（微生物学专业论文）副干酪乳杆菌产γ氨基丁酸的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 丫氨基丁酸( v - a m i n o b u t y r i ea c i d ，g a b a ) ，是一种天然存在的非蛋白质氨基 酸，由谷氨酸脱羧酶( g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ，g a d ) 代谢前体物质l 一谷氨酸或 其钠盐( l m s g ) 转化而来。研究发现，g a b a 是哺乳动物中枢神经系统中一种 重要的抑制性神经递质，具有降低血压，改善大脑机能、抗惊厥、预防和治疗癫 痫、活化肝肾等重要生理功能。g a b a 的生产和应用正成为医药、食品、农业等 领域一个热点研究的内容。 本文首先对副干酪乳杆菌h d l 7 发酵液中g a b a 进行了定性定量分析。氨基 酸自动分析仪结果显示：原始菌株发酵样品中g a b a 的含量为0 9 7 5g l 。后续试 验过程中，涉及g a b a 精确定性定量分析时，采用氨基酸自动分析仪法；而涉及 大量样品的定性定量分析时，采用改良纸层析法及比色法。 通过对g a b a 发酵培养基及发酵条件优化，确定最佳发酵培养基配方为 ( g l ) - 葡萄糖7 5 ，酵母粉1 2 5 ，蛋白胨1 0 0 ，无水乙酸钠2 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 ， m n s 0 4 4 h ：2 00 0 0 1 ，n a c l0 0 0 1 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 0 1 ，初始p h6 5 ；确定发酵条件 接种量：6 ，培养温度3 7 ，培养时间：7 2h 。前体物质l 一谷氨酸钠的添加量 为5 0g l 。 同时，对副干酪乳杆菌代谢l 谷氨酸钠合成g a b a 的关键酶的酶学性质进行 了初步研究，结果表明：该酶的最适p h ：5 o ；最适温度：4 5 ；米氏常数：k m = 0 3 8 6 4 m m o l l ，v m a x = 3 0 81 t m o l l ；影响酶活的化学物质适宜添加量：磷酸吡哆醛( p l p ) 添加量为5 0i _ t m o l l ；c a 2 + 浓度为1 0 0l u n o l l 。从有利于g a d 活性的角度进一步 确定发酵条件为，菌体生长温度3 7 ，对数生长后期将温度调至4 5 。最佳发 酵条件下，利用氨基酸自动分析仪检测g a b a 含量为1 0 5 3g l 。 在优化后发酵培养基及发酵条件下，原始菌株合成g a b a 的能力提高的幅度 不大，因而进一步利用u v 诱变、n t g 化学诱变及其二者的复合诱变对原始菌株 进行诱变选育，多次筛选后获得了遗传性状稳定的g a b a 高产菌株u n 一5 1 。诱变 黑龙江大学硕士学位论文 育种最佳条件：紫外照射时间2 5s ：n t g 终浓度为o 3m g m l ，诱变处理6 0m i n 。 利用氨基酸自动分析仪对诱变选育的高产菌株u n 5 1 进行g a b a 定性定量分析结 果：出峰时间为2 1 8 6m i n ，g a b a 的检出量为1 5 8 4g l ，较初始菌株提高了近 5 0 4 。 关键词：丫- 氨基丁酸；谷氨酸脱羧酶；诱变育种；检测方法 a b s t r a c t a b s t r a c t ta m i n o b u t y r i ea c i d ( g a b a ) ，w h i c hc a nb ep r o d u c e d 。f r o mt h em e t a b o l i s m p r e c u r o s o ro fg l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ( g a d ) ，l - g l u t a m a t eo rl m s g ；i sak i n do f n o n p r o t e i n ，n a t u r a le x i s ta m i n oa c i d s i th a sp r o v e dt h a tg a b a w a sav e r yi m p o r t a n t r e j e c t i o nc a p a b i l i t yn e u r o t r a n s m i t t e ri nt h ec e n t r a ln e r v es y s t e mo fm a m m a l i a n g a b a h a ss e v e r a lp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ss u c ha sh y p o t e n s i v ea c t i v i t y ，a n t i - h y p e r s p a s m i a , p r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fe p i l e p s ya n da c t i v a t i n gl i v e ra n dk i d n e yf u n c t i o n t h e p r o d u c t i o na n dt h ea p p l i c a t i o no fg a b ah a sb e e nb e c o m i n ga h o ts p o ti nt h ea r e a so f m e d i c i n e ，f o o da n da g r i c u l t u r e i nt h i s p a p e r , t h eg a b a ，w h i c hw a si nt h eh d 1 7l a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e i f e r m e n t a t i o n , w a sq u a l i t a t i v e q u a n t i t a t i v ea n a l y s e s ，f i r s t l y t h er e s u l t ，w h i c hw a s d e t e c t e db yt h ea u t o m a t i ca m i n oa c i da n a l y z e r , i n d i c a t e dt h a tt h eg a b aa m o u n to f d e t e c t i o nw a s0 9 7 5e li nt h ef e r m e n t a t i o ns a m p l eo ft h ei n i t i a ls t r a i n i nt h ec o n t i n u e d w o r k ，t h ea u t o m a t i ca m i n o a c i d a n a l y z e r w a su s e df o rt h e p r e c i s e q u a l i t a t i v e q u a n t i t a t i v ea n a l y s e so ft h es m a l lq u a n t i t yg a b a , a n dt h em e t h o d so fp a p e r c h r o m a t o g r a p h ya n dc h r o m a t o m e t r yw e r eu s e df o rt h eq u a l i t a t i v e q u a n t i t a t i v ea n a l y s e s o ft h em a s sq u a n t i t yg a b a p r e s c r i p t i o no ft h eo p t i m i z a t i o nf e r m e n t a t i o nm e d i u m ( g l ) ，w h i c hw a se n s u r e d t h r o u g ho p t i m i z i n gt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n di t sc o n d i t i o n ，w a sg l y c o s e7 5 ，y e a s tp o w d e r 1 2 5 ，p e p t o n e1 0 0 ，a n h y d r - s o d i u ma c e t a t e2 ，m g s 0 4 7 i - 1 2 0 0 0 2 ，m n s 0 4 4 h 2 0 0 0 0 1 ， n a c l0 0 01 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 01 ，i n i t i a lp hw a s6 5 a n dt h ei n o c u l u ma m o u n tw a s6 ， c u l t u r et e m p e r a t u r ew a s3 7 c ，c u l t u r et i m ew a s7 2h t h ea d d i t i o na m o u n to ft h e p r e c u r o s o r ，l m s g ，w a s5 0g l i nt h es a m et i m e ，t h ee n z y m o l o g yc h a r a c t e r mo ft h eg a d ，w h i c ht o o kp a r ti n l a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e im e t a b o l i s ml - g l u t a m a t et os y n t h e s i sg a b a ，w a ss t u d i e d i i i - 黑龙江大学硕士学位论文 i n i t i a l l y t h e t e s t p r o v e d ，t h eo p t i m i z a t i o np hf o rg a dw a s5 0 ，t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r ew a sa b o u t4 5 ，t h em i c h a e l i sc o n s t a n tw a sk m = 0 38 6 4m m o l f l , v m a x = 3 0 8g r n o l l t h ea d d i t i o na m o u n to fc h e m i c a lm a t e r i a l s ，w h i c hw a st oa f f e c to n e n z y m ea c t i v i t y ：p l pw a s5 0g m o l l ，c 矿c o n c e n t r a t i o nw a s10 0l m a o l l f r o mt h e a n g l eo ft h eg a da c t i v i t y , t h eo p t i m i z a t i o nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a se n s u r e di nt h e f u r t h e r ，t h eg r o w t ht e m p e r a t u r ew a s3 7 ，t h e nc h a n g e di tt o4 5 1 2a f t e rt h el a t e rp e r i o do ft h e l o g a r i t h m i cg r o w t h t h eg a b aw a s1 0 5 3g ld e t e c t e db yt h ea u t o m a t i ca m i n oa c i d a n a l y z e ri nt h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n i nt h ec o n d i t i o no ft h eo p t i m i z a t i o nf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n , t h eg a b as y n t h e s i sa b i l i t yo ft h ei n i t i a lw a sn o th a v i n gas i g n i f i c a n tr a i s e d , t h e nt h em u t a g e n e s i ss e l e c t i o nt h r o u g ht h eu v ，n t ga n du v - n t gc o m b i n a t i o n m u t a g e n e s i sw e r eu s e df o rt h ei n i t i a ls t r a i n t h e nag a b ah y p s i - p r o d u c e ds t r a i n , u n 一51 ，谢mt h es t a b l eg e n e t i cd e t e r m i n a n t , w a so b t a i n e db yt h em a n yt i m e ss e l e c t i o n t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fm u t a t i o nb r e e d i n g ：u ve x p o s u r et i m ew a s2 5s ，n t gf i n a l c o n c e n t r a t i o nw a s0 3m e g m la n dm u t a g e n i z e6 0 m i n t h er e s u l to ft h eq u a l i t a t i o n a n a l y s i sa n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sf o rt h eg a b a ，p r o d u c e db yt h eh y p s i - p r o d u c e ds t r a i n w h i c hw a sm u t a g e n e s i ss e l e c t e d ，w a sa n a l y s i sb yt h ea u t o a n a l y s e r i ti n d i c a t e dt h a tt h e a p p e a r a n c et i m ew a s2 1 8 6m i n ，a n dt h eg a b aa m o u n to fd e t e c t i o nw a s1 58 4g l w h i c hw a sa b o u t5 0p e r c e n th i g h e rc o m p a r e dt ot h ep r o d u c t i o no ft h ei n i t i a ls t r a i n k e yw o r d s ：1 , - a m i n o b u t y r i ca c i d ；g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ；m u t a t i o nb r e e d i n g ； d e t e c t i o nm e t h o d i v 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：獬 签字日期：。护年石月6 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉迢太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉江太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：霸乞拖 导师签名：奄表y 签字日期：o ，o 年6 月6 日签字日期：j d f 矿年6月f e t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 罩绪论 第1 章绪论 蛋白质是生命活动的物质基础，而氨基酸是蛋白质的基本组成单位。目前发 现的氨基酸种类已有7 0 0 余种1 1 1 ，其中包括蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸氨基 酸。非蛋白质氨基酸常以游离或小肽形式存在于生物体内，因其化学结构的特殊 性，常表现出特殊的生理功能。表1 1 列出了几种非蛋白质氨基酸的名称及功能。 表1 - 1 几种非蛋白质氨基酸的功能【2 t 3 l t a b l e1 - 1f u n c t i o no f s o m en o n p r o t e i na m i n oa c i d s 名称生理学功能 t 氨基丁酸 p 羧基一l - 谷氨酸 l 多巴 d 一环丝氨酸 d 色氨酸 牛磺酸 6 - 羟基赖氨酸 羟化脯氨酸 n 甲酰n 羟氨基乙酸 磷酸肌酸 瓜氨酸，鸟氨酸 抑制性神经递质 一些钙调蛋白的媒介 可治疗帕金森 用于拮抗药物 抗癌剂和免疫抑制剂的合成前体 加速婴儿组织代谢及器官生长发育 抗氧化性 可治疗坏血病 可抑制肿瘤生长 转移和储存高能磷酸键能 尿素循环的中间产物，可促进细胞增殖 丫一氨基丁酸( 丫a m i n ob u t y r i ca c i d ，简称g a b a ) 就是存在于哺乳动物脑和脊 髓中一种重要的非蛋白质氨基酸，对生命活动的调节起着不可替代的作用。 1 1 丫氨基丁酸的概述 1 1 1 丫氨基丁酸的结构与理化性质 r - 氨基丁酸( 丫- a m i n o b u t a n o i ca c i d ，简称g a b a ) 又称4 氨基丁酸 ( 4 一a m i n o b u t a n o i ca c i d ，4 - a b ) ，分子式c 4 h 9 n 0 2 ，相对分子量1 0 3 1 2 。结构式： 黑龙江大学硕士学位论文 h o y ，n i l 2 o g a b a 是一种白色结晶性粉末，极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、 乙醚苯、等有机溶剂，味微苦、微臭、且无旋光性圆。g a b a 在水溶液中以两性离 子形式存在，其解离常数为：p k c o o h = 4 0 3 ，p k n h 3 = 1 0 5 6 ：熔点( m p ) ：2 0 2 - 2 0 4 c ， 熔化可分解成2 吡咯烷酮。g a b a 具有氨基酸的特殊化学反应，如羟基化反应、 成酰氯反应等。也可与茚三酮发生显色反应，此反应常用于g a b a 的分析检测。 1 1 2 丫氨基丁酸的合成与分解代谢机制及其关键酶 g a b a 主要的合成途径是谷氨酸脱羧酶( e c4 1 1 1 5 ，g a d ) 催化l g l u 的 脱羧反应，也可由丁二氨和鸟氨酸转化而来，但这些物质都由g l u 转化而来，所 以说g l u 是g a b a 的唯一来源 4 1 。 在大多数细菌和哺乳动物大脑中，g a b a 可在g a b a 转氨酶( e c2 6 1 1 9 ， g a b a t ) 作用下与a 酮戊二酸发生转氨反应，形成琥珀酸半醛( s s a ) 和谷氨酸， 随后s s a 在琥珀酸半醛脱氢酶( e c1 2 1 1 6 ，s s a d h ) 的作用下形成琥珀酸( s a ) ， 进入三羧酸循环。这些反应与g a d 催化l g l u 脱羧反应一起构成了称为g a b a 支路【堋。其代谢途径【8 】如图1 1 。 ! 羧酸循i 磷：卷：! l 鼢骅雠蹦舻 i 幅湖 姒嗡 廿蠢卧 咎舞酸( c j l u ) 厂乙瓣赚 m 、馓逼稍黜 图1 - 1g a b a 支路及其代谢途径 f i g 1 1t h er e l a t i o no f b y p a s so f g a b aa n di t sb i o s y n t h e t i cp a t h w a y 谷氨酸脱羧酶是生物合成g a b a 的关键酶及限速酶1 8 1 。该酶催化反应的最适 p h 一般在4 0 6 0z i 间1 9 。g a d 是由辅基磷酸吡哆醛( p l p ) 与酶蛋白( a p o g a d ) 第1 章绪论 构成，g a d 通过p l p 与a p o g a d 的解离和聚合调节自身活性1 1 0 1 。 g a b a 转氨酶为p l p 依赖型，主要存在于胞浆中，其最适p h 为8 0 - - - 1 0 0 之 间。研究发现【1 1 1 3 1 ，不同来源的g a b a 转氨酶具有底物特异性和受体特异性，细 菌、酵母菌和高等植物的g a b a 转氨酶只能以g a b a 为底物，以q 酮戊二酸为受 体；而放线菌和哺乳动物的g a b a t 还可以p 一丙氨酸为底物，以p 丙酮酸为氨基 受体。 琥珀酸半醛脱氢酶存在于线粒体中，是g a b a 支路最后一步反应的酶，其催 化反应的最适p h 在9 啦9 5 之间u 3 1 。该酶以n a d + 为辅助因子，当n a d h n a d + = i 时，s s a d h 的活性下降了1 0 ，当n a d h n a 胸时，酶活性完全被抑制。琥珀 酸半醛脱氢酶也具有底物特异性，还可被重金属离子抑制。 1 2 丫氨基丁酸的生理机能 近些年，g a b a 作为一种新型的功能活性因子，备受人们的关注。研究表明， g a b a 是一种重要的抑制性神经递质，具有降血压，改善脑机能、抗惊厥、预防 和治疗癫痫、活化肝肾、调节激素分泌、促进精予受精等功能【1 4 1 。g a b a 的生产 和应用正成为食品、医药、农业等领域的一个热点研究内容。 1 2 1 调节血压 大量动物试验及临床医学表明【1 5 - 2 3 ，g a b a 作为中枢神经系统内重要神经递 质，具有突触后抑制作用，能有效促进血管扩张，降低血压等功效。2 0 0 2 年， h a y a k a w a 等人1 9 】利用富含g a b a 乳制品，喂食自发性高血压和正常小鼠，结果表 明，富含g a b a - 孚t , n 品能够显著降低血压，进一步研究发现该乳制品中无抗血压 肽存在，其降血压的因子是g a b a ；2 0 0 3 年，ki n o u e l 等【2 3 】给高血压患者进食含 g a b a 的发酵乳制品，患者心脏的收缩压和舒张压都得到有效改善，而对正常血 压的人没有任何影响。另有报道【2 4 1 ，黄芪等中草药的降血压成分也是g a b a 。 1 2 2 调节激素分泌 g a b a 通过影响垂体和性腺生理机能，参与激素分泌调节【2 5 1 。m u r a s h i m a 等【2 6 1 研究发现，大鼠体内输卵管粘膜g a b a 含量比大脑约高1 0 倍，其浓度从输卵管喇 黑龙江大学硕士学位论文 叭口至子宫输卵管连接处呈梯度下降趋势。g a b a 同样存在于男性性腺器官，与 精子运动和激素产生有密切关系。已有报道【2 他9 i g a b a 能够提高小鼠及人精子的 顶体反应。袁玉英等【3 试验结果表明：g a b a 可诱发人精子获能发生顶体反应。 g a b a 可明显提高精子的项体酶活性，为不育症的治疗提供有价值的资料3 1 3 4 】。 1 2 3 对大脑机能的改善 g a b a 在脑和脊髓中，能够降低神经元活性1 3 5 1 ，调节细胞代谢和0 2 消耗等机 制，从而使神经元突触后膜处于保护抑制状态。g a b a 缺乏是诱发多种神经系统 疾病的原因，如癫痫、失眠等。癫痫是大脑神经元异常放电所致，其发作与中枢 神经递质g a b a 的缺乏有一定相关性【3 6 1 。研究表明p t - 3 n ，癫痫患者脊髓中g a b a 明显低于正常人。2 0 0 3 年，彭海峰等f 4 0 】试验结果表明，在一定程度上，g a b a 含 量变化能反映癫痫患者的智能水平。o k r a 等【4 l 】采用口服富含g a b a 的米胚芽食 品，结果表明，该种食品具有镇静神经、促进睡眠、抗焦虑等功能。 1 2 4 对肝肾解毒功能的影响 临床医学认为【4 2 ，4 3 1 ，g a b a 可抑制谷氨酸的脱羧反应，促使谷氨酸与氨结合 生成尿素，有效降低血氨浓度解除氨毒，增进肝功能。研究发现，饲喂富含g a b a 米胚芽的大鼠，其碱性磷酸酶活性降低，肾脏细胞坏死减少。说明g a b a 具有活 化肾功能的作用。2 0 0 3 年，p a d 等1 4 5 】通过试验g a b a 对 4 c l 引起急性血淀粉 酶过多诱发痉挛鼠的作用进行了研究，结果发现，控制腹膜内g a b a ，可以降低 血液和脑中的叫。说明g a b a 具有解除氨毒的功能，可以抑制急性血淀粉酶过 多诱发的痉挛。 1 2 5 对呼吸系统疾病的影响 g a b a 在非神经组织中，能够发挥激素或营养因子的作用1 4 6 】。g a b a 受体主 要分为a 型和b 型两类。研究发现，g a b a 与a 型g a b a 受体结合可抑制哮喘、 支气管痉挛、微血管渗漏及粘膜腺体的高分泌等反应【4 7 ，4 8 1 。g a b a 与b 型g a b a 受体结合可抑制平滑肌收缩、微血管渗漏及过敏反应。这些反应常见于哮喘等呼 吸系统疾病中【3 4 1 。 第1 章绪论 1 2 6 其他功能 研究表明，g a b a 还有许多生理功能8 , 4 9 - 5 2 】如增强记忆力，改善脂代谢，防止 皮肤衰老，预防肥胖，减轻慢性疾病如关节炎疼痛等；2 0 0 3 年，我国学者周逸峰 发表在( ( s c i e n c e ) ) 上的研究结果表明，g a b a 还可能与人的大脑衰老有关5 3 1 。此 外g a b a 还具有甜味剂的功效，能增强食品风味等。 鉴于g a b a 具有多种生理活性和功能，近年来g a b a 正被应用于药品、保健 品、功能食品等领域5 4 。5 9 1 ，具有广阔的市场前景。目前，成功开发的富含g a b a 健康食品有茶叶、米胚芽、糙米、豆制品等植物性食品，但植物体内g a b a 的含 量相对较低，而很多微生物尤其是乳酸菌具有高产g a b a 的能力，因此，选育 g a b a 高产菌株来生产发酵乳制品或生物产品是当前研究的热点之一。 1 3 丫氨基丁酸的分布与制备 1 3 1 丫氨基丁酸的分布 g a b a 是在动植物体内都能检测到的非蛋白质氨基酸，分布范围非常广泛 1 4 3 , 6 0 , 6 1 】。早在1 9 4 9 年，s t e w a r d 等发现马铃薯中天然存在g a b a ；1 9 5 0 年，r o b e r t 等报道了正常哺乳动物大脑中g a b a 浓度特别高。1 9 7 5 年，第二届国际g a b a 专题 讨论会上，正式确认g a b a 为哺乳动物中枢神经系统的一种抑制性神经递质【2 】。 研究发现，植物体内的g a b a 是植物体对外界条件激烈变化时应激反应的产物 i 6 2 , 6 3 。植物组织q b g a b a 虽然广泛，但含量都较低且分离困难，因而从动植物体内 直接提取g a b a 并作为食品配料的可行性较小。 动物体内，g a b a 主要分布于神经组织中，在哺乳动物的脑组织内分布较为集 中，而在周围器官组织中含量则很少【删。因此，直接食用哺乳动物的脑组织可在 一定程度上补充g a b a 5 3 1 。 1 3 2 丫氨基丁酸的制备 作为一种新型的功能因子，g a b a 既可开发成具有显著药理作用的药物，又 可开发成保健性食品，前景十分乐观。动植物中天然g a b a 存在量低，很难大量 黑龙江大学硕士学位论文 提取分离，目前获得g a b a 的方法包括化学合成法和生物法，其中生物法包括植 物富集法和微生物发酵法。 1 3 2 1 化学合成法 化学合成g a b a 一种方法是通过邻苯二甲酰亚氨钾和丫一氯丁氰在高温条件下 反应，产物与浓硫酸一起回流，再经过结晶提纯制得3 1 。另一种方法是通过2 吡咯 烷酮经过氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得【6 5 】。 化学合成法制备g a b a 反应迅速，但是由于反应条件苛刻、安全性差、能耗 大，且得率较低等原因，很难在食品生产等领域广泛应用。 1 3 2 2 植物富集法 高等植物中，g a b a 含量通常在0 0 3 1 3 3 5 9 k g 之间，超过许多蛋白质氨基酸 的含量【蛔。在植物组织中合成和转化g a b a 的主要途径1 6 6 1 是通过对外界条件的应 激反应来实现的。一些可供食用的植物如：茶叶、桑叶、发芽糙米、鲜蔗、果仁 等都含有y 氨基丁酸【3 4 , 6 9 , - 7 0 。 植物富集的g a b a 含量较低，分离提取困难，很难规模化生产，因此寻找一 种快速高产并较易分离提取得到g a b a 的方法迫在眉睫。 1 3 2 3 微生物发酵法 相比而言，化学合成的g a b a 安全性差、环境污染严重，植物富集的g a b a 含量较低，因而微生物发酵生产g a b a 具有非常广泛的开发前景。 初期研究主要以大肠杆菌发酵生产g a b a 。在发酵培养过程中，利用大肠杆 菌谷氨酸脱羧酶的脱羧作用，将l - 谷氨酸或其钠盐转化为g a b a ，再分离纯化得 到g a b a ，制品一般用于化工目的【7 l 】。赵景联7 2 1 等对固定化大肠杆菌细胞生产 g a b a 达到了较高的转化率，然而利用此种方法制备的g a b a 用于食品、保健品 和保健药剂的添加成分，存在很大的生产安全隐患和卫生问题。因此，寻找含有 谷氨酸脱羧酶的安全性生产菌株如红曲霉、酵母菌、乳酸菌等逐渐代替大肠杆菌， 催化谷氨酸等前体物质脱羧合成g a b a ，为其能够应用于医药与食品等领域就显 得尤为的重要。 在多种细菌、古生菌和真核微生物中发现了g a d 的存在1 9 。近年来，国r 勾j l - 第1 罩绪论 学者的研究兴趣转向了一些食品安全级微生物，如红曲霉、酵母菌、乳酸菌等均 可用于g a b a 的生产。据统计1 3 1 ，能合成g a b a 的红曲霉菌株有：安卡红曲 m o n a s c u sa n k ai f o4 4 7 8 ，丛毛红曲菌m o n a s c u sp i l o s u sa t c c16 3 6 8 、m o n a s c u s p i l o s u sg m 10 0 ，紫红曲霉m o n a s c u sa r a n e o s u sk f r l0 0 3 7 1 ，m o n a s c u sk a o l i a n g a t c c 4 6 5 9 2 ，m o n a s c u s p u r p u r e u sc c r c 3 1 6 1 5 、m9 0 1 l 、n t u6 0 1 、a t c c6 4 0 5 。 2 0 0 3 年，s u 等【7 3 】采用紫红曲霉m o n a s c u sp u r p u r e u sc c r c 3 1 6 1 5 进行固体发酵， g a b a 含量达到1 2g l 【g 。2 0 0 4 年，孙佰申【8 1 获得一株高产g a b a 的丛毛红曲霉 菌m o n a s c u sp i l o s u sg m1 0 0 ，在1 0 0l 发酵罐及通风曲池发酵7 天，发酵滤液中 g a b a 含量达0 1 8g 几。日本t s u c h i y a 等对生产丫氨基丁酸的某种红曲霉进行了深 入研究7 4 】，结果表明：菌体培养3 天后g a d 活性达最大值；酶活随着磷酸吡哆醛 的浓度增加而增大，其最适浓度为5 0l m a o l l ；最适p h 5 6 ；最适温度4 0 ( 2 ，超过 5 5 ( 2 酶丧失活性，5 下保藏菌种，酶活最高。还有，w a n g 等【7 5 】采用m o n a s c u s p u r p u r e un t u6 0 1 进行固体发酵培养，g a b a 产量达到了5 0 0 4g k g 。酿酒酵母 在发酵食品中获得的广泛应用，具有很高的安全性，t a k a h a s h i 等1 7 6 】筛选到 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eu t - 1 的突变菌株g a b a 7 1 和g a b a 7 2 ，其发酵液中 g a b a 浓度分别达到了o 4m m 和o 4 2m m ，分别较野生株提高了2 0 和2 1 倍。 近年来，己有很多报道t 2 , 7 7 - 8 0 证实乳酸菌也具有g a d 活性，能催化谷氨酸脱羧合 成g a b a 。 ( 1 ) 乳酸菌发酵合成g a b a 乳酸菌是一种食品安全级的微生物具有巨大的市场开发潜力。2 0 0 2 年，日本 健康营养学会统计f 8 0 1 ，日本批准的1 9 大类1 7 1 种健康食品中，乳酸菌类产品占全 部的8 2 1 。2 0 0 2 年，h a y a k a w a 掣8 明对8 株乳酸菌进行筛选，发现乳酸菌i f o1 0 0 2 5 在添加5 谷氨酸为底物的条件下，能积累产生1 0g l g a b a 。2 0 0 9 年，朱晓立等 剐分离获得一株乳酸乳球菌，对该菌株进行微波诱变处理，得到1 株突变菌株， y 氨基丁酸产量达5 7 8g l 。2 0 0 5 年，k o m a t s u z a k i 等旧分离到一株副干酪乳杆菌 l a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e i n f r i7 4 1 5 ，优化后g a b a 的产量高达到3 1 1 5g l 。 与日本相比，国内的研究起步较晚。国内许建军等【8 2 1 人首次成功筛选出高产 黑龙江大学硕士学位论文 g a b a 的乳酸菌l a c t o c o c c u sl a c t i ss y f s1 0 0 9 ，发酵液中g a b a 含量提高到2 0 0 m g 1 0 0m l 。2 0 0 4 年，钟环宇等【8 3 】利用乳酸菌和酵母菌作为混合发酵菌种制备t 氨基丁酸，g a b a 的浓度达3 0 0 5 0 0m g 10 0m l 。刘清等【7 明筛选到一株高产g a d 的乳酸菌，对其发酵培养基与发酵条件进行优化后，g a b a 含量可达到3 1g l 以 上。2 0 0 6 年，夏江l 踟等人分离到一株高产g a b a 乳酸菌株h j x j 0 1 ，初步鉴定为 l a c t o b a c i l l u sb r e v i s ，在添加5 l 谷氨酸钠的g y p 培养基中，生产g a b a 最大积 累量为7 0g l 。利用紫外线和x 射线对出发菌株进行诱变处理，得到1 株突变菌 株h j x j 一0 8 1 1 9 ，合成g a b a 最大量为1 7 0g l ，经连续传代1 2 次，遗传性状稳定。 此外，某些干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 和唾液链球菌( s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ) 在特定培养基中也有高产g a b a 的能力。 ( 2 ) 乳酸菌合成g a b a 的机理 乳酸菌合成g a b a 的机制 最新的研究报道，天然乳酸菌的耐酸生长机制可能与它们所含有的氨基酸脱 羧酶活力有关1 8 粥8 】：一些乳酸菌表现出了g a d 活力【鲫，启示我们可以利用它们生 物合成g a b a 。乳酸茵在发酵过程中产生乳酸，造成较低的p h 环境，这种环境不 利于乳酸菌的生长，而g a d 活性恰在低p n 下得到激发，催化脱羧反应。t a k e s hh 等【8 明认为此过程中，l 一谷氨酸由细胞外运输至膜内，在胞内g a d 的催化下消耗1 个矿生成g a b a 并释放出c 0 2 。细胞内的谷氨酸脱羧消耗矿，造成细胞膜两侧 p h 压差和质子势差，而这种质子作用力可促使l 谷氨酸向胞内运输，c 0 2 向外自 由扩散则使循环不可逆的进行下去。 乳酸菌合成g a b a 的关键酶 g a d 是催化谷氨酸或其钠盐脱羧合成g a b a 的关键酶。细菌、昆虫、植物和 哺乳动物等不同来源的g a d 结构差异很大，结构差异与它们化学反应的共性和生 理功效的关系是目前研究的热点之一。 目前，关于g a d 研究最多最深入的为e c o l ig a d 。1 9 9 2 年，s m i t h l 9 0 1 等报道 了e c o l ig a d 完整的氨基酸序列。其g a d 可由谷氨酸诱导生成，全酶由6 个相 同的5 3 k 亚基组成，每个亚基都有磷酸吡哆醛共价结合到赖氨酸残基上。该酶在 第1 章绪论 低温、高p h 条件下易于解离，最适底物l 谷氨酸，p h 4 叫5 之间酶活最高。u e n o t 9 1 】 等分离纯化了l a c t o b a c i l l u sb r e v i s 的g a d ，并研究了其部分酶学性质，发现该酶 为二聚体，两个亚基相对分子质量均为6 0 k ，最适温度3 0 ，最适p h 4 2 ，k m 为 9 3m m o l l ；m a s a r un t 9 2 1 等研究的l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s p 1 a c t i s 来源g a d 则是单 体形式，相对分子质量为5 4k ，最适温度3 0 c ，最适p h 4 7 ，k m 为0 5 1m m o l l 。 不同来源的g a d 结构不尽相同，g a d 活性差别也很大，这可能与其自身的 酶学特性有关，由此决定了乳酸菌耐酸能力及富集g a b a 的能力。 此外，还有一些因素能够影响g a d 的活性：如0 2 、温度、p h 以及c a 2 + 、p l p 等化学物质。 无0 2 条件下，线粒体氧化磷酸化作用减弱，还原电位增高，即n a d h n a d + 比值变大【9 3 1 ，a d p 转化为a t p ，s s a d h 活性降低，催化s s a 的反应减弱，有利 于g a b a 的积累。 迅速降温能够增加g a b a 的积累，可能是温度迅速降低导致细胞结构破坏， 降低了细胞质p h ，谷氨酸脱羧酶活性变大【9 4 1 ，引起g a b a 量的增加。 g a d 在酸性环境条件下具有较高的活力，p h 6 0 以上时几乎无活性，这与g a d 诱导产生机制是相关的。许建军等【9 5 1 试验表明，l c 1 a c t i s 在受控制的中性培养基中 生长时，没有y 氨基丁酸的合成也检测不到g a d 活力。 化学物质对酶活的影响【7 , 9 6 ：磷酸吡哆醛、v b 6 及c a 2 + 在一定浓度时都能促进 酶活，添加量小于1 0 0 “m o l l 时，对酶活影响的大小为p l p v b 6 c a + 。反应体系 中添加的乙酸浓度低于0 0 5m o l l 时，可提高酶活，但增加乙酸浓度，酶活力逐 渐下降。此外，巯基乙醇、半胱氨酸和对氯高汞苯甲酸等一些化学物质可抑制g a d 活性。 1 4y 氨基丁酸的检测方法 1 4 1 纸色谱萃取法和薄层色谱法 氨基酸分析初期主要采用纸层析色谱和薄层色谱法【舛】，它们都是由于在展开 剂中不同的氨基酸分配系数不同、移动速率不同，进而达到分离，并且遇茚三酮 黑龙江大学硕士学位论文 | 1 发生能够显色反应，可进一步进行定性或定量分析。 本方法能够将复杂的氨基酸分离，可用于成分复杂发酵液的定性分析。 1 4 2b e r t h e l o t 比色法 b e r t h e l o t 反应【2 5 朋是利用苯酚、次氯酸钠与游离氨反应呈蓝色，来测定不同体 系中微量氨。g a b a 和蛋白质氨基酸在b e r t h e l o t 反应中的响应差别就很悬殊， g a b a 有很高的响应，而洳氨基酸响应低。g a b a 浓度越高，反应后溶液蓝色越 深。因此，可以通过反应后溶液所呈现蓝色深浅来比较测定g a b a 含量。 本方法 3 4 1 反应迅速，灵敏度高，适用于大量样品的检测，但因容易受到游离 氨干扰，不适合测定复杂成分中的g a b a 含量，可用于检测g a d 酶反应体系中 的g a b a 变化情况。 1 4 3 氨基酸自动分析仪法 氨基酸自动分析仪原型9 8 1 是利用各种氨基酸酸碱性、极性和分子大小等性质 不同，使用阳离子交换树脂进行色谱分析，采用不同p h 和离子强度的缓冲溶液依 次进行洗脱。洗脱下来的氨基酸与茚三酮进行柱后衍生显色，在最大吸收峰处， 用紫外可见光检测器进行分析检测。 该方法准确，操作简单，灵敏度高，但检测速度慢，不利于大量样品的检测。 1 4 4 高效液相色谱法 与蛋白质氨基酸一样，g a b a 没有紫外和荧光吸收，很难直接检测，但可通 过衍生反应形成能够检测到的紫外或荧光吸收物质。因此，高效液相色谱法与柱 前衍生技术相结合就- i n 定微量g a b a ，已报道过的衍生化试剂有多种1 9 9 , 1 0 0 1 ，如 邻苯二甲醛