（果树学专业论文）利用SSR和RAPD技术构建柑桔分子遗传图谱.pdf

西南大学硕f 学位论文摘要 利用s s r 和r a p d 技术构建柑桔分子遗传图谱 硕士研究生：鲁玉洋 指导教师：陈善春研究员 摘要 柑桔是世界上最重要的果树树种之一：目前全世界栽培柑桔约1 亿亩，年产1 1 亿吨以上， 年贸易额约8 0 亿美元，为全球第四火贸易农产晶。我国柑桔业近几十年来得到了迅猛发展， 柑桔已成为我国南方晟大宗的果树树种，栽培面积达2 4 0 0 多万亩( 居世界首位) 。产量近1 5 0 0 万吨( 世界第二：位) ，若以每吨柑桔鲜果产值1 0 0 0 元计，2 0 0 4 年全国柑桔产值高达1 5 0 亿元以 上。柑桔业已成为我国南方广大山区、贫困区和三峡库区农村经济的支柱产业之一，在社会 主义新农村建设、农民脱贫致富彝小康、山区水七保持和三峡库区移民安置中发挥了重要作 用。 晶种的实时更新换代是各种产业可持续稳定发展的基础，我国柑桔产业的发展也不例外。 特别是加入w t o 后，面对激烈的国际市场竞争，我国进行大规模的柑桔品种更新抉代和结构 调整显得尤为迫切。但迄今为止，我国自主培育的优新柑桔品种很少，加之受到知识产权的 限制，目前可以利用的品种远不能满足品种更新换代的需求，因此培育具有自主知识产权和 适应市场需要的柑桔优良新品种对我国柑桔产业发展具有重要意义。然而，柑桔常规育种效 率低，育种进程缓暖，短期内难以培育获得优良新品种。 近年来蓬勃发展的植物分子育种技术为柑桔业提供了一条全新、高效的育种途径。利用 分子生物学技术和手段，针对柑桔育种中的重要性状和重要问题，深入开展基因的遗传、定 位、克隆和调控机理等研究，通过分子标记辅助育种( m a s ) 和基囡工程等方法进行柑桔重 要性状的定向改良，创造新的品种类型，将人人提高柑桔育种效率，加快育种进程。分子遗 传图谱的构建是植物基因组研究的重要内容之一，拦分子育种研究的重要基础。高密度的分 子遗传图谱已有效地应用丁| 基因定位、图位克隆基因、重要农艺性状q t l 定位、分子标记辅助 育种( m a s 怫1 比较基因组学等研究中。因此，对具有重要经济价值和迫切的育种需求的柑桔类 果树来说，构建分子遗传图谱具有重要意义 本研究以清见桔橙( er e t i c u l a t a c s i n e n s i s ) ( 母本) 与强德勒柚( cg r a n d i so s b ) ( 父 本) 的f 1 代1 0 2 株为作圈材料，利用s s r ； i i r a p d 两种标记，甩绕柑桔分子遗传图谱的构建， 进行了柑桔基因组d n a 提取方法的改进、适用丁柑桔的s s r 标记体系的建立以及s s r t t r a p d 标记的分离分析等方面研究，并最终构建了柑桔分子遗传图谱。主要结果如f ： 1 、适合s s r 分析和r a p d 分析的柑桔基因组d n a 提取方法 在c t a b 溶液中加入抗氧化剂1 p v p 1 1 0 2 b 巯基乙醇，提取的d n a 粗提物晕无色透明 i 状，没有褐化现象。 用不同生睦期的材料提取柑桔捌d n a ，幼i 提取的基因尘h d n a 质量最好，得率最高。 2 、适合遗传图谱构建的s s r 标记技术的建立 通过优化p c r 反麻的复性温度和反应体系等参数，筛选多态性丰富的s s r 引物，建点r 适 合构建柑桔遗传蚓谱的s s r 分析技术：柑桔s s r 分析| j p p c r 反戍体系以2 0 l 为宜含1 0 xb u f f i e r 2 ，o t t l ，2 5 m mm g c l 21 6 p _ l ，25 m md n t p l 6 9 t l 。，1 5n e d r t lp r i m e r 各i o t l ，5 u i t lt a q 聚合酶 02 l ，襁扳d n a ( 5 0n g 1 t l ) 1 o p l ：再引物复性温度怫度试验结果表明，所筛选f t t j 2 8 对s s r 引 物的最仕复性温度在5 4 到5 8 之间。 从7 5 对s s r 引物中筛选获得在双亲间存在多态悱的引物2 8 对，多态性比例为3 7 3 3 ，这些 引物适台_ | _ i jr 构建柑桔遗传图谱的s s r 分析。 3 、作图群体s s r 分析 用筛选出的2 8 对引物对f - 群体进行 s s r 分析，兆获得稳定、至少可重复1 次的多态性带删 5 9 条，j f 均每对引物可产生2 1 条多态性条带。经 玎测验，获得的5 9 个s s r 多态性位点中， 有3 4 个位点符合孟德尔分离比例( 1 ：i ) ，可州r 构建分子遗传浏谱：其余2 5 个位点因不符合蔷 德尔分离比例而不能州于作图。 4 、作图群体r a p d 分析 从2 0 个r a p d 随机引物中筛选获得在双亲间存盘多态性的引物8 个，多态性比例为4 0 。 州筛选出的8 个随机引物对f l 群体进行多态性分忻，共获得稳定、至少可重复1 次的多态性 带刑2 1 个，平均每个引物可产，f 2 6 4 条多态性条带。经p 方测验，获得的2 1 个r a p d 多态性俄 点中，有1 1 个位点符合孟德尔分离比例( 1 ：1 ) ，呵刚r 作图；其余1 0 个位点因不符合需德尔分 离比例而不能用于作幽。 5 、柑桔分子遗传图谱的构建 利删s s r r l r a p d 标记构建了一张包含11 个连锁群，由4 5 个标记位点组成的柑桔( 2 n = l8 ) 分 f 遗传图谱，其中包括3 4 个s s r 标记，1 1 个r a p d 标l 己，图谱总长：度4 0 2 c m ，标记间平均距离 为8 9 3 c m 。连锁群上的标记数在2 7 个之间连锁耕艮度变动在6 c m 7 i e m 之间。g r o u p 包 禽的标记最多。有7 个：标记晟少的连锁群( g r o u p l l l 、g r o u p v ) 仅有2 个标记。g r o u p l l l 的平 均图距最人，为2 1 c m ：g r o u p v 的平均图距鼯小，, j 6 c m 。曲：鹅个图谱h ，存在豳距人于2 0 c m 的空隙6 个。 关键词：柑桔分子标记遗传图谱 西南大学硕士学位葩文 a b s 昀c t c o n s t r u c t i o no fg e n e t i cl i n k a g em a p so fc i t r u s b a s e do ns s ra n dr a p dm a r k e r m a s t e rc a n d i d a t e ：l u y u y a n g s u p e r v i s o r ：p r o f c h e ns h a n c h u n a b s t r a c t c i t r u si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf i l a i tc r o p si nt h ew o r l d ，a n dw i d e l yp l a n t e di nt r o p i ca n d s e n u t r o p i ca r e a st h ec i t r u sg r o w i n ga r e ar e a c h e da b o u t6 6 6m i l l i o nh e c t a r e sa l lo v e rt h ew o r l d 。 a n n u a la g g r e g a t ep r o d u c t i o nc l i m b e dt o1 1m i l l i o nt o n e s ，a n n u a lw a d ev a l u ew a sa b o u t $ 8b i l l i o n i t h a sb e c a m et h e f o u r t hl a r g e s ta g r i c u l t u r a lp r o d u c t s i n c h i n a ，c i t r u si n d u s t r yb o o m e da st h e d e v e l o p m e n to fc h i n e s ee c o n o m y , a n dc i t r u si n d u s t r yh a sa l r e a d yb e c o m eas u p p o r t i n gi n d u s t r yi n t h er u r a la r e a s ，e s p e c i a l l y , i nt h es o u t ho fc h i n a ，w h i c hh a sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei na d j u s t i n g a g r i c u l t u r ea n dm r a le c o n o m i cs t r u c t u r ea n dh e l p i n gt h ef a r m e r st ot h r o wo f f p o v e r t y g e n e t i ci m p r o v e m e n to fc u l t i v a r si st h ek e yo ft h eh e a l t h yd e v e l o p m e n to fc h i n e s ec i t r u s i n d u s t r y ，e s p e c i a l l y ，s i n c et h ee n t r yi n t ow t o c l l i h a sb e e nd o i n gt h eb e s tt oi m p r o v ei t sc i t r u s c u l t i v a r sa n do p t i m i z ei t sc i t r u si n d u s t r i a ls t r u c t u r e h o w e v e r ，s of a r ，f e we x c e l l e n te u l t i v a r sb r e db y o u r s e l v e sh a sb e e ne x t e n d e di nw i d ea r e a s , a d d i t i o n a l l y ，o w i n gt ot h er e s t r i c t i o n so fi n t e l l e c t u a l p r o p e r t yr i g h t sa s s o c i a t e dw i t hc i t r u sb r e e d i n g ，f e wn e wc i t r u sv a r i e t i e sf r o mo t h e rc o u n t r i e sc a nb e a v a i l a b l et oc h i n e s ef a r m e r sf o rs a t i s f y i n gt h er e q u i r e m e n to fr a p i d l yr e n e w i n go fc i t r u sv a r i e t i e s t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yf o rc h i n e s ec i t r u sb r e e d e r st ob r e e dn e we x c e l l e n tc i t r u sc u l t i v a r s ，w h i c h h a v ei n d e p e n d e n ti n t e l l e c t u a lp r o p e r t yr i g h t sa n dc a nb ea d a p t e dt ot h er e q u i r e m e n to fm a r k e t a l t h o u g hc o n s i d e r a b l ep r o g r e s si nc i t r u sg e n e t i cb r e e d i n gh a db e e nm a d ei nt h ep a s ts e v e r a ld e c a i 虻s t r a d i t i o n a lb r e e d i n gi sb e c o m i n gi n e f f i c i e n t ，a n dc a r tn o tk e e pu pw i t ht h er e q u i r e m e n to fc i t r u s p r o d u c t i o n i nr e c e n ty e a r s ，t h es u c c e s s f u la p p l i c a t i o no fv a r i o u sm o l e c u l a rb r e e d i n gt e c h n o l o g i e s ( e g ， g e n e t i c l i n k a g em a p p i n g ，n r a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n ，q t l , g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ) i nm a n yc r o p s p r o v i d e san o v e la n dp r o m i s i n gp a t h w a yf o rc i t r u sb r e e d i n g t h ec o n s t r u c t i o no fg o o dm o l e c u l a r g e n e t i cm a pi sac r u c i a lb a s i so ft h ea p p l i c a t i o no ft h em o l e c u l a rb r e e d i n gt e c h n o l o g yi nc i t r u s b r e e d i n g b e s i d e s ，ah i g h - d e n s i t yl i n k a g em a p w a sa l s oa ne s s e n t i a lt o o lf o rf a c i l i t a t i n g i i l ( q i l , j a ：翱, , j ll 学位论立 a b s t r a c t h i g h r e s o l u t i o ng e n e t i cm a p p i n ga n dt h ei s o l a t i o no fi m p o r t a n ta g r o n o m i c a lg e n e s ，a l l o w i n gg e n e t i c d i s s e c t i o no fq u a n t i t a l i v et r a i t l o c i ，a s s i s t i n gi n l o c a lc o m p a r i s o n so fs y n t e n y ，a n d p r o v i d i n ga n o ld e r e ds c a f f o l d o nw h i c h c o m p l e t ep h y s i c a lm a p s c a nb ea s s e m b l e d t h e r e f o r e ，t h e a c c o m p l i s h m e n to fg e n e t i c l i n k a g em a po fc i t r u sw i l lb e i n v a l u a b l ei nd i r e c t i n ge f f o r t st o w a r d s g e n e t i ci m p r o v e m e n to f c i t r u sv a r i e t ya sw e l la sf u n c t i o n a lg e n o m i cs t u d i e so f c i t r u s i n t h i s s t u d y ，10 2f ih y b r i d so b t a i n e df r o mc o i l o i l e dc r o s scr e t i c u l a t a x c5 i n p n s i sa n d c ，g r a n d i so s ba sm a p p i n gp o p u l a t i o na n ds s ra n dr a l l dm a r k e r sw e r eu s e dt oc o n s t r u c tt h e p l i m a r yg e n e t i c l i n k a g em a p so l 、c i t tl i s a tt h es a m et i m e a no p t i m i z e dc i ”u sg e n o m i ce x t r a c t i o n m e t h o d sa n d i m p r o v e d c i t r u ss s ra s s a y t e c h n i q u ew e r ee s t a b l i s h e d ，a n ds s ra n dr a p d s e g r e g a t i o na n dc o n s t r u c t i o no f m o l e c u l a rg e n e r i cm a p sw e r ea l s od i s c u s s e d i c i t r u sg e n o m i cd n ae x t r a c t i o n c t a bb u f f e rw i t h1 p v pa n d0 2 b m e r a p t o e t b a n o lw h i c hd i dm u c hg o o df o rd n a p r e p a r a t i o nw e r eu s e dd n ae x t r a c t e dt h r o u g ht h i sm e t h o dw a sl u c i d ，n o tb r o w n v a r i o u sd e v e l o p i n gs t a g e sl e a v e sw e r eu s e dt oe x t l a c t ec i t r u sd n a ，t h er e s u l t ss h o w st h a td n a i s o l a t i o nf r o mt e n d e rl e a v e sh a st h eh i g h e s ty i e l da n dt h eb e s tp u r i t y 2e s t a b l i s h m e n to f c i t r u ss s rr e a c t i o ns y s t e m c i t r u ss s rr e a c t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e db yo p t i m i z a t i o no fa n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dt h e t o t a lv o l u m ef o rp c rr e a c t i o n ：t i r eo p t i m i z e dt o t a lv o l u m ef o rc i t r u ss s rr e a c t i o ni sa2 0 9 lr e a c t i o n m i x t u r ec o n t a i n i n g1 0 x b u f f e r2o b l ，m g c l 2 ( 2 5 r a m ) l6 b l ，d n t p ( 25 r a m ) 16 9 l e a c hp r i r n e r ( i5n g b t l ) io l ；t a qd n ap o l y m e r a s e ( 5 u 1 t t 。) 02 9 la n dd n a ( 5 0n g g l ) 1 o g l ；t h ep r o p e r a n n e a l i n gt e m p e r a t u r eo f t h e2 8p a i r so f s s rp r i m e r st e s t e di sf or i n5 4 。ct o5 8 。c 2 8o u to f7 5 p a i r s o fs s rp r i m e r ss h o w e d h i g h l yp o l y m o r p h i c l o c ib e t w e e nb o t h p a r e n t s ( c r e t i c u l a t a x cs i n e n s i sa n dc g r a n d i so s b ) ，a n dt i r ep o l y m o r p b i cp r o p o r t i o ni s3 73 3 t h e s ep r i m e r sa r ef i tt oc o n s t r u c t i o nc i t r u sg e n e t i cm a p 3 s s ra n a l y s i so f f ip o p u l a t i o n 5 9h i g h l yp o l y m o r p h i cf r a g m e n t so r i g i n a t e df r o mf p o p u l a t i o no ft h e s ep a r e n t sw e r er e v e a l e d b yt h es e l e c t e ds s rp r i m e r s ，a n do na v e r a g e 。2 i h i g h l yp o l y m o r p h i cl o c iw a sa m p l i f i e db yap a i ro f s s rp r i m e r s b yw a yo fc h i s q u a r et e s t ，3 4o f 5 9h i g h l yp o l y m o tp h i cf r a g m e n t ss h o w e dt h e e x p e c t e dm e n d e l i a ns e g r e g a t i o na n dc a nb eu s e dt oc o n s t r u c t i o ng e n e t i cm a p ，w h i l e2 5p o l y m o r p h i c l o c id i dn o ts h o w a1 ：im e n d e l i a ns e g i e g a t i o n 4 r a p da n a l y s i so ff tp o p u l a t i o n a m o n g2 0r a n d o mp r i m e r sw e r et e s t e d ，8 ( 4 0 ) p r i m e r sg a v ea m p l i f i e db a n d si nt h ep a r e n t s t h e8r a n d o mp r i m e r sr e v e a l e d2 1h i g h l yp o l y m o r p h i cr a p dl o c ii nf ip o p u l a t i o no f t h e s ep a r e n t s ， w i t h26 4h i g h l y p o l y m o r p h i cf i a g e m e n t sp e r r a n d o mp r i m e r b y w a ) ，o fc h i s q u a r et e s t v 啊南人学坝i 。学位论文a b s t r u c t w i t h2 6 4 h i g h l yp o l y m o r p h i cf r a g e m e n t sp e rr a n d o mp r i m e rb yw a yo fc h i s q u a r et e s t 0 ( 4 7 6 2 ) d e p a r t e df r o mm e n d e l i a ns e g r e g a t i o nl a w s ( 1 ：1 ) f r o mt h e s ep o l y m o r p h i cl o c i ，w h i l ei 1 p o l y m o r p h i cl o c ie x p e c t e d1 ：1s e g r e g a t i o nr a t i o 5c o n s t r u c t i o no fm e l o c u l e lg e n e t i cm a p so fc i t r u s t h eg e n e t i cl i h k a g em a po fc i t r u s ( 2 n = 18 ) w a sb u i l ta c c o r d i n gt os s ra n dr a p d a s s a y si no u r e x p e r i m e n t s t h em a pw i t hat o t a ll e n g t ho f4 0 2c ma n da na v e r a g ei n t e r v a lo f89 3c mh a d4 5 m a r k e r s ( 3 4s s ra n d 1 1r a p dm a r k e r s ) d i s t r i b u t e di n1 l l i n k a g eg r o u p s t h el e n g t ho ft h e i n d i v i d u a ll i n k a g eg r o u p sr a n g e dl i o m6 c m ( g r o u p v ) t o7 l c m ( g r o u p v l l l ) a n dt h en u m b e ro f m a r k e ri nt h ei n d i v i d u a ll i n k a g eg l o u pi sf r o m2 ( g r o u p l l l 、g t o u p v ) t o7 ( g r o u p l i ) t h ea v e r a g e i n t e r v a ld i s t a n c e o fm a r k e rv a r i e df r o m6 c m ( g r o u p v ) t o21c m ( g r o u p l l l ) m o r e o v e ls i xg a p s l o n g e rt h a n2 0 c mw e r eo b s e r v e di nt h e1 1 l i n k a g eg r o u p s k e yw o r d s ：c i t r u sg e n e t i cm a p m e l o c u l e rm a r k e rs s r 独创性声明 学位论文题目：型周曼盘垦旦拄盔掏建挝挂金至董佳图谱 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示i 射意。 学位论文作者： 鳝衅 签字日期易吩年月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机梅送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学 研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：日不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名髦奠湃导师签名： 签字日期：加6 年占月1 日签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 忍垴 口占年月7 日 电话：1 2 曲雨大学帧上学位论，艾 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 柑桔概况 柑桔是世界第一大水果，柑桔业是一个规模近千亿美元的产业，也是第四大国际贸易农 产品，年贸易额达8 0 亿美元以上。全世界有一百多个国家和地区生产柑桔，柑桔种植、加工 和出口已成为一些国家和地区重要的经济来源。世界柑桔种植面积约1 亿亩，总产量1 1 亿吨以 上，其中巴西、美国两个柑桔生产人国的柑桔产量分别达到1 9 2 1 万吨和1 3 7 7 万吨，占全球产 蹙的1 8 7 和1 3 4 。 我国是世界柑桔起源中心之一，栽培历史达4 0 0 0 年以上1 1 l 。目前我国柑桔种植面积2 4 0 0 多万亩，产量近1 5 0 0 万吨，分列世界第一和第二位。柑桔作为我国南方第一大水果，几乎r 南方各种水果总产量的一半，己成为农村一大支柱产业，农民和地方财政收入的主要来源之 。柑桔是我国南方栽培最广、经济地位最重要的果树，2 0 + 省( 市、区) 都有栽培。其中， 共有柑桔生产县( 市) 9 8 0 多个，主要集中在浙、赣、湘、鄂、川、渝、闽、粤、桂诸省( 市、 医) 。在许多主产地柑桔产值列种植业的第一或第二位。在许多柑桔主产县( 市) 、乡( 镶) ， 柑桔产值己占农业总产值的5 0 以上。 目前，柑桔品种结构不合理( 熟期过于集中、鲜食和加工比例失调) 是制约我国柑桔业 发展的重要因素之一。随着柑桔产业的快速发展和加入w 1 d 后参与国际市场的需要，我国止 在进行大规模的柑桔品种结构调整，但迄今为i r ，我国自主培育的优新柑桔品种很少，远不 能满足产业发展的需求，目前大面积栽培的柑桔优良品种多为国外引进品种( 如脐橙系列) 口3 l ； 由于引进成本过高、i i u , b 越来越严格的输出限制及品种知识产权保护问题，培育具有自主知 识产权的优良新品种已成为发展我国柑桔产业的当务之急。 分子遗传图谱的构建是植物基因组研究的重要内容之一，是分子育种研究的重要基础。 高密度的分子遗传图谱已有效地应用于基因定位、图位克隆基冈、重要农艺性状q t l 定位、分 子标记辅助育种( m a s ) 和比较基因组学等研究中。此外，柑桔分子遗传图谱在从分子水平 了解柑桔生长特性和发育规律，进行重要性状的遗传分析等方面也具有重要意义。因此，对 具有重要经济价值和迫切育种需求的柑桔类果树来说，构建分子遗传图谱具有重大意义。 1 2 构建遗传图谱的理论基础和方法 遗传图谱( g e n e t i cm a p ) ，也称连锁图谱( 1 i n k a g em a p ) ， 是指以遗传标记( 已知性状的基吲 或特定d n a 序列) 间重组频率为基础的1 条染色体或基因内位点的相对位置线性排列图”。分 子遗传图谱( m o l e c u l a rg e n e t i cm a p ) ，是以d n a 为标记的遗传图谱。建立高等生物详尽的遗传 图谱一直是遗传学家们研究的目标。分子遗传作图不仅在理论上，而且在育种实践上有十分 重要的意义和价值。通过与目的基冈紧密连锁的分子标记所构建的分子遗传图谱，为育种者 指明了育种目标及到达目标的最佳路径。植物分子遗传图谱不仅为育种者提供了一份基本资 西南大学碗i 学位论文 第1 章文献综述 料，使育种l 作目的性更强，有效性更高，同时为育种l ：作者提供_ r 数量无限、简便易行的 分子标记，这样在育种实践中，可利用分子标记提早选择( 即使在性状末表现之前也可进行1 ， 因而可人人提高育种效率，加速育种进程，缩短育种周期，节省财力和物力 s - z o 】。 l2 1 构建遗传图谱的理论基础 构建遗传图谱的理论基础是s u r o n - - b o v c n 的染色体遗传理论及摩尔根的连锁交换定律 ”i os u t t o n b o v e f i 理论认为：( 1 ) 体细胞核内的染色体成对存在，其中一条来自雄性亲本，成对 的两条染色体是同源的；( 2 ) 每条染色体在个体的生命周期中均能够保持其结构上的恒定性和 遗传上的连续性；( 3 ) 在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随后又相互分离，走 向细胞两极，形成两个单倍体性细胞。连锁交换定律则告诉我们，位丁同一染色体上的基因 在遗传上一般倾向_ i r 维系在一起。连锁遗传的是顺序排列在一对同源染色体上的一些非等位 基冈，在减数分裂过程中非姊妹染色体问可发生交换，产生非等位基因之间的重组，形成重 组子。重组率的大小一般同非等位基因在同一染色体上的距离有关。遗传图谱的构建就是以 重组子推算重组率并转化为遗传距离，从而把遗传标记顺序排列在连锁群上的过程。同一条 染色体上的遗传距离可以根据重组率来计算，常用图距( m a p d i s t a n c e ) 单位“厘摩( c e n t i m o r g a n ，c m r 来表示。遗传图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，并不反映d n a 的实际长度。分子 遗传图谱构建的理论基础同经典遗传图谱一样，仍然是s u t t o n - - b o v e d 的染色体遗传理论及摩 尔根的连锁交换定律。 对多年生果树植物而言，由于世代周期长、单位面积种植的植株数量少，要得到表现个 体间差异的、有一定数量子代的高世代群体比较幽难；加之很多果树品种存在严重的自交退 化现象，渊而也很难获得具有一定数量子代的自交或网交纯系州。根据w e e d e n ”l $ 1 h e m m a t 3 1 等提出的“双一假测交”理论( d o u b l ep s e u d o t e s tc r o s s ) ，由于果树长期进化、k 期人：【选择和 长期无性繁殖，果树育种的杂交亲本均保持了高度的杂合性，其基因型在f t 代出现1 ：l 的分离 比例，与测交效果相一致，但因亲本之一并非纯台隐性，且这种利用亲本杂交获得的f l 群体与 测交有着本质不同，因而定名为“假测交”。“双”的意思是烈亲均为杂合体，这样的双亲相互杂 交后代的遗传表现与测交试验表现相似；冈此，根据“双假测交”理论，高度杂台的果树育 种的杂交亲本相当于纯合亲本的杂种一代；对亲本中所拥有的杂台位点而言，杂交后代就相 当于“f 。”白交产生的“f 2 ”群体，所以可以利用果树杂交一代群体构建分子遗传图谱。通过 这种方法w e e d e n 等m 1 率先在苹果上构建了分别拥有2 3 3 个和1 5 6 个分子侮点的连锁图，前者 含2 4 个连锁群体共计9 5 0c m ，后者含2 1 个连锁群；此后的诸多实践也证明， t 制果树f 1 代群体 作图是可行的，且作图效率高i “。8 】；国外已报道的柑桔和其他果树的分子遗传图谱很多是通 过f 代作蚓群体绘制的【1 5 ”4 ”。 1 2 2 构建遗传图谱的基本方法 2 西南大学硕十学位论文第1 章文献综述 如上所述遗传图谱的构建是通过重组子推算交换值，并换锋为遗传距离的过挥因此遗 传图谱的构建，首先要构建分离群体。根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立一个 能充分、准确反映染色体重组交换的分离群体，这个群体包含的交换信息越大、越均衡、越 准确，则构建的遗传图谱越能真实的反映客观的染色体结构。通常用于构建遗传图谱的分离 群体，有f ：群体、f 3 家系、重组自交系( r j l ) ，d h 系、回交一代( b c ) 以及多年生果树的f 代。 其次选择合适的标记种类。随着现代生物技术的发展，陆续产生了2 0 多种分子标记。具体选 用何种标记要依据标记的特点、实验条件、作图作物的生睦发育特性、对该作物的研究情况 及实验目的等因素来决定。第三步，搜集反映染色体交换信息的遗传标记。分子遗传图谱的 构建则是收集分子标记分离的数据，即通过对分离群体d n a 的不同处理分析获得各种分子标 记在双亲间表现差异，在后代中表现分离的分子标记信息。第四步，分子标记数据的处理分 析，构建遗传图谱。 1 3 作图群体 1 , 3 1 亲本的选配 亲本的选择直接影响构建分子遗传图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一般需要考 虑四个方面：( 1 ) 选择d n a 多态性丰富的材料作为亲本。一个图谱上与标记连锁的性状越多， 这个图谱的经济价值就越人2 ”。因此，作图亲本之间麻具有大量的有明显差异的可遗传形态 性状标记。地理距离或同工酶多态性可以作为判定亲本之问亲缘关系的一个标准。亲本亲缘 关系越小，多态性越丰富。此外，异交作物的多态性一般比自交作物高；( 2 ) 尽量选用纯度高 的材料作为亲本；( 3 ) 要考虑杂交后代的可育性。亲本间的差异过人，异种染色体之间的配对 和重组会受到抑制，导致连锁座位问的重组率r 降，造成严重的偏分离现象，从而影响分离 群体的构建，降低所建图谱的可信度和使用范围。 1 3 2 分离群体类型的选择 到目前为i l 很多植物的遗传图谱( ) 柑桔“2 “、大豆【2 7 】、j k 稻m 】、油菜【”、葡萄【3 0 1 、桃 1 3 1 1 ) 已被建成，并且有些作物( 如人豆和水稻等) 已按不同的作图群体够建出了多种遗传i 封谱。 尽管遗传图谱多种多样，各具特色，但遗传图谱的构建按作图群体稳定性可分为两大类：( 1 ) 1 f 嘲定性分离群体( f 2 、b c 群体、三交群体) 作图；( 2 ) 1 1 定性或永久性分离群体( 由基网型不同 的同质品系组成) 作图。不同类型的群体各有其优缺点： ( 1 ) 单交组合所产生的f 2 代及多年生果树的杂交f l 代群体 迄今为j r ，人多数连锁图谱是基于单交产生的f ：群体。除自交不亲和的材料外，这种 群体易于配制，且不需很艮时间。果树类作物为异型杂交物种，因种内杂交受抑，以至丁 很难有可利h - i 的自交或同交群体用于作图。根据h e m m a t 等提出的“舣假测交”( d o u b l e p s e u d o t e s tc r o s s ) 理论。高度杂台的果树品种其亲本相当丁纯合亲本的杂种一代，对亲本 3 中所拥有的杂台位点而言，杂交后代就相当于“f ”自交产生的“f 2 群体，所以可以利用果 树杂交一代群体构建分子遗传图谱。诸多实践也证明，利用果树f 。代群体作图是可行的， 且作图效率高“”；国外己报道的柑桔和其他果树的分子遗传图谱大部分是通过f 代作图 群体绘制的”。i 。 ( 2 ) 重组近交系( r e c o m b i n a n ti n b r e dl i n e s ，r i l ) r i l 群体是连续多代自交或姊妹交产生的，通常从f 2 代开始，采用单粒传的方法来建立的。 冈为连续自交可使基因型不断纯合，所以r i l 群体中每一个株系都是纯合的，也就是说r i l 群 体是一种可以长期使爿j 的永久性分离群体。理论上，建立一个无限大的r i l 群体，必须自交无 穷代才能达到完全纯合。但是，据吴为人等 3 2 1 的推算，对一个拥有l o 条染色体的物种，要建 立完全纯合的r i l 作图群体，至少需要自交1 5 代。在实际研究中，人们往往无法花赞这么多的 时间来建立一个真正的r i l 群体，所以常常使用自交6 7 代的“准”r i 口洋体。从理论上推算， 自交6 代后，单个基因座的杂合率只有大约3 ，基本接近纯合。实践证明利用这样的“准”r i l 群体来构建分子遗传图谱仍是可行的m 1 。 ( 3 ) 双单倍体( d o u b l e dh a p l o i d ，d h ) 与重组近交系一样，双单倍体同样可以大最地提供不同的试验材料，而且这种群体的产 生又不需要经过许多世代。只需将花药，小饱子培养或其他途径得到的单倍体材料加倍就可 以得到稳定遗传的材料，每个材料都可象一般品种一样地进行繁殖。其缺点是有些材料不容 易获得双单倍体。 f 4 1 同交和三交群体 对于自交不亲和材料，或在研究某种特殊问题( 如雌雄配子交换率的差别等) 就需要利j f = j 回 交或三交后代。b c ，( 回交一代) 群体中每一分离的基因座只有两种基因型，直接反映了f l 代配 子的分离比例，因而b c 。群体的作图效率最高，而且它还可以区分雌、雄配子在基冈闻的重组 率上是否存在差异。c a i 【蚓p e n gl i n g 3 s 1 分别用柑桔属间杂种b c ，代群体构建了连锁图谱。 1 3 3 作图群体的大小 应当根据实际情况和目标权衡确定合适的群体大小。大量的作图宴践表明构建分子遗 传图谱图谱所需的群体远比构建形态尤其是数量性状的图谱要小，人部分己发表的分子遗传 图谱所用的分离群体一般不足1 0 0 个单株或家系。从作图效率考虑，作图群体的大小取决丁- 两 个方面：一是随机分离结果可以辨别的晟大图距一二是两个标记间可以检测到重组的最小图距。 因此，如果是构建分子标记骨架连锁图，可采用大群体中的一个随机小群体，当需要