（微生物学专业论文）草甘膦降解菌g6的分离及降解特性的研究.pdf

华中农业大学2 0 0 6 年硕十研究生毕业论文 摘要 取湖北省武汉市华中农业大学校园及周边水稻田、棉花田、油菜田、玉米地、 水果基地、花卉基地等9 处的土样，分离到1 6 株降解草甘膦的细菌菌株。通过高压 液相色谱仪h p l c 测定，筛选出降解能力最强的g 6 菌株，该菌株在草甘膦3 0 0 n u n o l l 的v i m 培养基中，4 8h 内对草甘膦的降解率达8 6 5 2 。1 6 sr d n a 片段序 列分析结果显示菌株g - 6 与成团泛菌( p a n t o e aa g g l o m e r a n s ) 相似性为9 7 7 8 ，成团 泛菌( p a n t o e aa g g l o m e r a n s ) 与成团肠杆菌( e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ) 及欧文氏菌 ( e r w i n i aw i n s l o w ) 同物异名，认为g - 6 属于欧文氏菌属，综合形态学、培养特征、 1 6 sr d n a 片段序列分析和生理生化特征，证实g 一6 属于斯氏欧文氏菌( e r w i n i a s t e w a r t i i ) 。 对草甘膦的耐受实验表明，g 6 菌株最佳抗草甘膦浓度为3 0 0m m o l l ，对草甘 膦的抗性在5 0 0m m o l l 以上。环境因素对草甘膦降解的影响表明，( 3 - 6 菌株有较宽 的酸碱适应范围，能够很好的适应环境中的酸碱变化。从p h i 0 到p h l 2 0 几乎都有 一定生长，在p h 6 0 8 0 范围内生长良好，g 6 生长的最适p h 为6 0 ，在该p h 条件 下，g - 6 达到最大的生长量。环境中c d 2 + 浓度为o 0 2 0 2m g ，k g 时对草甘膦降解有 促进，c u 2 + i 接04 0 0m e a x g 时对草甘膦的降解有促进作用，p b 2 + 、z n 2 + 对草甘膦的降 解有抑制作用，但降解率仍大于6 0 ，说明g 6 在重金属c d 2 + ，c u 2 + 、p b 2 + 、z n 2 + 污染的土壤环境中能降解草甘膦。g - 6 菌株经过6d 对氟氯氰菊酯的降解率达 3 7 8 7 ，对溴氰菊酯的降解率达3 3 2 1 。 土壤中有降解草甘膦能力的微生物种类繁多，关键是要找到降解能力最强的， 受环境影响最小的，并深入研究降解有关酶和基因，以期将降解草甘瞵的基因克隆 后转入农作物，转入降解草甘膦克隆基因的植物将草甘膦快速催化代谢为无毒产物， 就可解除草甘膦对农作物的危害。本实验分离到的g - 6 菌株对3 0 0m m o l l 草甘膦 4 8h 内达8 6 5 2 的降解率，最高草甘膦负荷量5 0 0r m n o l l 的水平，而且该菌株对 于各种环境条件包括温度、酸碱度、重金属污染适应性较强，具有良好的应用前景， 可为分离降解酶基因和作转基因植物奠定基础，为草甘膦的生物降解提供了新的微 生物资源。 草什瞵降解菌g - 6 的分离及降解特t 牛的研究 关键词：草甘膦；降解；分离；高压液相色谱 i i 华中农业大学2 0 0 6 年硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t s i x t e e ns t r a i n so fg l y p h o s a t e - d e g r a d i n gb a c t e r i aw e i ei s o l a t e df r o m9k i n d so f s o i l ， w h i c hw e f ec o l l e c t e df r o mh u a z h o n ga g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y i tw a sf o u n dt h a tt h es t r a i n g 一6 ，h a dt h eb e s ta b i l i t yt od e g r a d et h ep h o s p h o n a t eh e r b i c i d eg l y p h o s a t ew h e nw c d e t e r m i n e dt h ea b i l i t yo f t h es i x t e e ns t r a i n so f g l y p h o s a t e - d e g r a d i n gb a c t e r i ab yh p l c i t s h o w e d8 6 5 2 g l y p h o s a t ed e g r a d a t i o ni n4 8h o u r si n3 0 0m m o l lg l y p h o s a t em i n i m a l m e d i u m t h es e q u e n c ea n a l y s i so fa1 6 sr d n af r a g m e n ta m p l i f i e df r o mt o t a ld n ao f s w a i ng - 6w a f tu s e dt o i d e m i f yg - 6 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t g 一6 h a d9 7 7 8 c o m p a r a b i l i t y 埘t l l p a n t o e a a g g l o m e r a n s p a n t o e aa g g l o m e r a n s e n t e r o b a c t e r a g g l o m e r a n s ，e r w i n i aw i n s l o ww e r et h e $ a m eo b j e c tb u th a dd i f f e r e n tn a m e s ，g - 6w a s i d e n t i f i e da se r w i n i aw i n s l o w a s s o c i a t e dw i t hm o r p h o l o g y , c u l t u r e dc h a r a c t e r i s t i c ，1 6 s r d n af r a g m e n ta m p l i f i e da n dp h y s i o - b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c g 一6w a si d e n t i f i e da s e r w i n i as t e w a r t i i o l y p h o s a t e - t o l e r a n tt e s ts h o w e dt h a t , t h eb e s tg l y p h o s a t e - t o l e r a n tc o n c e n t r a t i o nw a s 3 0 0m m o l l ，t h em a x i m a lg l y p h o s a t e - t o l e r a n tc o n c e n t r a t i o nw a so v e r5 0 0m m o f l s t r a i ng - 6h a dw i d ea c i da n da l k a l ia d a p t i v er a n g e c o u l da d a p tt oa c i da n da l k a l ic h a n g e i ns u r r o u n d i n g s s t r a i ng - 6h a dg r o w t hf r o mp h lt op i l l 2 h a db e t t e rg r o w t hf r o mp h 6 0 t op h 8 0 ，h a db e s tg r o w t ha tp h 6 0 a d d i t i o no fo 0 2 0 2m g k gh e a v ym e t a li o n sc d r a n d4 0 0m g k gh e a v ym e t a li o n sc u 2 + c o u l dp r o m o t et h ed e g r a d a t i o no fg l y p h o s a t eb y g 一6 ，b u ta d d i t i o no fh e a v ym e t a li o n sp b 2 + 。z n 2 + , t h ed e g r a d a t i o no fg l y p h o s a t ew a s i n h i b i t e d a sar e s u l t , s t r a i ng 一6c o u l dd e g r a d eg l y p h o s a t ei nh e a v ym e t a li o n sp o l l u t e d s o i l c y f l u t h r i na n dd e l t a m e t h r i nc o u l da l s ob ed e g r a d e d , t h ec y f l u t h r i nd e g r a d i n gr a t e w a s3 7 8 7 i n6d a y s , t h ed e l t a m e t h r i nd e g r a d i n gr a t ew a s3 3 2 1 i n6d a y s s o i lg l y p h o s a t e - d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m sw e r et h o u s a n d su p o nt h o u s a n d s ，t h ek e y w a st of i n dt h es t r a i nh a dt h eb e s ta b i l i t yt od e g r a d et h eg l y p h o s a t e ，h a dm i n i m u m i n f l u e n c e b ye n v i r o n m e n l a n ds t u d i e dd e g r a d i n g a 屹y m ea n dg e n e ， c u l t i v a t e d g l y p h o s a t e - t o l e r a n t a n d g l y p h o s a t e - d e g r a d i n gt r a n s g e n i cc r o p s c r o p sc a t a l y z e d l i l 草甘瞵降解菌g - 6 的分离及降解特t 牛的研究 g l y p h o s a t et om e t a b o l i z e ，p r o d u c en o n t o x i cp r o d u c t s ，t h eh a r mo fg l y p h o s a t ec o u l d e l i m i n a t e s t r a i ng - 6s h o w e d8 6 5 2 g l y p h o s a t ed e g r a d a t i o ni n4 8h o u r si n3 0 0m m o f l g l y p h o s a t em i n i m a lm e d i u m , t h em a x i m a lg l y p h o s a t e t o l e r a n tc o n c e n t r a t i o nw a so v e r 5 0 0m m o l l ，c o u l dc o m m e n d a b l ya d a p tt ov a r i o u se n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，s u c ha s t e m p e r a t u r e ，a c i da n da l k a l ic h a n g e ，h e a v ym e t a li n n sp o l l u t i o n s t r a i ng - 6h a db r i g h t a p p l i e df o 唧 o u n d , i te s t a b l i s h e df o u n d a t i o nt o i s o l a t ed e g r a d i n ge n z y m eg e n ea n d c u l t i v a t eg l y p h o s a t e - t o l e r a n ta n dg l y p h o s a t e - d e g r a d i n gt r a n s g e n i cc r o p s ，i tw a sn e w m i c r o b i a lr c s o u l c et od e g r a d e g l y p h o s a t e k e yw o r d s ：g l y p h o s a t e ；d e g r a d a t i o n ；i s o l a t i o n ；h p l c 华中农业大学2 0 0 6 年硕十研究生毕业论文 缩略词 l d s o m l d e c s o h ：p l c e d i a s d s d h 2 0 删 l b a m p 陀 c m k m r d n a p c r t a e 缓冲液 e b 缩略语表 中文名 半致死剂量 最小致死剂量 半有效浓度 高压液相色谱 乙二胺四乙酸 十二烷基苯磺酸钠 去离子水 基础盐培养基 l b 培养基 氨苄青霉素 盐酸四环素 氯霉素 卡那霉素 核糖体d n a 聚合酶链反应 英文名 5 0 l e t h a ld o s e m i n i m u ml e t h a ld o s e 5 0 e f f e e t i v ec o n c e n t r a t i o n h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t a t i ca c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e d e i o n i z e dw a t e r m i n i m a lm e d i u m l u r i a - b e r t a n im e d i u m a m p i c i i l i n t e t r a c y c l i n e c h l o r o m y c e t i n k a n a m y c i n r i b o s o m a ld n a p o l y m e r a s ec h a i nr e a e t i o n m t r i s 乙酸e d t a 缓冲液t f i s - a c e t a t e e d t a 溴化乙锭 e t h i d i u mb r o m i d e v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学t 奇论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 参l 丽琴 时间：2 0 0g 年占月2 2 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存，汇编学位论交。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表传 播学位论文的全部或部分内容 一 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 卜 学位论文作粼：袁l 颓琴 导臌：斌 签名日期：加5 年6 月z 2 日签名日期：2 岬彳年月z 乞日 华中农业大学2 0 0 6 年硕士研究生毕业论文 第一部分前言 草甘膦( g l y p h o s a t e ) 是1 9 7 4 年由美国孟山都公司( m o n s a n t o ) 率先在美国注册登 记，被评为当年最优秀的农药( 徐声杰，1 9 9 8 ) ，至今已在世界1 0 0 多个国家注册， 成为世界上除草剂使用量最大的品种之一( 任不凡等，1 9 9 8 ) 。1 9 9 4 年全球草甘膦销 售额为1 0 亿美元，1 9 9 6 年就已经超过了2 0 亿美元，近5 年来销售额每年增长2 0 ( 欧 阳嘉，2 0 0 0 ) 。我国自八十年代开始生产草甘膦，进入九十年代后草甘膦的产量约占 除草剂年总产量的l ，3 ，已成为继美国之后世界第二大生产和出口国。 草甘膦是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，对4 0 多种一年生，多年生，单子 叶和双予叶木本，草本植物有杀伤作用，对多年生草的地下组织破坏力尤强，广泛 用于橡胶园，果树，茶园，桑园，甘蔗田和林业除草。草甘膦理化性质稳定，具有 高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性等其它除 草剂所不可比拟的优点。 草甘膦在杀灭杂草的同时对农作物同样有着毒害作用，草甘膦施用后可被作物 迅速吸收，并随同化产物传导至整个植株，对植物细胞分裂、叶绿素合成，蒸腾、 呼吸以及蛋白质等代谢过程发生影响而导致作物死亡，从而限制了其使用范围和使 用时间。草甘膦毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5 一烯醇丙酮莽草酸- 3 - 磷酸合成酶( 5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e 3 p h o s p h a t e s y n t h a s e ，简称e p s p 合成酶) 的活 性。e p s p 合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸生物合成过程中的一个关键酶， 该酶由a r o a 基因编码。 如果能有草甘膦抗性或降解农作物出现，则既能大大地节省农业生产费用，又 能极大地促进草甘膦工业的发展，研制抗或降解草甘膦的转基因作物一直是研究的 热点( 苏少全，1 9 9 9 ) 。许多微生物对草甘膦具有降解作用，若将降解草甘膦的基因 克隆后转入农作物，在植物中将草甘膦快速催化代谢为无毒产物，就可解除草甘瞵 对农作物的危害( b u j a c z e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 从1 9 7 6 年至2 0 0 4 年2 月，美国公布了2 7 5 6 份关于抗草甘膦转基因作物的专利， 孟山都公司创制了一系列抗草甘膦作物，种植面积尤为引人注目耐草甘膦的转基 因农作物在北美和其他许多国家也已被广泛应用( 贾士荣，1 9 9 5 ) 革甘瞵降解菌g - 6 的分离及降解特性的研究 1 草甘膦的特性 英文通用名称：g l y p h o s a t e o hhh 哟h o ) 盐一( o ( 一c 乏o 。h 7 li 、 hh 1 1 草甘膦的物理性质 纯净草甘膦是非挥发性、白色，无味晶体，密度为o 5g l ，熔点为2 3 0 1 2 ( 伴随 分解) 。2 5 1 2 时在水中溶解度是1 2g ，1 0 0 ( 2 时是1 3 6g 。不溶于无水乙醇、乙醚、 苯等有机溶剂，不可燃、不爆炸，常温下稳定，便于贮存、运输。 1 2 草甘膦的化学性质 草甘膦，化学名n 一( 膦酸甲基) 甘氨酸，分子式( h o ) 2 p ( o ) c h 2 n h c h 2 c o o h 。 其分子上由于有活泼氢，所以在一定条件下能发生分子问缩合反应、亚硝化反应、 膦酰、甲基化反应、酰化反应、烷基化反应、络合反应等。草甘膦是一种有机酸， 对大多数金属有腐蚀作用。草甘膦极性强，呈结晶型，以两性离子存在，分子间强 烈的氢键使其晶格很稳定。草甘膦可与碱生成极易溶于水的盐，同时不损失除草活 性。草甘膦的盐类对植物的毒性各不相同，尤其是异丙胺盐对植物毒性最高。 2 华中农业大学2 0 0 6 年硕士研究生毕业论文 1 3 草甘膦的生物特- 陛 1 3 1 具有良好的生物活。性 草甘磷喷于植物茎叶上，即被植物体吸收，并能迅速输导至根部，因此它不仅 能杀死绿色植物的地上部分，而且能斩草除根，它能防除那些较难防除的靠根系繁 殖的多年生杂草及一些小灌木。一般而言，植物受作用后2 4 2 8h 内传导到根部、 叶部，一年生杂草在2 - 4 天，多年生杂草在7 1 0 天即显示明显的受害症状：失绿， 发黄，枯萎和死亡。 1 3 2 在环境中较易降解 草甘膦在土壤中主要依靠土壤微生物降解。半衰期约为6 0 天左右，6 个月后约 有9 0 已降解为水、二氧化碳等，降解产物实质上是细菌的营养料，不易被雨水淋 溶而进入地表水。 1 3 3 在动物、水生物中不积累 草甘膦在动物、鸟类或水生物( 如鱼、虾、蚌等) 中不积累。 1 3 4 毒性 j e f r a n z 首先报道草甘膦对植物具有强烈毒害，而对人、畜的毒性极小，大白 鼠l d 5 0 值为4 3 2 0 m g k g ，兔m i d 值大于7 9 4 0 m g k g ，鱼e c 5 0 值为每千克大于千分 之一毫克。另外，草甘膦代谢物对动、植物无毒害。 草甘膦进入植物体内，抑制5 一烯醇丙酮基莽草酸一3 一磷酸合酶( e p s p 酶) ，使植 物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，导致植物死亡。而人及动物与植物的 代谢不同不需要合成那些芳香氨基酸，因此草甘膦对人及动物安全。 安全界限( s a f e t y m a r g i n ) ：一般除草剂，它在食物中最高允许残留量或在制造场 合的最高允许量的1 0 0 倍，小于它对动物的最高无作用剂量，则认为是安全的。而 草甘膦的安全界限是在食物中最高允许量的1 0 0 0 倍，是在制造场合最高允许量的 7 0 0 倍，因此它比一般除草剂更安全 草甘瞵降解菌( 3 - 6 的分离及降解特件的研究 1 3 5 不易产生抗性 草甘膦以它的作用方式、化学结构，在植物体内有限的代谢、使用方法及无残 留活性的特点，是不易产生抗性的理由。自1 9 7 4 年草甘膦在美国注册登记以来，至 今已经使用3 0 多年，仅仅只有几种杂草报道过产生了草甘膦的抗性，表l 描述了6 个品系的生物类型对草甘膦产生抗性( 柏亚罗，2 0 0 5 ) ，草甘膦产生抗性的杂草发展 速度明显要慢于其他类型的除草剂。 表1 已报道的草甘膦抗性杂草 t a b l e lt h er e p o r t e dg l y p h o s a t e - t o l e r a n tw e e d s 抗性杂草种类发生国家或地区 野塘蒿c o n y z ab o n a r i e n s i slh a i r yf l e a b a n e 小b 蓬c o n y z ac a n a d e n s i slh o r s e w e e d 牛筋草e l e u s i n ei n d i c alg o o s e g r a s s 多花黑麦草l o l i u mm u l t i f l o r u ml a i ni t a l i a nr y e g r a s s 瑞士黑麦草l o l i w nr i g i d u mg a u dr i g i dr y e g r a s s 长叶车前p l a n t a g ol a n c e o l a t alb u c k h o r np l a n t a i n 2 0 0 3 年， 2 0 0 0 年， 2 0 0 1 年， 2 0 0 2 年， 2 0 0 2 年。 2 0 0 2 年， 2 0 0 2 年， 2 0 0 3 年， 2 0 0 3 年， 2 0 0 3 年， 1 9 9 7 年， 2 0 0 1 年， 2 0 0 2 年， 1 9 9 6 年， 1 9 9 7 年， 1 9 9 8 年， 2 0 0 0 年， 2 0 0 1 年， 2 0 0 3 年 南非 美国( 特拉华州) 美国( 田纳西州) 美国( 印弟安纳州) 美国( 马里兰州) 美国( 新泽两州) 美国( 俄亥俄州) 美国( 阿肯色州) 美国( 密西西比州) 美国( 北卡罗莱纳州) 马来西亚 智利 智利 澳大利亚( 维多利亚) 澳大利亚( 新南威尔士) 美国( 加利福尼亚) 澳大利亚 南非 南非 4 华中农业大学2 0 0 6 年硕十研究生毕业论文 由以上几方面可以看出，草甘膦是一种高效、广谱、低毒，对人、动物、水生 物、对环境都较安全的除草剂，是免耕地、少耕地生产模式最理想的杂草防除药剂 之一，商业价值极高。 2 草甘膦的检测方法 2 1 色谱检测法 2 1 1 薄层色谱法 薄层色谱法是化学的一种分离和分析方法。化学上经典的定性鉴别，例如经典 的有机定性分析或经典的毒物分析，是利用各种化合物的溶解度不同和所含功能基 的不同，用溶剂提取或用试剂处理，把它们分组或分为单一组分，然后作试管反应 或点滴反应( 颜色反应) ，或根据它们衍生物的理化性质进行定性鉴别。这种方法的 缺点是样品用量较大，分离手续麻烦，分析时间较长( 几小时或几十个小时) ，并可 能有杂质干扰。 采用合适的展开剂和现色剂在薄层上作为分离和鉴别，根据样品中组分的值和 现色情况，同时用标准作对照，一般即能确证为某一化合物。用薄层色谱法定性， 样品用量小，分离方便，分离时间短( 几分钟或几十分钟) ，检出灵敏度高。 由于草甘膦不溶于醇，在水中溶解度也不大，常用水、醇混和溶剂作展开剂， 用水合茚三酮、罗丹明b 、硝酸铜作显示剂。 药品的纯度，通常用熔点，吸光值等物理常数作为鉴定的指标。薄层检查也是 药品质量控制和杂质检查的一种有效方法，有时甚至比一般方法更有效。一些国家 的药典和药品规范已经采用。 在化学反应进行到一定时间或反应终了时，把反应液取出作薄层分析，可以知 道还剩下多少原料药未起作用。 选用什么吸附剂和洗脱剂较好，各个组分按什么顺序从柱中沈脱出来，每一份 洗脱液中是含单一组分或就含几种没有分开的组分等，都可以在薄层上进行探索和 检验。薄层上所有的展开剂虽不完全照搬柱色谱法，但仍有参考价值。 革什磷降解菌g - 6 的分离及降解特件的研究 2 1 2 气相色谱法 气相色谱是采用气体为流动相的色谱法，作为流动相的气体一载气，是不与被 测物质作用，用来载送样品的惰性气体( 如氢、氮等) 。载气携带着欲分离的样品通 过色谱柱中固定相，使样品中各组分分离，然后分别进入检测器。载气由高压钢瓶 供给，经减压阀减压后，进入载气净化干燥管以除去载气中的水分。由针形阀控制 载气的压力和流量。流量计和压力表用以指示载气的柱前流量和压力。再经进样器 ( 试样就从进样器注入) ，样品随着载气进入色谱柱，将各组分分离后依次进入检测 后放空。检测器信号由记录仪记录，就可得到色谱图，图中每个峰代表混合物中的 一个组分。 草甘膦在2 0 0 左右易分解，多转变为特殊衍生物后，用于气相色谱分析。 气相色谱法具有分离效能高、灵敏度高、选择性好、分析速度快、用样量少等 特点，还可制备高纯物质。 2 1 3 高压液相色谱法 高压液相色谱法( h p l c ) 是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分 离、分析技术。 经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流 动，因此分析速度慢，分离效率低。 新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相 继发明，使得高压液相色谱法迅速发展起来。 高压液相色谱法由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高压液 相色谱法分离效率极高。使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在 柱后直接检测洗脱组分等，h p l c 完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟， 比经典液相色谱快得多。高灵敏度检测器的使用，使h p l c 可以检测微量的草甘 膦。 关于高压液相色谱法的文献报道最多，可以分为三大类。 一是流动相为水、醇混合液，水占9 5 以上，以k h 2 p 0 4 - h 3 p 0 3 或h a c - n a o a c 作为缓冲溶液，直接上柱，用紫外或荧光检测器检测。 二是将草甘膦在茚三酮或其他特殊试剂作用下变为衍生物并酯化后，用荧光检 6 华中农业大学2 0 0 6 年颤仁研究生毕业论文 测器检测。 三是将草甘膦用丹酰，d a n s y l ，卜二甲胺基萘一5 一磺酰等转化为衍生物后，于反 相高压液相色谱中，用荧光检测器检测。 2 1 4 色一质联用法 利用丙酸酐和甲醇或其他试剂作为衍生化试剂，水相挥干后进行衍生化反应， 草甘膦转化为n 一三氟乙酰草甘膦或其他衍生物后，经色谱一质谱联用进行分析。 色谱法分析灵敏度高，但要经过许多特殊处理，需要一些特殊柱型、检测器， 多用于微量、痕量分析，如检测环境中或生物体内草甘膦的残留量。 2 2 化学分析法 2 2 1 滴定法 首先提出的是用硝酸铅、硝酸镍与草甘膦形成络合物的电位滴定分析方法，周 ， 洁薇在提出以溴百里酚蓝碱指示剂来快速测定草甘膦的分析方法并进行了改进后， 又提出了以硝酸铅为标液、碘化钾为指示剂的两步滴定法，分析结果更为准确。最 可行的是亚硝化滴定法，以亚硝酸钠为标液，用碘化钾淀粉试纸检测终点，可较快 较准确地测出试样中草甘膦的含量。 2 2 2 紫外分光光度法 由于草甘膦是仲胺化合物，易被亚硝化，其亚硝基化合物在3 4 3n n l 处有吸收 峰，因此，可采用紫外分光光度法分析( 薛铭华等，1 9 8 2 ) 。 化学分析法操作简单、快速，是更适合于草甘膦工业分析的方法。 2 3 生物测定法 生物测定( b i o a s s a y ) 是通过测定草甘膦对生物影响程度，来确定它的生物活性、 7 草片瞵降解菌g - 6 的分离及降解特t ! 的研究 毒力等。草甘膦生物测定和其他农药的生物测定一样必须在可控的条件下进行。 生物测定可以广泛应用于许多方面，凡是和草甘膦生物活性相关的研究都可采 用生物测定的方法。归纳生物测定应用的范围，可包括如下几个方面：除草活性的 确定；杀草谱的确定；最佳用药浓度和用药时期的确定；对作物安全性的研究；复 配后联合效果的判别；环境条件对除草活性的影响；在水体，土壤中的残留活性和 在土壤中的淋溶性；抗药性和耐药性杂草的鉴定。 常规生物测定一般是利用生物活体作靶标，通过观察草甘膦对靶标生物的生长 发育、形态特征、生理生化等方面的反应来判断除草剂的生物活性。除草剂的作用 方式很多，如抑制光合作用、呼吸作用、细胞分裂，干扰蛋白质、脂类、叶绿素等 的生物合成以及生长的激素控制等。在进行草甘膦生物测定时，应根据草甘膦的作 用方式选择靶标生物和相应的测定方法。 。 对那些已知作用靶标的除草剂，生物测定可在酶水平上进行。对草甘膦的生物 活性，可以通过测定植物体内莽草酸的累积量来测定。因为草甘膦作用于芳香族氨 基酸合成过程中的一种重要酶一e p s p 合成酶，导致莽草酸积累，因此测定植物体 内莽草酸的累积量可以得知草甘膦活性的大小。 生物测定通过测定草甘膦对生物影响程度，来确定它的生物活性、毒力等。 3 草甘膦的作用机理 草甘瞵毒性作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸 ( p e p ) 和3 一磷酸莽草酸( s 3 p ) 合成5 一烯醇式丙酮酸- 3 一磷酸莽草酸的5 一烯醇式丙酮 莽草酸- 3 - 磷酸合成酶( e p s p 合成酶) ( 图1 ) 。 1 9 6 9 年a h m e d 等在研究真菌体中芳香族氨基酸的生物合成过程时，首次发现 一酶催化第六步合成，将其定名为3 - p h o s p h o s h i k i m a t e 1 - c a r b o x y v i n y lt r a n s f c r r a s e ( a h m e de ta i ，1 9 6 9 ) ，1 9 7 4 年改名为5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e - 3 一p h o s p h a t e s y n t h a s e ， 即5 一烯醇式丙酮酸莽草酸- 3 - 磷酸合成酶，简称e p s p 合成酶。1 9 6 9 年、1 9 7 0 年， b a e l y 等又相继从细菌、高等植物中分离出了e p s p 合成酶；1 9 7 2 年j a w o r s k i 等首 先报道了草甘膦抑制植物体内芳香族氨基酸的生物合成；1 9 7 4 年草甘膦作为除草剂 在美国获得登记；1 9 8 0 年s t e i n r u e k e n 等证实了草甘膦抑制e p s p 合成酶的活性。此 3 华中农业大学2 0 0 6 年硕士研究生毕业论文 后又对e p s p 合成酶的生化性质等进行了广泛深入的研究。 e p s p 合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸( 包括色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸) 生物合成过程中一个关键性的酶( k i s h o r ee ta 1 ，1 9 8 8 ) 。芳香族氨 基酸的合成途径一从磷酸烯醇式丙酮酸( 糖酵解中间产物) 和赤藓糖_ 4 一磷酸( 五碳糖 磷酸途径中间产物) 开始，到合成莽草酸、分枝酸是植物和微生物所共有的。芳香族 氨基酸参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、吲哚衍生物、酚类物 质等的次生代谢，草甘膦专一性地抑制e p s p 合成酶的活性导致分枝酸合成受阻， 阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，对植物细胞分裂、叶绿素合成、 蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程产生影响而导致植物死亡，扰乱生物体正常的氮 代谢而使其死亡( 向文胜等，2 0 0 0 ) 。 鼬0 舱墙 肿_ 。 o h 4 - 嘲t 毒肆鼙 c 0 2 l 舢a 锄 ，- 曩貅翠 h ：j e ：一 c r o i 啪 c 0 0 - 知聪煞生患瞳 c t j o 伽淑革a 删￥胁a o h 莽蕈奠 c o o - 。j ：加 伽唧伽丹挂t o h 尊草睦辛鬻艘 籍瓶 疆苯蕞 擎氯囊 靠蕾摹摹甲磕一色奠 褂氨基聋甲奠 图1 植物和微生物体内芳香族氨基酸合成的莽草酸途径 a 莽草酸脱氢酶b 莽草酸激酶c e p s p 合成酶d 分枝酸合成酶 f i g u r e 1t h es h i k i m a t ep a t h w a y i np l a n t sa n dm i c r o - o r g a n i s m s a s h i k i m a t ed e h y d r o g e n a s eb s h i k i m a t e k i n a s e c e p s p s y n t h a s ed c h o r i s m a t e s y n t h a s e 9 阱众 草甘瞵降解菌g - 6 的分离及降解特件的研究 草甘膦抑制e p s p 合成酶机理的研究是从1 9 8 3 年开始，b o o c o c k 等认为s 3 p 首 先与e p s p s 结合，然后与草甘膦结合形成e p s p s s 3 p g l y p h o s a t e 三元配合物，即草 甘膦占据了p e p 与酶连接的活性位点，从而阻断了s 3 p 与p e p 的结合。1 9 9 2 年r e a m 等利用等温滴定微热量计和荧光结合测定证实了b o o c o c k 的理论，1 9 9 5 年s a m m o n s 等在以e p s p 为底物的条件下，用快速凝胶过滤试验证明在草甘膦的作用下，产物 e p s p 分子中丙酮酸基团不仅没有阻止草甘膦与酶结合，反而强烈地促进了草甘瞵 与酶的结合。 研究表明，较高浓度的草甘膦对芳香族氨基酸生物合成途径中其他酶也能产生 抑制作用。r u b i n 等通过离子交换层析法从绿豆幼苗中分离、纯化了莽草酸脱氢酶、 分枝酸变位酶、芳香族氨基酸转移酶、预苯酸脱氢酶和a r o g c n a t a 脱氢酶，这些酶被 lm m o l l 的草甘膦轻微抑制，另外还分离出两种d a h p 合成酶，其中之一的d a h p 合成酶- m n 可以被m n 2 + 激活，另一种d a h p 合成酶- c o 的激活则完全依赖c 0 2 + 的 存在。d a h p 合成酶- m n 不被草甘膦抑制，而d a h p 合成酶一c o 的活性则9 5 以上 受到抑制，就两种底物来说，c o 是最大反应速度激活剂。在微浓度草甘膦下，仅抑 制e p s p 合成酶，对其他酶没有影响。 草甘膦是除草活性最强的有机磷农药，施用后可被植物迅速吸收，并随同化产 物传导至整个植株，对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢 过程发生影响而导致植物死亡。研究表明草甘膦对植物的生长抑制可能有四种机制： 阻断植物体内芳香族氨基酸和莽草酸的生物合成；抑制叶绿素、胡萝卜素、叶黄素 的生物合成；抑制光合磷酸化及a t p 酶的活性；抑制植物细胞的有丝分裂。 l 阻断植物体内芳香族氨基酸生物合成( 苏少泉，1 9 8 9 ) 草甘膦问世不久，就已经证明它是通过抑制芳香氨基酸的生物合成而杀死杂草 的。1 9 8 0 年s t c i n r u c k c n 等人进一步证明，草甘膦是植物体内e p s p ( 5 一烯醇内酮酰 莽草酸一3 一磷酸合成酶) 的特效抑制剂。这种酶是植物体内芳香氨基酸生物合成过程 中一种重要的酶，此酶包括质体e p s p 合成酶，胞质e p s p 合成酶及胞质一3 一脱氧一d 一 阿拉伯庚酮一7 一磷酸合成酶。众所周知，抑制芳香氨基酸合成，一是抑制含有这些氨 基酸所组成的蛋白质的生物合成，二是抑制了植物生长过程中细胞壁多聚体木质素 的形成。 既然草甘膦抑制芳香氨基酸的生物合成，那么外加芳香氨基酸，即苯丙氨酸酪 氨酸、色氨酸应当有明显的解毒效应，然而试验的结果虽然有相当作用，但并不理 1 0 华中农业大学2 0 0 6 年硕十研究生毕业论文 想。现已分离出e p s p 酶的基因为a r o a ，命名为c l y p h o t o l ，将此基因转入到烟草、 番茄、大豆等品种，通过细胞培养再生植株，亦已获得了抗草甘膦的烟草、番茄、 大豆等品种，但距实用化还有一定距离。这些意味着草甘膦除抑制e p s p 酶外，还 有一些其它抑制途径。 2 抑制叶绿素、胡萝卜素、叶黄素的生物合成 早在1 9 8 3 年，f o l e y 证明草甘膦抑制核酸的生物合成，c a m p b e l l l 9 7 6 年证明草 甘膦对叶绿体亚微结构有影响。草甘膦抑制叶绿体核糖体、叶绿体r n a 及色素的 形成。较为系统研究的是日本松中昭一，他1 9 8 7 年对草甘膦抑制的其它途径作了全 面的研究。草甘膦除抑制芳香氨基酸外还抑制胡萝卜素、叶黄素的生物合成，作用 部位在丙酮酸之后的乙酰辅酶a 到类胡罗卜素中间。此外草甘膦还抑制叶绿素的生 成，作用部位在琥珀酰c o a 与6 一氨基r 酮戍酸中日j 。尽管如此，人们对草甘膦作 用机理的研究并未终止，继续研究为什么在除草浓度范围内减少叶绿素、胡萝卜素 含量，而在5m g 分子浓度处理豌豆叶片并不抑制叶绿体的光合作用，以及草甘膦： 对叶绿体能量转换有何影响等。 3 抑制光合磷酸化及a r p 酶的活性 尽管对草甘膦的作用机理作了许多研究，有许多问题人们仍解释不了。如草甘 膦杀草能力如此强，但在杂草幼苗期表现不突出，而在杂草旺盛生长阶段应用效果 最佳，又如草甘膦经由绿色部位才能起作用，而且为什么处理后一周才看出效果，童 还有将e p s p 基因转到某些作物上为什么抗草甘膦的能力不尽人意。随着进一步的 研究，得到了较为满意的答复。1 9 8 6 年我国首次发现草甘膦能抑制光合作用中的光 合磷酸化，而且对循环及非循环磷酸化均有抑制作用，草甘膦的作用部位主要是抑 制a t p 酶的活性。 这一发现表明，植物光合作用是植物为了生长发育制造光合产物及能量必不可 少的生命活动，抑制光合作用中生物能的形成，也就会有效抑制光合产物的生成。 光合作用包括光反应及暗反应，光反应是生成能量的反应，即将太阳能转化为生物 能的过程。植物将c 0 2 同化为光合产物的反应，是消耗能量的反应。抑制光合膦酸 化，造成光能不能生成a t p 及n a d p h ，也就使暗反应因得不到a t p 及n a d p h 而 受到抑制，从而阻抑了植物的新陈代谢。 草甘膦对光合磷酸化的抑制，越是杂草绿色体大时，受药面积也就越大，故而 杀伤效果越好。另外，由于草甘膦是磷酸与甘氨酸的衍生物，所以它进到叶绿体被 草什瞵降解菌g - 6 的分离及降解特件的研究 膜内不那么快，一般处理后5 - 6 天后才见到效果。这与生产上处理后近一周见效相 吻合。因为草甘膦仅抑制光合作用中的磷酸化，所以它必须经由绿色部位才起作用。 由于它并不抑制呼吸过程中的氧化磷酸化，非绿色部位吸收草甘膦后自然起作用不 大。 草甘膦在毫克分子浓度下是光合磷酸化抑制剂，在微克分子浓度下又对磷酸化 略有促进作用，表明草甘膦具有植物生长物质的应用潜力 4 抑制植物细胞的有丝分裂 施用草甘膦后，植物的根尖变形，细胞不能维持正常的形状。研究表明，草甘 膦能和一个约6 5k d 的蛋白质结合，该蛋白质的功能是维系有丝分裂过程中出现的 微管结构的稳定。结果导致微管不稳定，不能形成长的骨架，只能形成一些短的微 管，使纺锤体无法形成，有丝分裂停滞在前中期