（有机化学专业论文）细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探.pdf

熏季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 摘要 细菌纤维素( b a c t e r i a lc e l l u l o s e ，简称b c ) 又称为微生物纤维素 ( m i c r o b i a lc e l l u l o s e ) ，它是一种由细菌产生的生物高聚物。从纤维 素的分子组成看，b c 和植物纤维一样都是由p d 葡萄糖通过1 3 1 ，4 一糖 苷键结合成的直链，又称为p 1 ，4 葡聚糖。但从物理、化学、机械性 能来看，它具有自己独特的性质，例如高的结晶度、高的持水性、超 细纳米纤维网络、高抗张强度和弹性模量等，是一种新型纳米生物材 料，已应用于食品、造纸、医学材料、声音振动膜等各个领域，现已 成为国际的研究热点。 细菌纤维素是一种次生代谢产物，所以营养成分对b c 的形成有很 大影响。本课题首先以木醋杆菌为生产菌，分别研究了在静态、动态 培养条件下，不同碳源、初始p h 值、乙醇及有机酸、金属离子、糖浓 度对细菌产纤维素的影响，通过检测发酵过程中p h 值的变化、残糖的 变化以及纤维素产量的变化等因素来研究纤维素代谢过程，为大规模 工业化生产细菌纤维素提供实验数据。 静态培养条件下，不同碳源对细菌纤维素的合成有很大影响，在 甘露醇、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖四种碳源中，以甘露醇为碳源时b c 产量最高。研究发现，以甘露醇为碳源，细菌在p h 值4 6 的范围内生 长较好，而以p h 值为4 5 时纤维素的产量最高；添加乙醇、醋酸和乳 酸对提高纤维素的产量没有作用，反而有不同程度的抑制作用；在添 力1 f e 2 + 、m g “、c a 2 + 三种金属离子中，浓度不同对纤维素产量的影响 t 碧季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 也不同，其中，o 1m m o l l o l lf e “、7m m o l l o l lm 9 2 + 、5m m o l lc e + 对纤维素产量影响最大，产量分别提高了3 4 6 、3 2 2 并1 11 0 6 。 动态培养条件下，在甘露醇、蔗糖、葡萄糖三种碳源中，以甘露 醇的产量最高。研究发现，以蔗糖为碳源时，细菌在p h 值4 - 7 的范围 内生长较好，而以p h 值为5 。o 时纤维素的产量最高；添加f e 2 + 、m 9 2 + 、 c a 2 + 三种金属离子中，对动态发酵纤维素都有很大程度的影响。其中 3m m o l lf e 2 + 、5m m o l lm 9 2 + 、5m m o l lc a 2 + 对纤维素产量影响最大， 产量分别提高7 8 2 、1 3 2 1 和1 6 9 8 ；添加乳酸、乙醇、醋酸、草 酸和柠檬酸对提高纤维素的产量有很大的促进作用，当乳酸为1 0 0 m m o l l ，乙醇5 0 0m m o l l ，醋酸2 0 0m m o l l ，草酸1m m o l l ，柠檬酸 3 0m m o l l 时，产量分别被提高4 2 7 8 、3 5 7 7 、2 3 4 7 、6 3 2 、 1 7 7 ；蔗糖浓度也是影响纤维素产量的一个重要因素，在浓度为4 0 g l 时细菌纤维素的产量最高。 通过动态发酵的单因素分析，设计正交实验。从正交实验分析来 看，最佳组合为蔗糖浓度2 5g l ，初始p h 值4 5 ，乙醇添加量为4 0 0 m m o l l o l l ，在此条件下，纤维素产量为1 3 4 2g l ，为最初产量的1 6 4 倍。 课题对纤维素的物理化学性质( 细菌纤维素宏观状态、纤维网络 结构、直径分布范围、红外光谱特征、热重分析、含水率和吸水率以 及溶解性能) 做了初步研究，为细菌纤维素在生物医学材料上的应用 积累了重要的实验数据。 关键词：细菌纤维素，醋酸杆菌，静态发酵，动态发酵，物理化学特 性 i i 雾季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 p r o d u c t i o no fb a c t e r i a lc e l l u l os ea n d c h a r a c t e r i z a t i o no ft h ec e l l u l o s e s p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e t i e s a bs t r a c t b a c t e r i a lc e l l u l o s e ( b c ) i sa l s ob yt h en a m eo fm i c r o b i a lc e l l u l o s e t h a ti san a t u r a lp o l y m e rs y n t h e s i z e db yb a c t e r i a f r o mt h ec e l l u l o s e c o m p o s i t i o n ，b c i sal i n e a rc o n d e n s a t i o np o l y m e rc o n s i s t i n go f d a n h y d r o g l u c o p y r a n o s eu n i t s ( g l u c o s eu n i t f o rc o n v e n i e n c e ) jo i n e d t o g e t h e rb yb 一1 ，4 一g l y c o s i d i cb o n d s ( t h u sa1 , 4 1 3 - dg l u c a n ) l i k ep l a n t c e l l u l o s e w h i l et op h y s i c a l ，吐曼燃a n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，i t - _ 。_ _ _ _ e ；- j ，一 d i s p l a y su n i q u ep r o p e r t i e si n c l u d i n gh i g hc r y s t a l l i n i t y , h i g hw a t e rh o l d i n g c a p a c i t y , n a n o f i b r e - n e t w o r ks t r u c t u r e ，h i g ht e n s i l es t r e n g t h a n de l a s t i c m o d u l u s d u et oi t su n u s u a lm a t e r i a lp r o p e r t i e s ，b ch a sr e c e n t l yb e c o m e ak i n do fa t t r a c t i v eb i o m e d i c a lm a t e r i a l i nt h ei n t e m a t i o n a lr e s e a r c ht h a t w a se x t e n s i v e l ya p p l i e dt of o o d ，p a p e r , b i o m e d i c a lm a t e r i a l s ，a c o u s t i c d i a p h r a g m sa n ds oo n i ti sq u i t ew e l lk n o w nt h a tb ci sas e c o n d a r ym e t a b o l i t es ot h a t s t u d yo nt h ei n f l u e n c eo fn u t r i e n tc o n t e n t o nc e l l u l o s ep r o d u c t i o ni sv e r y i m p o r t a n t t h i sp a p e rf i r s t l yi n v e s t i g a t e dt h ec h a n g e s o fr e s i d u a ls u g a r s ， p hv a l u e sa n do u t p u to fb a c t e r i a lc e l l u l o s e ( b c ) i n a c e t o b a c t e rx y l i n u m i i i 荤季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 s t a t i ca n ds h a k i n gc u l t i v a t i o n sb yu s i n gv a r i o u sc a r b o ns o u r c e s ，i n i t i a lp h ， o r g a n i ca c i d s ，e t h a n o la n ds oo n i ns t a t i cc u l t i v a t i o n s ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta m o n gf o u rc a r b o n s o u r c e s ，t h eh i g h e s tb cy i e l dw a so b t a i n e du s i n gm a n n i t 0 1 t h eo p t i m a l i n i t i a lp hf o rg e t t i n gt h eh i g h e s ty i e l dw a s4 5 ，w h i l eb a c t e r i ag r e ww e l l a tp h4 - 6 t h ea d d i t i o no fe t h a n o lo ro r g a n i ca c i d sl i k ea c e t i ca c i da n d l a c t i ca c i dd i dn o ti n c r e a s eb u td e c r e a s e di ny i e l do fb ct od i f f e r e n t e x t e n t a n dt h ea d d i t i o no fm e t a li o n ss u c ha sf e 2 + ，m 9 2 + ，c a ：+ h a d d i f f e r e n ti n f l u e n c eo nc e l l u l o s eo u t p u ti nv a r i o u sc o n c e n t r a t i o nr a n g e b y a d d i n go 1m m o l lf e 2 + ，7m m o l lm 9 2 + ，5m m o l lc a 2 + ，t h ep r o d u c t i o n o fb cw a si n c r e a s e db y3 4 6 ，3 2 2 a n d10 6 r e s p e c t i v e l y i ns h a k i n gc u l t i v a t i o n s ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta m o n gt h r e ec a r b o n s o u r c e s ，t h eh i g h e s tb cy i e l dw a sa l s oo b t a i n e du s i n gm a n n i t 0 1 t h e o p t i m a li n i t i a lp hf o rg e t t i n gt h eh i g h e s ty i e l dw a s5 0 ，w h i l eb a c t e r i a g r e ww e l la tp h4 7 b ya d d i n g3m m o l lf e 2 + ，5m m o l lm 9 2 + ，5 m m o l lc a 2 + ，t h ep r o d u c t i o no fb cw a si n c r e a s e db y7 8 2 ，13 2 1 a n d 16 9 8 r e s p e c t i v e l y a n dt h ea d d i t i o no f10 0m m o l ll a c t i ca c i d ，5 0 0 m m o l le t h a n o l ，2 0 0m m o l la c e t i ca c i d ，1m m o l lo x a l i ca c i da sw e l la s 3 0m m o l lc i t r i ca c i dh a do b v i o u se f f e c to ni n c r e a s i n gy i e l do fb c ，t h e o u t p u t w a si n c r e a s e db y4 2 7 8 ，3 5 7 7 ，2 3 4 7 ，6 3 2 ，1 7 7 r e s p e c t i v e l y t h ec o n c e n t r a t i o no ft h es u c r o s ei nt h em e d i u mh a sb e e n s h o w nt oh a v ea ni m p o r t a n te f f e c to nt h ec e l l u l o s ep r o d u c t i o n a n dt h e i v 碧季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 y i e l do fb cw a sh i g h e s ti nt h es u c r o s e c o n c e n t r a t i o no f4 0g l i n a d d i t i o n ，b yo r t h o g o n a ld e s i g no fe x p e r i m e n t ，t h ep r o d u c t i o no fb c i s 1 3 4 2g l ，i n c r e a s e db y16 3t i m e su s i n gt h eo p t i m i z e dm e d i u m ，w h i c h c o n s i s t e do fs u c r o s e2 5g l ，e t h a n o l4 0 0m m o l la n dp h4 5 t h ee x p e r i m e n t a l i n v e s t i g a t i o n so np h v s i c a l ，c h e m i s t r yp r o p e r t i e so f 一 一 _ ，_ _ - _ _ _ ，_ 一一 一 b cs u c ha ss h a p e ，f i b e rn e t w o r ks t r u c t u r e ，d i a m e t e rd i s t r i b u t i o n ，i n f r a r e d s p e c t r u md i a g n o s t i c s ，t h e r m o - g r a v i m e t r i ca n a l y s i s ( t g a ) ，t h ec o n t a i n i n g w a t e rr a t i oa n dw a t e ra b s o r p t i o nr a t i o ，s o l u b i l i t yo fb a c t e r i a lc e l l u l o s e w e r ec a r r i e do u tb yu s i n gt h e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) ， f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d ( f t i r ) a n a l y z e r , t h e r m o g r a v i m e t r i ca n a l y z e r a n ds oo n t h eo b t a i n e d i m p o r t a n t d a t ac o u l da p p l yt om e d i c a l a p p l i c a t i o n s k e yw o r d s b a c t e r i a l c e l l u l o s e ，a c e t o b a c t e rx y l i n u m ，s t a t i c f e r m e n t a t i o n ，s h a k i n gf e r m e n t a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n o f p h y s i c a l p r o p e r t i e s v 附件一 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：穗确等 日期： 加口舌年72 月2 7 日 附件二 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密口。 学位论文作者签名：弗秀玉角每 日期：沙6 年i2 月2 7 日 指导教师签名： 、谚地 i 、 日期：跏年p 月二易日 碧季戈学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 1 1 前言 第一章绪论 纤维素是地球上一种最丰富的自然资源，人类从几千年前就知道利用纤维素 满足自身衣食住行的需求。利用其结构，纤维素已被广泛应用于纺织品、食品、 造纸、包装和建筑材料。纤维素根据来源不同可分为：植物纤维素、动物纤维素 和细菌纤维素。目前，大部分工业用途的纤维素是从植物获得的，如：树木、竹、 稻麦秆、枞叶、棉花、亚麻、黄麻、苎麻和大麻等。动物纤维素又称甲壳素，是 一种多糖类生物高分子，在自然界中广泛存在于低等生物菌类、藻类，节支动 物、蟹、昆虫的外壳以及软体动物( 如鱿鱼、乌贼) 的内脏和软骨中。在医药、 食品、化妆品、农业、环保以及酶的固定化载体等方面具有广泛的用途。 细菌纤维素( b a c t e r i a lc e l l u l o s e ，简称b c ) 是一类由微生物产生的纯纤维 素。能够产生纤维素的细菌主要有a c e t o b a c t e r ，r h i z o b i u m ，a g r o b a c t e r i u m 和 s a r c i n a 等【lj 。研究最多、产量最高的细菌是a c e t o b a c t e r x y l i n u m ( 木醋杆菌) 。从 纤维素的分子组成看，b c 和植物纤维一样都是由p d 葡萄糖通过p 1 ，4 葡萄 糖苷键结合成的直链，直链间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构，又称为p 1 ，4 葡聚糖。但从物理、化学、机械性能来看，它具有自己独特的性质，是一种新型 纳米生物材料，已广泛应用于食品、造纸、医学材料、声音振动膜等各个领域， 成为国内国外研究的热点。 1 2 细菌纤维素国内外研究进展 1 2 1 细菌纤维素国外研究进展 有关b c 的研究最先由a d r i a nb r o w n 【2 】于18 8 6 年发现并报道。在醋酸发酵 过程中他观察到培养基表面形成一层凝胶状膜，经进一步分析确定这是由醋酸杆 菌发酵产生的一种纤维素物质，将其命名为纤维素薄膜。其后，很多课题组对 b c 的形成机制做了研究。h e s t r i n l 3 1 在1 9 4 7 年第一次详细阐明a x y l i n u m 合成纤 雾季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 维素的机制。1 9 世纪五十年代期间，相关学者发表了一系列有关b c 的研究论文。 s c h r a m m 4 1 等在1 9 5 4 年报道了纤维素形成过程中的影响因素，研究了培养基以 及相关抑制剂对其形成的影响；g r o m e t 等分别于1 9 5 7 年和1 9 6 2 年研究了合成 纤维素的酶系统和纤维素合成过程中的中间产物。同时，以色列和菲律宾的研究 人员也报道了用椰子汁和菠萝皮发酵生产“n a t a ”的方法。但是直到1 9 6 7 年， 才由l a p u z 等人【5 】证实“n a t a ”实际上是由a x y l i n u m 产生的纯纤维素。关于b c 的早期研究有很多是围绕n a t a 产品的最优发酵条件、分离提纯以及高产菌株的 筛选等展开的。接下来的十年，研究主要集中在a x y l i n u m 合成纤维素的生物模 型机制。1 9 7 7 年c o l v i n 等人【6 】曾尝试以一种单糖为原料利用纤维素合成酶全生 物合成纤维素产品。 直到十九世纪八十年代，人们才渐渐认识到b c 是一种具有潜在商业价值的 生物材料，因此对a x y l i n u m 的关注逐渐由过去在实验室中研究单纯的生物合成 纤维素模型飞跃到大规模工业化生产。在这个飞跃中有两个课题组的研究人员作 出了开拓性工作：由索尼公司、味之素公司和日本纺织研究所组成的科研人员致 力于利用b c 的特殊物理性能制造高强度材料【7 】；另一个是由w e y e r h a e u s e r 和 c e m sc o r p 组成的研究小组在深层搅动发酵罐中以a x y l i n u m 为菌株生产b c 引。 到八十年代末期，很多有关b c 的商业化应用都申请了专利。1 9 9 2 年，o k i y a m a 等人【9 ，1 0 1 报道了实验室大规模培养及通过改进发酵罐的设计生产b c 的文章。接 下来对b c 的研究越来越多，应用范围也更加广泛，相继有做为食品添加剂、纸 张粘合剂及滤膜等方面的研究被报道【l 。 目前的研究热点主要是将b c 应用于高附加值的产品，尤其是生物医用材料 上。1 9 9 0 年和1 9 9 1 年日本人y - 锄a 1 1 a l ( a 【1 2 ，1 3 1 首次以该纤维素制备人工血管获得 了成功。2 0 0 1 年和2 0 0 3 年k l e m m 等【1 4 1 5 】贝0 以此材料研制成功小直径( 1 3i i r a 内径) 人工血管。2 0 0 5 年，美国瑞典国际合作小组的s v e n s s o n 等人【1 6 】发现以b c 作为软骨组织工程支架效果良好。此外，该中空纤维管还可以作为覆盖神经纤维 的护套、气管、输尿管、软骨支架，以及某些中空气管的替代品等。 1 2 2 细菌纤维素国内研究进展 目前，国内对b c 的研究刚刚起步，仅仅停留在实验室水平，还没有产业化。 2 碧季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 可喜的是我国已开始加强这方面的研究工作。天津科技大学贾士儒等【1 7 】、山东 轻工业学院马霞等n 8 1 、江南大学余晓斌等、陕西科技大学齐香君等人【2 0 】均采 用了浅盘摇瓶静止培养方法；三峡大学邵伟等【2 l 】利用巴氏醋酸杆菌和甲醇在摇 瓶中振荡制备纤维素；广东轻工业职业技术学院邓毛程等【2 2 1 以蔗糖为原料利用 通气发酵和静止发酵相结合的二步发酵法明显提高产量；上海农科院马承铸等人 】从1 5 0 份自然材料中筛选得到了2 6 株菌种。然而研究的重点也只是在菌种的 筛选和发酵条件的优化，其应用主要局限在作为高纤维食品和提高纸的性能上。 哈尔滨工业大学薛璐等【2 4 】尝试了在食品冰淇淋中的应用；三峡大学邵伟等【2 1 ，2 5 】 用于发酵制备含b c 的绿茶饮料，以及用于含甲醇废水净化上；天津科技大学贾 士儒、马霞等【2 6 1 研究在造纸上的应用。但是国内迄今为止还没有一家企业有能 力正式从事b c 的生产，其相关的应用也受到限制，在生物医用材料上的开发应 用，目前相关的报道只有天津科技大学马霞【2 7 】利用纤维素膜对大鼠皮肤损伤和 治疗的研究。 1 3 细菌纤维素的结构和特性 1 3 1 细菌纤维素的结构【2 8 】 b c 是由微生物产生的一类纯纤维素，从纤维素的分子组成看，和植物纤维 一样都是由b d 葡萄糖通过b 1 ，4 葡萄糖苷键结合成的直链，链间彼此平行， 不呈螺旋构象，无分支结构，又称为p 1 ，4 葡聚糖，见图1 ( a ) 。但相邻的吡喃 葡萄糖的6 个碳原子并不在同一个平面上，而是呈稳定的椅状立体结构，见图l ( b ) 。数个邻近的d 1 ，4 葡聚糖链由分子链内与链间的氢键稳定结构而形成不溶 于水的聚合物，见图1 ( c ) 。 一般认为葡萄糖长链的聚合有两种类型：结晶结构和无定形结构。在纤维素 纤维中部，分子排列比较整齐、有规则，为有序结构，称为结晶区。在此微晶区 的外围长带区域，分子链排列不整齐、较松弛，但其取向大致与纤维主轴平行， 呈现无序结构，称为无定形区。从结晶区到无定形区是逐步过渡的，无明显界限。 一个纤维素分子可穿过几个结晶区和不定形区。结晶区的特点是纤维素分子链取 向良好，密度较大，分子间结合力最强，故结晶区对强度贡献大。天然纤维素可 荦季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 分为i 型和i i 型，由x 射线衍射分析醋酸菌所产生的纤维素属于i 型，细菌纤 维素结晶度高于植物纤维素，强度也大于植物纤维素。 t b ) p 自一 嗡。诌l u曦o 图卜1 纤维素的结构 ( a ) h o w o r t h 结构式( b ) 椅状结构式( c ) 纤维素间氢键的排列形式 和高等植物纤维相类似，描述细菌纤维素分子链聚集大小常使用的术语有： 原细纤维( 或基元原纤，e l e m e n t a r yf i b r i l ) 、微纤维( 或称微原纤，m i c r o f i b r i l ) 和细纤维( f i b r i lo 纤维素的构成单元一般可如下排列：纤维素分子链一原细纤 维一微纤维一细纤维。与其它聚合物相比，纤维素分子链的重复单元是简单均一， 分子表面较平整，使其易于纵向伸展，加上吡喃葡萄糖环上有反应性强的侧基， 十分有利于形成分子内和分子间氢键，使这种束状刚性的分子链易于聚集在一 起，成为结晶性的纤维结构。 1 3 2 细菌纤维素的特性 由a x y l i n u m 产生的b c 和植物或海藻产生的纤维素在化学性质上是相同 的，但b c 作为一种新型生物材料，有以下许多独特的性质：1 ) 纤维超细。微 纤维组成独特的束状纤维，其宽度大约为1 0 0n m 左右，厚度为3 8n l t i ，属纳 广 k 土妒米陋轩维，是目前最细的天然纤维，其大小仅为人工合成纤维的1 1 0 ；2 ) 细菌 合成纤维素的速度和产率要比植物高许多，每个木醋杆菌每小时至少可聚合 1 5 x 1 0 8 个葡萄糖分子，以平面静态浅盘培养，年产量在1 0t 6 6 6 7m 2 左右，是 一个季度同面积棉产量的1 0 0 倍；3 ) 高结晶度和高化学纯度。以1 0 0 纤维素的 形式存在，不含半纤维素、木质素和其它细胞壁成分，提纯过程简单；4 ) 高抗 张强度和弹性模量。b c 经洗涤、干燥后，杨氏模量可达1 0m p a ，经热压处理后， 杨氏模量可达3 0m p a ，比有机合成纤维的强度高4 倍；5 ) 高持水量( 或称高亲 4 碧季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 水性) 。其内部有很多孑l 道”，有良好的透气、透水性能，能吸收6 0 - - - 7 0 0 倍于 其干重的水份，即有非凡的持水性，并具有高湿强度；6 ) 极佳的形状维持能力 和抗撕力。b c 膜的抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5 倍；7 ) 较高的生物 适应性和良好的生物可降解性；8 ) 生物合成时性能和形状的的可调控性。通过 调节培养条件，可得到化学性质有差异的b c 。如木醋杆菌能利用葡萄糖与乙酰 葡萄胺合成n 乙酰氨基葡萄糖，并以4 的比例将n 乙酰氨基葡萄糖连接在b c 上口9 1 。此外，采取不同的培养方法，如静态培养和动态培养，也可以得到不同 高级结构的纤维素。w h i t e 等【3 0 】曾报道利用a c e t o b a c t e r 在培养过程中直接形成 一种无缝的、手套形状的纤维素产品，以用于治疗烧烫伤的手部皮肤。( 9 ) 可 利用广泛的原料进行生产。( 1 0 ) 提取过程简单。 1 4 细菌纤维素的生物合成及调控 1 4 1 细菌纤维素生物合成的生化途径【3 1 】 在木醋杆菌生物代谢过程中戊糖循环( h m p ) 和柠檬酸循环( t c a ) 两条 代谢途径参与了b c 的生物合成，见图1 2 。由于糖酵解( e m p ) 活力缺乏或 i 千臻鬈 图1 - 2 细菌纤维素生物合成途径 蒙季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 微弱，即缺乏磷酸果糖激酶或酶活力微弱，因此木醋杆菌不能在厌氧条件下代谢 葡萄糖。从草酰乙酸经丙酮酸盐，由于草酰乙酸脱羧酶和丙酮酸盐激酶的奇特调 节作用，木醋杆菌发生糖原异生作用。在这种条件下，一条代谢途径是由己糖磷 酸盐通过异构化和磷酸化，直接合成纤维素。另一种为非直接途径，即经过戊糖 循环和葡糖异生途径生成纤维素。其中由己糖磷酸盐直接转化成纤维素时，不需 要己糖碳骨架中碳链的改变。由己糖磷酸盐或通过五碳糖循环生成纤维素都需能 量代谢系统进行调节，其调节位点在对a t p 敏感、连接葡萄糖6 磷酸脱氢酶的 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d ) 上。在木醋杆菌中有两种不同的葡萄糖6 磷酸脱 氢酶，但只有一种葡萄糖6 磷酸脱氢酶被a t p 抑制。木醋杆菌生物合成纤维素 与氧化代谢过程同步进行，但与蛋白质合成体系无关。 b c 合成的前体物为尿苷二磷酸葡萄糖，由葡萄糖合成纤维素的4 个主要酶催 化反应步骤分别是：葡萄糖激酶的对葡萄糖的磷酸化作用；葡萄糖磷酸异构酶将 6 。磷酸葡萄糖通过异构作用转化成1 磷酸葡萄糖；焦磷酸化酶将1 磷酸葡萄糖转 化成尿苷二磷酸葡萄糖；以及纤维素合成酶的合成作用。纤维素合成酶催化合成 纤维素的最后一步为： u d p - g l c + ( 1 3 一l ，4 一g l u c o s e ) n pu d p + ( 1 3 - l ，4 - g l u c o s e ) n + l 1 4 2 细菌纤维素分泌、组装和结晶 葡萄糖的聚合过程是一个重要的步骤，但它仅仅是a x y l i n u m 合成纤维素的 第一步，和分泌、组装及结晶等过程是高度耦合的。a x y l i n u m 所产生的纤维素 并不是形成细胞壁的一部分，而是通过细胞膜微孔分泌到菌体外。细胞膜表面沿 细胞的长轴有规则地排列着约5 0 到8 0 个孔状位点，微孔间距约1 0a m i j 引。纤维 ，- 、 感素合成酶产生1 2 - 1 5 条纤维素分子链，组装成宽度为1 5n m 的原细纤域) ，再 通过细胞膜外层的微孔分泌到培养基中。这些精细纤维也称为“亚原细纤维”。 亚原细纤维聚合形成宽度3 - - 6n m 的微纤维，微纤维进而聚合成宽度约4 0 - - 6 0 r i m 的典型的“束状组装纤维”。一个醋酸杆菌可以在培养基中通过p 1 ，4 糖苷键 聚合2 0 0 0 0 个葡萄糖分子形成单一、扭曲、带状的微细纤维。带状的微细纤维 随着细胞的生长分裂却并不断裂。 天然纤维素可分为i 型和i i 型，由x 射线分析醋酸菌所产生的纤维素属于 6 雾季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 i 型。亚原细纤维太细小以致不能形成晶体，纤维素的结晶作用可能发生在亚原 纤维聚集成微纤维某一时期。当亚原细纤维通过氢键聚集成一条微纤维时，由于 亚原细纤维中分子链的平行取向，发生一定程度的局部分子链重排，产生晶体。 1 4 2 细菌纤维素合成酶系统【3 3 1 ( 1 ) 纤维素合成酶 纤维素合成过程中的关键酶，也是特征酶，因此了解该酶的结构和特性对深 入了解纤维素生物合成的机制是非常重要的。利用冰冻蚀刻技术证明了该酶为一 膜结合蛋白，可用毛地黄皂苷溶解，并且溶解状态的酶的催化调节活性与膜结合 状态的非常相似。酶的活性依赖镁离子的存在，最适作用温度为3 0 。c ，p h 在7 5 至8 5 之间。1 9 8 9 年l i n 等人眦x y l i n u m 中纯化了纤维素合成酶，从而加速了对其 结构的进一步研究。目前己利用特异标记技术证实了纤维素合成酶由三条多肽链 组成，分别为9 0 ，6 7 ，5 4 k d a ，应用直接的光亲和标记分析得到这三条多肽链与 酶的活性部位的不同关系，其中6 7k d a 和5 4k d a 两条多肽链与酶的专一性结合位 点以及催化位点有非常密切的关系，而9 0k d a 的肽链却不直接参与结合位点的形 成。尽管这三条多肽链的功能有所不同，但通过免疫学分析发现这三条多肽链在 结构上有紧密的联系，而且w e s t e r n 免疫杂交分析表明，这三条多肽链对特异性 的纤维素酶产生的抗体有相同的标记区，通过核酸序列分析发现，9 0k d a 和6 7 k d a 的肽链氨基端有明显的同源性，因此虽然这三条肽链的功能有所不同，但它 们都是由纤维素合成酶基因编码的结构相关蛋白。1 9 9 0 年s a x o n a 纯化了纤维素合 成酶并得到两个亚基，分别为9 3k d a 和8 3k d a ，而且利用a z i n o u d p g 亲和标记法 证明其含有u o p g 结合位点。 ( 2 ) u d p g 焦磷酸化酶 u d p g ( 二磷酸尿苷葡萄糖) 焦磷酸化酶是纤维素合成过程中的另一关键酶， 在分析了一组不产纤维素的菌株后发现此突变株是该酶的专一性缺失菌株。该酶 活力的测定可用1 一磷酸葡萄糖和u t p 作为底物进行，也可用u d p g 和p p i 为底物 测定。酶位于细胞质中，其酶活不受培养基中碳源的影响。该酶的结构基因已从 a x y l i n u m 文库中克隆到，并且在以半乳糖为唯一碳源的培养基上生长时，可与 e c o l i r 扣g a l 发生互补作用。 7 雾季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 ( 3 ) 磷酸葡萄糖异构酶 该酶的主要作用是促使细菌利用果糖，木醋杆菌利用果糖为唯一碳源时，此 酶的活力很高，但以葡萄糖为唯一碳源时则酶活很低，因此推测该酶在以果糖为 唯一碳源时为细菌纤维素合成所必需。 1 4 3 细菌纤维素合成的调控体系 细菌纤维素合成是一个复杂的生化过程，受到多水平因素的调节。r o s s 等人 在这方便做了大量工作，1 9 8 5 年他们发现枷x y l i n u m 中有一种鸟苷酰寡核苷酸 对纤维素合成酶有调节作用，1 9 8 7 年又证实了这种物质是环二鸟苷酸( c d i g m p ， 如图1 - - 3 ) ，1 9 9 0 年提出了纤维素合成的环二鸟苷酸系统。这些研究工作为进一 步了解纤维素合成的调节机制奠定了基础。纤维素合成调控机制的假设模型见图 1 - 4 。 图l - 3c - d i g m p 的结构 通过体外实验发现，当无环二鸟苷酸时纤维素合成酶处于失活状态或活力很 低，而当加入亚微摩尔级的环二鸟苷酸后活力可提高2 0 0 倍，接近完整细胞的 5 0 ，因此环二鸟苷酸是纤维素合成酶的变构激活剂，能以可逆方式与酶的调节 位点结合。 通过对木醋杆菌细菌纤维素生物合成的研究，发现细菌纤维素合成步骤的最 后一步是在细胞膜上进行的。c d i g m p 是细菌纤维素合成调节机制的关键因子， 并作为纤维素合成酶变构激活剂起作用。在纤维素生物合成中如果没有 c d i g m p ，纤维素合成酶将失活。c d i g m p 浓度的高低被认为是由与膜相连的 二鸟苷酸环化酶和二酯酶控制的【3 钔。 二鸟苷酸环化酶( d i g u a n y l a t ee y c l a s e ，d g c ) 催化c d i g m p 的合成。两个 g t p ( 鸟苷三磷酸) 分子在d g c 催化作用下，首先释放出一分子p p i 后转变为线 重季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 性二核苷酸三磷酸p p p o p g ，随后再释放出一分子p p i ，进而合成c d i g m p ，与此 同时，p p i 迅速分解生成p i 。m 9 2 + 对d g c 有激活作用。 磷酸二酯酶( p h o s p h o d i e s t e r a s e ，p d e ) 催化c d i g m p 的降解，有p d e a 和 p d e b 两种酶。纤维素的生物合成将由于p d e a 和p d e b 两种酶的作用而终止。 p d e a 从环状c d i g m p 上切下单个的磷酸二酯，将具有活性的c d i o m p 变为不具 活性的线性二聚物p g p g 。非活性的线性二聚物p g p g 在磷酸二酯酶b ( p d e - b ) 的催化作用下转变为2 个5 g m p 。其中p d e a 的作用是关键步骤。p d e a 和p d e b 的活性依赖于m 孑+ ，同时c a 2 + 高度选择性地抑铝i j p d e 的活性( 3 4 1 。 表达产生d g c 和p d e a 的相关基因位于三个有明显区别但又高度同源的操 纵子上，虽1 c d g l ，c d 9 2 和c d 9 3 。据分析，d g c 和p d e a 的c 末端有一个相同的氨 基酸序列结构。这个结构有两个长的结构域组成。这些结构域也出现在许多功能 未知的细菌蛋白质中。d g c 和p d e a 的n 末端包含对氧敏感的结构域 ( o x y g e n s e n s i n g d o m a i n ) 。在这些c d g 操纵子中，c d g l 对d g c 和p d e a 的活性有 8 0 的影响，而c d 薛和c d 9 3 仅分别士i 1 5 和5 。 i i t 声拟孤 l j 喇_ u 泸 图1 4 纤维素合成调控机制的假设模型 1 5 细菌纤维素在医学材料上的应用 细菌纤维素由于具有独特的生物亲和性、生物相容性、生物可降解性、生物 适应性和无过敏反应，以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的张 力和强度，尤其是良好的机械韧性，因此在组织工程支架、人工血管、人工皮肤 以及治疗皮肤损伤等方面具有广泛的用途，是国际生物医用材料研究的热点之 一o 9 雾季天学 细菌纤维素的发酵生产及其物理化学性质初探 1 5 1b c 在组织工程支架中的应用 生物相容性对于组织工程支架的构建是必不可少的。在研究组织工程b c 支 架构建中，体内生物相容性的评价非常重要。h e l e n i u s 等人p 5 j 系统地研究了b c 的体内生物相容性。实验中他们把b c 植入老鼠体内1 1 2 周，利用组织免疫化学 和电子显微镜技术，从慢性炎症反应、异物排斥反应以及细胞向内生长和血管生 成等方面的特征来评价植入物的体内相容性。结果发现植入物周围无肉眼和显微 镜可见的炎症反应，没有纤维化被膜和巨细胞生成。b c 被成纤维细胞侵入，与 宿主组织融为一体，未引起任何慢性炎症反应。因此可以断定b c 的生物相容性 非常好，在组织工程支架构建方面具有潜在价值。 s v e n s s o n 等人【1 6 】利用牛软骨细胞来评价天然和经化学修饰的b c 材料，结果 显示未修饰的b c 不仅提供了足够的机械性能，而且支持牛软骨细胞在5 0 胶原 蛋i 兰t i i 基质上生长和增殖。与通常组织培养用的塑料和海藻酸钙相比，未修饰b c 能更好地支持软骨细胞生长。而经硫酸化和磷酸化修饰后的天然软骨的模拟物一 一氨基聚糖b c ，不仅未促进软骨细胞的生长，反而由于材料孔径的变小影响了 软骨细胞生存能力。该研究在扫描体外巨噬细胞中发现b c 没有引起剧烈的炎症 反应。接下来，未修饰的b c 被进一步用于人软骨细胞研究，通过透射电镜( t e m ) 和人软骨细胞的胶原蛋白i i 的r n a 表达分析，发现未修饰的b c 支持人软骨的增 殖，同时t e m 也进一步证实软骨细胞向b c 支架内生长的事实，这些均证明细菌 纤维素在软骨组织工程中是一种非常有潜力的生物支架材料。 目前做为骨支架工程的材料有很多，比如：陶瓷、金属和高聚物可做为骨修 复和骨替代的材料。而纤维素是一种天然的具有吸引力的生物高聚物材料，它的 纤维结构和组成骨头的胶原纤维在形态学方面是一致的。a a s eb o d i n 等人【3 6 j 用臭 氧诱导a x y l i n u m 合成b c 时在其表面形成了聚丙烯酸，然后进一步形成c a 2 + 阳离 子交换材料，从而在模拟体液的环境下形成一个磷酸钙成核位点。这种微纤维表 面修饰能以类似于骨组织增长过程的方式诱导晶体形成。 w a l ly z 等人【3 7 1 曾对羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，简称h a p ) 和细菌纤维 素复合物进行研究，通过采用s e m ，e d s ，x r d 和f t i r 等技术测