胁迫的危害。 1 离子区域化 有些植物可以将吸收到植物细胞中的大部分离子运输并贮存于液泡中，从而降低细 胞中的盐浓度。离子的区域化作用是抗盐碱植物适应靛渍生境的重要手段之一。 在植物中存在着拒n a + 机制，这种机制可看作是植物对离子在组织水平的区域化分 布。禾本科作物如小麦、大麦、高粱、水稻等利用对离子的选择吸收和转运，不将n a 十 吸入根细胞内，即使进入根细胞，又通过n a + h + 反向转运蛋白a + h + a n t i p o r t e r ) 泵出细 胞，植物把吸收的n a + 贮存于根、茎基部、节和叶鞘等薄壁组织中央液泡中f l 引，从而阻 止n a + 向叶片中转运，导致n a + 向叶片和籽粒中选择性运输降低，而k + 和c d + 选择性运 输增加，这在耐( 抗) 赫植物品种中表现得非常明显。而且，水稻、高梁中存在脉内再循 环( i n t r a v e i n a lr e c y c l i n g ) 现象。可把吸收的n a + 在木质部转运过程中被木质部或韧皮部传 递细胞( t r a n s f e rc e l l ) 吸收，并分泌到韧皮部中，再运回根部，最后分泌到环境中。 离子在细胞水平上的区域化。耐盐性不同的植物中光合作用的两个关键酶 r u b p c a s e 和p e p c a s e 在体外对赫的敏感性无差异，类囊体膜上p si i 对n a c i 敏感性也 无差异，这表明调节细胞内赫离子，避免各种酶和赫离子直接接触和相互作用是一种耐 栽性的重要机制| l “，其动力来源于细胞质膜p m h + - a t p a s e 和液泡膜v - h + a t p a s e 与v h + a t p a s e 以及质膜氧化还原系统等建立的跨膜质子驱动j 3 ( p r o t o nd r i v i n gf o r c e ) 。据研 究，高等植物缺乏n a + a t p a s