（基础兽医学专业论文）饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 卺 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书面使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 。研究生签名：易程尝 时间：矽舻年石月歹日 学位论文使用授权书 据股份有限公司将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库：| ，并进行信 息服务( 包括但不限于汇编，复钥发行、信息网络传播等x 同时本人保留在 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保 蝴黼馘：易秘：骨f 之住 签名日期：吖p 年莎月厂日 签名日期： 础年歹月占日 l l 目录 摘要l a b s t r a c t 2 缩略语表”4 l 前言5l 翮磊。5 1 1 研究的背景和意义5 1 2 益生菌的概念6 1 3 益生菌的发展历史和应用概况7 0 4 益生菌作用的理论依据8 1 5 益生菌的作用机理1 0 1 5 1 优势种群作用”l o 1 5 2 生物夺氧作用1 0 1 5 3 生物拮抗作用1 0 1 5 4 增强机体的免疫功能1 l 1 5 5 产生有益代谢产物及抗菌物质1 1 1 5 6 合成酶类及营养物质”1 2 1 5 7 防止有害物质的生成，改善机体环境及养殖环境1 2 1 6 益生菌的种类及特性1 3 1 7 益生菌的安全性”1 3 1 7 1 对宿主的致病性”1 3 1 7 2 代谢活性( 与产生有害代谢产物相关的酶的活性) 1 4 1 7 3 血小板凝集活性与粘膜降解活性1 4 1 7 4 益生菌的耐药性“1 4 1 8 理想益生菌应满足的条件1 5 1 9 影响益生菌使用效果的因素1 5 1 9 1 益生菌制剂的质量1 5 1 9 2 添加的剂量和饲喂方式1 5 1 9 3 益生菌添加剂的应用宿主范围1 6 1 9 4 动物的不同生理状况和病理状况对益生菌发挥的益生功能有一定 的影响1 6 1 9 5 动物所处的环境条件”1 6 1 9 6 饲料日粮中抗菌物质的含量“1 6 1 1 0 益生菌的发展趋势1 7 1 1 0 1 抗菌药物与益生菌的协同作用和拮抗作用”1 7 1 1 0 2 益生菌和其他相关物质的优势互补作用1 7 1 1 0 3 有针对性地筛选新的益生菌菌种1 7 1 1 0 4 筛选可以产生抑制或杀死致病性细菌的细菌素的细菌菌1 8 1 1 0 5 利用克隆技术克隆和表达所需的基因1 8 1 1 l 研究内容和目标1 8 1 1 1 1 研究内容l8 1 1 1 2 研究目标1 9 2 材料和方法”l9 2 1 试剂、药品及仪器”1 9 2 1 1 试验试剂”l9 2 1 2 试验药品”l9 2 1 3 试验仪器2 0 2 2 试验菌株“2 0 2 3 培养基和抗菌储备液的配置2 0 2 3 1 培养基的配制2 0 2 3 2 抗菌储备液的配制2 l 2 4 菌液的制备”2 3 2 5 细菌的计数方法( 沈萍，2 0 0 7 ) 2 3 2 6 粪肠球菌和枯草芽孢杆菌繁殖速率的测定方法2 5 2 7 粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对抗菌药物的敏感性试验方法2 6 2 8 益生菌对致病菌和有益菌生长影响的测定2 8 2 8 1 粪肠球菌对大肠杆菌0 5 4 生长的影响2 8 2 8 2 枯草芽孢杆菌对大肠杆菌0 5 4 生长的影响2 8 2 8 3 粪肠球菌对霍乱沙门氏菌a 7 2 生长的影响2 8 2 8 4 枯草芽孢杆菌对霍乱沙门氏菌a 7 2 生长的影响2 8 2 8 5 粪肠球菌对嗜酸乳酸杆菌c i c c 6 0 7 5 生长的影响2 8 2 8 6 枯草芽孢杆菌对嗜酸乳酸杆菌c i c c 6 0 7 5 生长的影响2 9 3 结果与分析2 9 3 1 粪肠球菌与枯草芽孢杆菌的世代时间测定结果2 9 3 1 1 粪肠球菌的世代时间”2 9 3 1 2 枯草芽孢杆菌的世代时间”2 9 3 2 粪肠球菌与枯草芽孢杆菌对抗菌药物的敏感性试验结果2 9 3 3 饲用益生菌对致病菌和肠道正常菌生长繁殖的影响3 l 3 3 1 粪肠球菌对大肠杆菌0 5 4 、霍乱沙门氏菌a 7 2 及嗜酸乳酸杆菌 c i c c 6 0 7 5 生长繁殖的影响3 l 3 3 2 枯草芽孢杆菌对大肠杆菌0 5 4 ，霍乱沙门氏菌a 7 2 及嗜酸乳酸杆 菌c i c c 6 0 7 5 生长的影响一3 4 4 讨论3 7 4 1 影响细菌计数准确性的因素”3 7 4 1 1 菌悬液计数稀释度的选择”3 7 4 1 2 涂布平皿时的操作方法3 7 4 2 细菌世代时间的测定3 7 4 3 抗菌药物敏感性试验3 8 4 3 1 影响药物敏感性试验结果的因素3 8 4 4 细菌混合培养基的选择3 9 4 5 细菌混合培养计数琼脂平板的选择4 0 4 6 药物敏感性试验结果分析4 1 4 7 细菌混合培养试验结果分析4 2 5 结论4 3 5 1 首先测定了粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的世代时间4 3 5 2 测定了粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对抗菌药物的敏感性4 3 5 3 研究了粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌0 5 4 、霍乱沙门氏菌 a 7 2 和肠道正常菌嗜酸乳酸杆菌c i c c 6 0 7 5 生长繁殖的影响4 4 参考文献”4 5 致谢”5 3 附录5 3 l 饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究 摘要 目前在中国的养猪业生产过程中，治疗猪的肠道疾病主要依赖抗菌药物，但 是抗菌药物的缺点较为明显，如耐药菌株的产生，环境污染，药物残留等，直接 危害人类的健康。随着欧盟饲用抗菌药物的禁用、人们健康意识和环保意识的增 强，在中国抗菌药物的添加迟早会受到一定的限制，因此开发无污染、无残留、 不产生耐药性的绿色饲料添加剂是将来发展的方向。 本试验选用了粪肠球菌和枯草芽孢杆菌作为试验菌株，测定了它们的世代时 间，它们对常用抗菌药物的敏感性，以及对致病性大肠杆菌0 5 4 、霍乱沙门氏菌 a 7 2 及正常菌嗜酸乳酸杆菌c i c c 6 0 7 5 生长的影响。 试验采用l b 培养基，于3 7 、1 5 0 r m i n 条件下培养6 h ，结果表明粪肠球 菌和枯草芽孢杆菌的世代时间( g e n e r a t i o nt i m e ) 分别为2 3 9 和2 9 4 m i n 。这表明 它们具有较快的繁殖速度。 根据c l s i 推荐的标准操作方法之一的常量稀释法( m i e r o d i l u t i o n ) 研究了 粪肠球菌和枯草芽孢杆菌分别对林可霉素( l c m ) 、恩诺沙星( e n r ) 、磺胺嘧啶 ( s d ) 、硫酸链霉素( s m ) 、氨苄青霉素纳( a m p ) 、延胡索酸泰妙菌素( t m l ) 、泰乐 菌素( t y l ) 、氟苯尼考( f l o ) 、硫酸多粘菌素b ( p l m ) 、盐酸头孢噻呋( c t x ) 和多 西环素( d c ) 的最低抑菌浓度( m i c ) ，试验结果表明，粪肠球菌对上述各种抗菌 药物的m i c 值分别为6 4 、0 5 、 2 5 6 、6 4 、4 、2 5 6 、4 、4 、 2 5 6 、2 5 6 、 2 5 6 、8 、1 6 、2 5 6 、2 、2 、2 5 6 、3 2 、0 5 ，按照相应的判定标准，枯草芽 孢杆菌对s d 、l c m 、t m l 、p l m 和c t x 较为耐药，临床上可以和这些抗菌 药物配伍应用，枯草芽孢杆菌对e n r 、t y l 、f l o 和d c 较为敏感，l 晦床上不 宜和它们配伍应用。 试验通过混合培养的方式研究了粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆 菌、霍乱沙门氏菌及肠道正常菌嗜酸乳酸杆菌生长的影响，试验结果表明，粪肠 球菌和枯草芽孢杆菌均可较好的抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长；粪肠球菌对嗜 酸乳酸杆菌可以起到较好的促生长作用；枯草芽孢杆菌与嗜酸乳酸杆菌混合培养 的前3 5 h ，对嗜酸乳酸杆菌有一定的抑制作用，但3 5 h 以后则对其有较好的促生 长作用。 关键词：粪肠球菌，枯草芽孢杆菌，最低抑菌浓度，混合培养 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t n o wi nt h ep r o c e s so fs w i n ei n d u s t r yi nc h i n a , t h et r e a t m e n to fi n t e s t i n a li n f e e t i o n s m a i n l yr e l i e so na n t i m i e r o b i a l s ，b u ti th a ss o m eo b v i o u sd i s a d v a n t a g e s ，s u c ha sb a c t e - r i a lr e s i s t a n c e ，e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n ，d r u gr e s i d u e sa n ds oo n , d i r e c t l ye n d a n g e r h u m a nh e a l t h w i mt h eb a n n i n go ng r o w t h p r o m o t i n g _ a n t i m i c r o b i a l s _ i ne u r o p e a na n d t h ei n c r e a s eo fh e a l t ha w a r e n e s sa n de n v i r o n m e n t a la w a r e n e s so fn a t i o n a l ，t h eu s e o fa n t i m i c r o b i a l si nc h i n aw i l ls u b j e c tt oc e r t a i nr e s t r i c t i o n s od e v e l o p i n gs a f ef e e d a d d i t i v et h a tn op o l l u t i o n ，n or e s i d u e ，n or e s i s t a n c ei st h ed i r e c t i o no fl i v e s t o c k i n d u s t r y i nt h i ss t u d y , g e n e r a t i o nt i m ea n ds u s c e p t i b i l i t yo fe n t e r o c o c c u sf a e c a l i s ( e f a e c a l i s ) a n db a c i l l u ss u b t i l i s s u b t i l i s ) w e r ep e r f o r m e d i na d d i t i o n ，t h ee f f e c t o fe f a e c a l i s ，最s u b t i l i so nt h eg r o w t ho fe s c h e r i c h i ac o l i 0 5 4 ( e c o l i ) ，s a l m o n e l l a c h o l e r a e s u i sa 7 2 c h o l e r a e s u i s ) a n dn o r m a lb a c t e r i a ll a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s c i c c 6 0 7 5 以a c i d o p h i l u s ) w e r ea l s od e t e c t e d t h eg e n e r a t i o nt i m eo fe f a e c a l i sa n db s u b t i l i sw e r e2 3 9a n d2 9 4 m i n su n d e rt h e c o n d i t i o no f37 c ，u s e dl bm e d i u m 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e yg r o w e dr a p i d l y m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o nf o rl i n c o m y c i n ( l c m ) ，e n r o f l o x a c i n ( e n r ) ， s u l f a d i a z i n e ( s d ) ，s t r e p t o m y c i ns u l f a t e ( s m ) ，a m p i c i l l i ns o d i u ms a l t ( a m p ) ，t i a m u l i n f u m a r a t e ( t m l ) ，t y l o s i n ( t y l ) ，f l o r f e n i c o l ( f l o ) ，p o l y m y x i nbs u l f a t e ( p l m ) ，c e f - t i o f u rh y d r o c h l o r i d c ( c t x ) a n dd o x y c y c l i n e ( d c ) a g a i n s te f a e c a l i sa n db s u b t i l i s w e r ep e r f o r m e db yb r o t hm a c r o d i l u t i o n , t h ec l s ir e f e r e n c em e t h o d ，n l er e s u l t s s h o w e dt h a tt h em i c so ft h e s ed r u g sa g a i n s te f a e c a l i sw e r e6 4 ，0 5 ， 2 5 6 ，6 4 ，4 ，2 5 6 ， 4 ，4 ， 2 5 6 ，2 5 6 ， 2 5 6 ，8 ，1 6 ，2 5 6 ，2 ，2 ，2 5 6 ， 3 2 ，o 5 0 9 m l ，a c c o r d i n gt ot h ec o r r e s p o n d i n gs t a n d a r d s ，b s u b t i l i sw e r er e s i s t a n tt o s d 、t m l 、c 1 x 、l c m 、s m 、p l ma n ds e n s i t i v et oe n r 、t y l 、f l oa n dd c ， i n d i c a t i n g t h a ts d ，t m l ，c t x ，l c m ，s ma n dp l mh a dt h ec o m p a t i b l ea p p l i c a t i o n 、i m 丑s u b t i l i s ， b u tn o te n r 、t y l 、f l oa n dd c t h ee f f e c to fe f a e c a l i sa n db s u b t i l i so ng r o w t ho ft h ep a t h o g e n i ce c o & s 2 饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究 c h o l e r a e s u i sa n dn o r m a li n t e s t i n a lb a c t e r i a l 厶a c i d o p h i l u sw e r et e s t e db vm i x e d c u l t u r e 。n l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg r o w t ho f 晟c d ，fa n d c h o l e r a e s u i sc o u l db ew e l l i n h i b i t e db ye f a e c a l i sa n db s u b t i l i s e f a e c a l i sc o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho fl a c i d o p h i l u s h o w e v e r , l a c i d o p h i l u sc o u l db ei n h i b i t e db yr s u b t i l i si nt h ep r e - 3 5 ho f m i x e dc u l t u r e ，a n dt h e n ，t h e yc o u l db ep r o m o t e dg r o w t hw e l l k e y w o r d s ：e f a e c a l i s ，b s u b t i l i s ，m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，m i x e dc u l t u r e 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 缩略语表 4 饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究 l 前言 1 1 研究的背景和意义 自上世纪三四十年代英国科学家f l e m i n g 发现青霉素，w a k s m a n 发现链霉素 以来，人们不断从微生物次生代谢产物中找到众多有效的抗生素并由此开发出诸 多半合成类抗生素，对防治细菌性疾病起到了重要作用。在畜牧业生产中，自1 9 4 6 年报道链霉素可促进动物的生长，1 9 5 0 年美国食品药品监督管理局正式批准抗生 素可以用作动物饲料添加剂以来，其应用很快拓展到畜牧业生产领域，抗生素、 喹乙醇、喹诺酮等药物饲料添加剂先后在世界各个国家和地区得到了广泛大量的 应用。饲料药物添加剂在预防动物疾病、促进动物生长、提高畜禽生产性能等方 面作用十分明显，对保障现代养殖业的健康快速发展和促进人民生活水平的提高 作用起到了巨大的推动作用。抗菌药物作为抗菌促生长剂添加到饲料中迄今已有 半个多世纪的历史了。但对饲料中添加抗菌药物的合理性的争论亦已持续了5 0 多年，争论的焦点是其对人体健康的危害和对环境的破坏( m o n r o ese ta 1 ， 2 0 0 0 ；v a n d e rwde ta 1 ，2 0 0 0 ；，d o n o g b u edje ta 1 ，2 0 0 3 ) 。随着对细菌耐药性 认识的深入和近年来抗生素在治疗人类疾病过程中所面临的诸多困难，人类开始 反思在畜牧业生产中长期大量应用抗菌药物所造成的严重后果，如耐药性病原菌 的比例逐年攀升、药物对畜禽残留毒性、“三致”( 致畸、致癌、致突变) 作用，及 对环境的破坏等，特别是近一二十年来，抗菌药物在饲料中长期大量添加甚至滥 用，给人类健康带来了越来越严重的威胁( 余伯良等，2 0 0 3 ) ，曾经有效的抗菌 药物不能对致病性细菌起到抑制或杀灭的作用，对高度耐药性细菌导致的疾病显 得无能为力，一些曾经是很普通的疾病现在却变为无可救药的“绝症”，人们在使 用抗菌药物残留的畜产品时，体内的耐药菌株会随之增加( 徐成刚等，2 0 0 2 ) ， 2 0 0 4 年中国细菌耐药监测显示耐药性细菌引起的医院内感染患者人数约占医院 感染总人数的3 0 左右( 汪复，2 0 0 6 ) 近年来欧盟、日本和美国等发达国家反 对在动物饲料中添加抗菌药物的呼声越来越高，限用或禁用抗生素是畜牧业发展 的必然趋势。欧洲联盟食品监管委员会决定，1 刍2 0 0 6 年1 月起严禁在所有食品动 物养殖过程中添加抗生素，此决定不仅对欧盟内部国家适用，而且所有出口饲料、 饲料添加剂和动物性食品到欧盟国家的欧盟外企业都必须遵守此禁令。欧美及日 本等国家以畜产品中药物残留超标为由拒绝进口中国畜产品的事件几乎每年都 会发生，给国家出口创汇造成巨大损失( 侯军岐，2 0 0 2 ) 。我国畜牧业生产中从 上世纪7 0 年代开始将抗菌药物作为饲料添加剂使用( 吴聪明，2 0 0 3 ) 。随着国民 健康意识的逐步提高，对食品质量安全的要求也越来越高，对无抗菌药物残留食 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 品的需求亦十分旺盛。因此未来饲料添加剂的发展趋势应该是开发生产无污染、 无残留、不产生抗药性、不污染环境的绿色饲料添加剂。 益生菌制剂正是在这种大背景下应运而生的，益生菌制剂又名促生素，利生 素，活菌制剂，益生素，益生素由美国学者p a r k e r 于1 9 7 4 首次提出，是与抗生素 a n t i b i o t i c s 相对应的新概念，用来表示给动物饲用的微生态制剂，它可以直接饲 喂动物并通过调节动物肠道微生态平衡达到预防和治疗疾病，促进动物生长以及 提高饲料报酬的活性微生物或其代谢培养物，以达到调整体内微生态平衡之目的 ( 杨承剑等，2 0 0 6 ；孙建义，1 9 9 5 ) ，有的益生菌制剂还含益生菌在生长过程中 产生的代谢产物( 周德庆等，1 9 9 9 ) 。我国学者在1 9 9 1 年提出了一个较通俗的概 念“饲用微生物添加剂”。用在动物生产方面的可称之为动物微生态制剂，它从上 世纪七八十年代起获得了较快的发展。微生态平衡理论、微生态失衡理论、微生 态营养理论及微生态防治理论是益生菌制剂的主要理论基础( 许振英等，1 9 9 4 ； f u l l e rr ，1 9 8 9 ) ，益生菌制剂主要作用于消化道，促进其内部的微生态平衡，提高 动物的生长速度或提高饲料利用率。通过增强非特异免疫或增强动物对场内有害 微生物的拮抗作用来防治疾病( s a l m i n e nse ta 1 ，1 9 9 8 ) 。人们已经逐渐认识到益 生菌制剂无毒副作用、无药物残留、无耐药性、成本低、效果显著、不污染环境 等优点。益生菌制剂不仅可以提高饲料转化率和畜禽的生产性能、防治疾病，并 且对改善动物健康状况，降低畜禽产品中胆固醇的含量有着很好的作用。此外， 微生态制剂可显著减少畜牧生产过程中对环境造成的污染，比如减少排泄物中的 氨气、硫化氢、有机磷等有害物质。由此可见，益生菌制剂不仅显著提高了经济 效益，还保护了人类赖以生存的环境。 1 2 益生菌制剂的概念 益生菌制剂的主要功能成分为益生菌( p r o b i o t i e s ) ，p r o b i o t i e s 在国内通常 被译成益生菌，益生剂，生菌素，生菌剂，益菌剂等，它起源于古希腊文，是“共 生”的意思。上世纪五十年代著名学者v e r g i o 的大型专著：抗生素与益生菌一 书中首次使用p r o b i o t i e s 这一名词，而上世纪s t i l l w e l l 和l i l l y t j 造该词时意指由一 种细菌分泌刺激另一种细菌生长的物质，细菌不必是胃肠道正常菌，但其必须对 人和畜禽的健康又促进作用( p h i l i p p em ，2 0 0 3 ) 。之后的二三十年，随着细菌研 究工具和手段的不断深入，益生菌的定义也经过屡次的变更，1 9 7 4 年p a r k e r 将其 定义为可促进胃肠消化道平衡的有机生命体或其代谢物质，1 9 8 9 年f u l l e r 又将益 生菌定义为“添加到食品或饲料中通过改善人或动物消化道微生态平衡并可对其 发挥有利影响的活的微生物”，此概念后来被广为接受，其第一次强调了益生菌 必须是具有活性的细胞( f u l l e rr ，1 9 8 9 ) ，1 9 9 4 年，在德国召开的益生菌国际 6 饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究 学术研讨会上，各国学者一致将益生菌统称为“益生菌是含活菌和( 或) 死菌微 生物，供口服或者经由其它途径摄入，能够改善粘膜表面细菌和酶的平衡，有刺 激特异性和非特异性免疫的功能”。近年来t a n n o c k 和g u a m e r 又提出一个新的定 义“当摄入一定量时可对宿主健康起到促进作用的活体微生物”。此定义精辟地概 括了益生菌的益生作用，一般认为活菌的某些代谢产物可能也具一定的活性功 能，但它们主要由活体细菌产生，因此多数学者仍将该定义的重点放在了活菌上， 认为将“p r o b i o t i c s ”译作“益生菌”更为恰当。并第一强调了益生菌发挥其益生作用 的前提是必须要达到一定数量( g u a m e rfe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。2 0 0 2 年欧洲食品和饲料 菌种组织概括了益生菌的最新定义：益生菌是活性微生物，当摄入充足的数量时， 对宿主起到一种或多种特殊且经过论证的功能性保健作用。目前中国一些学者也 从多个角度对益生菌的定义作了修订( 陈廷祚，1 9 9 7 ；章剑，2 0 0 0 ；王士长 等，1 9 9 9 ) ，鉴于其由胃肠道正常微生物所制成的添加剂，因此又被称做活菌制剂 或生理菌苗( 何明清，2 0 0 1 ) 。 1 3 益生菌制剂的发展历史和应用概况叠 大约三千多年前，在古印度、古埃及及古巴比伦地区的人们就有饮用酸奶的 记载，此外在齐民要术、圣经仓u 世纪及佛教教典中均有制作酸奶的 详细记载，这应该算是微生态制剂的发源阶段。 诺贝尔奖获得者，俄国微生物学家e l i em e t c h n i k o f f , 早在二十世纪初就提 出了益生菌的概念假说，他认为保加利亚高加索地区的人们长寿是因为长期饮用 含大量乳酸杆菌的乳制品的结果，理由是发酵制品中的乳酸杆菌能改善肠道内的 微生态平衡，极大地降低产毒细菌的生物活性，由此引起了多国微生物学家广泛 的关注。上世纪9 0 年代，中国学者发现我国广西巴马地区百岁以上老人体内的乳 酸菌和双歧杆菌数量要比普通老人多得多。1 9 4 7 年，孟哈研究发现，在仔猪饲 料中添加乳酸杆菌活菌制剂能够有效增加仔猪的日增重( 李建雄等，2 0 0 4 ) 。 益生菌制剂真正被重视起来并大规模应用于畜牧养殖业是从上世纪六、七十 年代人们逐渐认识到抗生素的种种弊端之后才开始的。美国从上世纪7 0 年代开始 使用益生菌制剂，每年的市场需求达至u 8 0 0 0 t 以上，在欧洲仅法国1 9 9 1 年市场上 销售的益生菌制剂品种就超过5 0 个。日、德、英等国家己在l o 多年前相继开发研 制新型的抗生素替代产品并投入批量生产，它们主要用于人及动物的腹泻、消化 道疾病的预防和治疗。 我国益生菌制剂的研究及使用较欧盟和日本稍晚，开始于7 0 年代，但近年来 得以大规模应用于畜牧业，发展甚为迅速。1 9 9 2 年我国成立了中国微生态学会， 将饲用益生菌的基础研究及其应用研究纳入国家“八五”重点科技攻关项目，这极 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 大地促进了益生菌制剂在中国的发展进程。目前我国已经有一些生产厂家研制生 产出一批饲用益生菌产品。 益生菌制剂的利用途径主要包括两种方式：一是将活的益生菌菌体制成制剂 直接添加到食物或饲料中，另外一种是通过发酵的方式大量培养，然后提取其中 有益生功能物质加以利用。美国及欧盟一些国家相继颁布了一些禁用或限用饲用 抗生素的管理条例，这在一定程度上也推动了饲用益生菌的发展。丹麦、荷兰、 英国、美国、日本等国畜禽饲料中己广泛大量添加益生菌。从技术角度来看，国 外采用液体发酵技术，有效克服了产品质量参差不齐，活菌数不够，环境污染等 弊端。 1 4 益生茵制剂的理论依据 饲用益生菌的理论依据是微生态学( m i c r o e c o l o g y ) 。此理论于1 9 7 7 年由 v o l k e r r u s h 首先提出，它在人类及动物的保健和疾病防治方面都具有重要的意 义，其在研究生物的生存、繁殖及各种微生物在长期进化过程中与宿主在不同生 长阶段内形成的一种平衡状态发面具有指导性的意义。周德庆将其概括为微观形 态领域探索微观层次的生态学科，用来阐明正常菌群的本质及其与宿主健康动物 体内的正常细菌菌群是宿主重要的组成部分，在细菌数量、构成和比例上保持着 相对的动态平衡( 杨景云，1 9 9 1 ) 。按照微生态学的理论，消化道内正常微生物 群落、营养及免疫等几个因素相互影响、相互作用并都受相应宿主的特定制约( 康 白等，2 0 0 1 ；鲍行豪等，1 9 9 5 ) 。 动物消化道存在极大数量( 约1 0 1 4 个微生物) 的组成相对稳定的微生物菌群， 这些微生物之间及微生物与畜禽之间组成一个相互影响、相互依存的不可分割的 统一体。微生态平衡理论是指肠道正常微生物菌群与宿主在不同的生理阶段的动 态性平衡，这种动态性平衡是动物在漫长的进化过程中逐渐形成的相互依存、相 互影响的生态统一体。畜禽在出生以前，在母体内处于无任何细菌的环境。出生 以后主要从周围环境和母体获得相应的肠道细菌。出生后不久，胃肠道上皮粘膜 即被外源性微生物完全定植( 康白，1 9 9 8 ) ，最终能稳定生存下来的细菌约1 0 1 4 个， 种类约5 0 0 余种( 尹军霞等，2 0 0 4 ；孙志洪等，2 0 0 7 ) 。宿主、肠道寄生菌和周围环 境可以形成一个相互依存、相互作用的平衡系统，稳定微生物群落的形成有助于 动物提高抵抗力，研究发现无菌动物比具有正常消化道细菌的动物更容易受疾病 的感染( f u l l e rr 1 9 8 9 ；c o n w a ypl 1 9 9 7 ) 。可根据其与宿主的关系将消化道正 常细菌群落分为三大类：共生性细菌：是消化道内的主要菌群，特别是在小肠 和大肠内数量较多，主要包括兼性厌氧菌或厌氧菌如乳酸杆菌及双歧杆菌等，这 类细菌数量及其庞大，在人和动物消化道内长期稳定存在，对维持宿主的健康及 8 饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究 消化道微生态平衡有着较为重要的意义，此外，还可以提供某些种类的维生素及 消化酶、刺激免疫系统的发育和清除消化道有害物质等作用。共生性细菌与消化 道上皮密切接触，其生理和代谢活动与宿主的健康状况密切相关，这类细菌在自 营的同时又对宿主的健康起到积极作用，它们将复杂的不易消化的纤维素或非淀 粉多糖发酵，产生大量的酸性物质或挥发性脂肪酸( 如乙酸、丙酸、丁酸等) ，这 些物质在肠道内可酸化肠内容物，形成酸性环境，对某些致病菌可产生一定的抑 制作用，此外酸性物质在肠道堆积过多还可刺激肠道蠕动，有利于肠道有害物质 的排空。机会性细菌：在消化道数量较少，主要有非致病性的大肠杆菌、肠球 菌及链球菌等。这些细菌在肠道驻留数量及时间会随着肠道内环境的改变而改 变。致病性细菌：在消化道内数量极少，但危害较大，一般会引起胃肠道的感 染，主要有致病性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、梭茵、伪单胞菌、以及部分 真菌等。这些细菌不仅具有较强的致病性，同时它们还会消耗宿主的能量，而其 代谢产物或发酵产物( 如氨气、硫化氢等) 也对宿主的健康产生一定的有害，还可 能导致宿主体内腐败物、毒素及致癌物的增加。 微生态失衡理论指的是正常的宿主与细菌之间的平衡性一旦被外界的物理 因素、化学因素、生物因素和环境因素所破坏，就会造成肠道内细菌的种类、数 量和比例发生变化，导致宿主和肠道微生物之间的动态平衡被打破了，这种失衡 会对宿主的健康产生负面的影响，可导致某些条件致病菌及有害菌在消化道的数 量及驻留时间发生变化，由受抑制状态转为优势菌，共生菌则不占优势，此时疾 病较易爆发( f o o k slje ta 1 ，1 9 9 9 ) 。消化道细菌群落的失衡可以通过摄入双歧杆菌 或乳酸杆菌的制剂来进行调节，很多种类的乳酸杆菌可以耐受上消化道的强酸性 环境，并产生一些促进宿主健康和调节消化道菌群平衡的效应分子( b e n e tm fe t a 1 ，1 9 9 4 ；b l o m b e r gle ta 1 ，1 9 9 3 ；h a b e r e rwhe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 5 益生菌制剂的作用机理 国内外对益生菌制剂作用机理的研究目前还处于探索阶段，大多数研究仅 限于使用的效果水平上。综合国内外目前的研究现状，其作用机理主要有以下几 种学说。 1 5 1 优势菌群作用 在健康动物的消化道内，正常微生物、宿主和环境三者之间共同组成一个相 对稳定的微生态动态平衡系统，其中的优势微生物群落对维护整个消化道菌群平 衡起着举足轻重的作用，一旦优势微生物群落的数量、组成和比例受外界影响而 发生改变，则极易导致肠道微生态失衡，原有优势微生物群落发生更替。在健康 动物消化道内，优势种群厌氧菌或兼性厌氧菌的数量高达9 9 以上，而需氧菌只 占l 。益生菌可以粘附定植于消化道粘膜上皮细胞表面，形成一层“生物膜”， 抑制致病菌的定植，从而发挥生物屏障效应( g o t t e l a n dm e ta 1 ，2 0 0 1 ；j o h a n s s o nm le ta 1 ，1 9 9 3 ；s h o m i k o v aave ta 1 ，1 9 9 7 ) 。当畜禽消化道发生微生态失衡的时 候，使用益生菌制剂，可以较好的促进厌氧菌的生长，抑制致病性需氧菌的繁殖， 恢复消化道正常菌的优势地位。 1 5 2 生物夺氧作用 在健康的状况下，宿主消化道内的优势菌为厌氧菌，随着游离氧的含量上升， 可导致致病性需氧菌或兼性厌氧菌的数量大增，原有的微生态动态平衡被打破。 大量研究表明：当动物摄入需氧型益生菌制剂如芽孢杆菌时可以迅速消耗消化道 内的游离氧，导致消化道菌群处于一个相对的厌氧环境，有利于消化道优势厌氧 细菌的生长，从而使被打破的微生态平衡恢复到健康时的状态，达到保持动物健 康之目的。 1 5 3 生物拮抗作用 动物益生菌制剂中的益生菌在动物消化道内对致病性细菌的生长有抑制作 用，主要表现在在畜禽肠道中致病性的微生物竞争营养以及肠系膜上的粘附( 粘 附是指细菌与消化道上皮细胞通过一定的生物化学作用而发生的特异性的粘连) 位点，这是考察益生菌益生效果的重要指标之一( 蒙样晨等，2 0 0 2 ；王丽纹，2 0 0 2 ) 也是益生菌制剂起到益生作用的最重要机制和主要原理之一。致病性细菌粘附于 消化道粘膜上皮细胞是其发挥致病作用的关键( b e a c h e yeh ，1 9 8 1 ：f i n l a y b b e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，其主要的特征就是入侵宿主，并在宿主消化道内找到适合自身生 1 0 饲用粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的体外评价研究 长繁殖的空间，益生菌具有抑制外来细菌粘附的能力，即益生菌通过其分泌的粘 附因子与消化道上皮细胞受体粘附，占据消化道上的粘附位点，形成一道保护性 的生理屏障，在空间上形成定植阻力，抑制致病性细菌与消化道上皮细胞的受体 产生粘附( 肖涛等，1 9 9 8 ) 形成抵御致病菌的一道重要防线，从而不利于致病性 细菌在消化道长时间的生长繁殖( 陈朝东等，2 0 0 0 ，z i e m e rcje ta 1 ，1 9 9 8 ) ， s a l m i n e n 等认为益生菌作用的主要机制在于稳定肠道菌群，阻止病原菌定植 ( s a l m i n e nse ta 1 ，19 9 8 ) ，f e d o r a k 等( f e d o r a krne ta 1 ，2 0 0 4 ) 研究发现益生 菌占据消化道上皮细胞的粘附位点以后，可分泌过氧化氢，有机酸等抑菌杀菌物 质，或刺激宿主自身产生抑菌杀菌性物质如防御素等使得致病性微生物在定植到 粘膜上皮之前即被杀灭。益生菌还可以修复受损的粘膜上皮组织，恢复其正常的 生理功能( k a m a d ane ta 1 ，2 0 0 5 ) ，b l u ms 等( b l u mse ta 1 ，1 9 9 9 ) 通过试验 发现，用经过灭活的嗜酸乳酸杆菌l b 菌株对出血性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌 及c a c o 2 细胞的粘附和侵袭均具有较好的拮抗作用，k e m e i ss 研究发现嗜酸乳酸 杆菌l a l 可以较好地抑制病原性大肠杆菌以及小肠的结肠炎耶尔森氏菌( k e m e i s se ta 1 ，1 9 9 1 ) 。j i n 等( j i l ll ze ta 1 ，1 9 9 6 ) 研究发现，从动物体内得到的1 2 株乳酸 菌对五株沙门氏菌及三个血清型的大肠杆菌具有显著的拮抗能力。 1 5 4 增强机体的免疫功能 益生菌制剂可以增强动物的免疫力，刺激特异性免疫应答，促进非特异性免 疫应答以及t ，b 淋巴细胞的增殖和成熟，提高细胞免疫的水平。p e r d i g o n 等1 9 9 5 年研究证实多种乳酸杆菌均能促进i e a 分泌细胞的增值。他们在另外一项研究中 证实干酪乳酸杆菌能显著提升抑制鼠伤寒沙门氏菌的s l g a 数量，s l g a 水平的提升 可以抑制消化道感染( p e r d i g o age ta 1 ，1 9 9 5 ) 。v i n d e r o l ag 等报道消化道上皮细胞 可以凭借t o l l 样受体( t l r ) 与益生菌的相互作用，引起炎症细胞因子的下降和抗 炎因子的升高( v i n d e r o l ag e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。益生菌可以诱导机体产生干扰素，提高吞 噬细胞活力和免疫球蛋白的水平，增强动物体液免疫和细胞免疫的能力，预防疾 病的爆发( i s o l a u r ie e ta 1 ，1 9 9 3 ；m o s s m a ntre ta 1 1 9 8 6 ；h a r tale ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 e d e n s fw 等( e d e n sfwe ta 1 ，1 9 9 7 ) 研究发现罗伊氏乳酸杆菌可以显著改善鸡回 肠绒毛的长度及隐窝的深度，可以使因使用庆大霉素引起的回肠绒毛变短恢复到 正常的水平。 1 5 5 产生有益代谢产物及抗菌物质 益生菌如乳酸杆菌进入消化道以后产生大量的乳酸，芽孢杆菌进入消化道后 可以利用碳水化合物代谢生成大量乙酸、丙酸及丁酸等挥发性脂肪酸