（植物学专业论文）铁钉菜ishige+okamurae抗菌和抑藻活性物质的研究.pdf

摘要 中文摘要 本研究以褐藻门的铁钉菜( i s h f g eo k a m u r a e ) 为实验材料，经由乙醇、乙醚溶 剂浸提，得到提取物浸膏，再通过石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分级萃取，针 对不同萃取相选择运用硅胶柱层析、硅胶薄层层析、大孔树脂层析以及s e p h a d e x l h 2 0 凝胶层析等分离手段，分离得到了铁钉菜数个组分。通过生物活性跟踪实验， 从中发现了一些具有较好抗生活性的组分，其中组分i s 3 1 、i s 4 具有抑藻活性，其对 球形棕囊藻的抑制效果最好，7 2 h 的e c 5 0 分别达到5 1 5 m g l , - r - 和5 9 3 m g l ；氯仿相的 r f 0 7 9 条带其具有较强的细菌抑制活性，g c - m s 分析发现其主要活性成份可能为 ( 2 ，2 一二甲基3 甲基磺酰氧基丙基) 4 ( 2 甲基3 环己酮) 丁酸；此外，铁钉菜正丁醇萃 取相的大孔树脂3 0 5 0 7 , 醇洗脱物对植物致病真菌的菌丝生长显示出较好的抑制 活性。 关键词：铁钉菜抑藻抑菌抑真菌活性物质 中文文摘 中文文摘 海洋是天然产物开发的最大库源，蕴含着巨大的开发潜力，海藻( a l g a e 或 s e a w e e d s ) 是海洋生物资源的重要组成部分。近年来，人们对海藻天然产物及其活性 进行了较深入的研究，发现了一些具有良好的抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗细菌、 免疫增强或抑制、抗氧化等功能的活性物质。铁钉菜作为一种具有经济和药用价值 的常见褐藻，其本身就具有保健、抗炎、驱虫的功效，体内所含有的一些有价值的 活性成分值得人们对其进行研究。因此本研究以铁钉菜为实验材料，对其抗菌、抑 藻的活性成分进行了分离分析和活性研究。 通过对铁钉菜乙醇乙醚粗提物进行细菌抑制实验、抑藻实验及真菌菌丝抑制实 验对铁钉菜粗提物的抗生活性进行了初步的研究。抑菌实验的结果说明，铁钉菜的 乙醇一乙醚提取物具有一定的抑菌活性，其对革兰氏阳性细菌的抑制效果要好于革兰 氏阴性菌。抑藻实验的结果说明铁钉菜粗提物对球形棕囊藻和海产小球藻的生长有 抑制作用，粗提物中存在着具有抑藻活性的成分。真菌菌丝抑制实验的结果显示铁 钉菜乙醇一乙醚提取物对三种供试真菌的菌丝生长均有一定的抑制作用，但抑制能力 不是很强。 根据铁钉菜粗提物活性测试的结果，继续对铁钉菜粗提物中的活性组分进行了 分离和活性跟踪。首先，通过对铁钉菜粗提物进行石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁 醇的分级萃取和活性测试，发现：低极性的石油醚萃取相具有最好的抑藻活性，氯 仿相细菌抑制活性最强、极性较强的正丁醇萃取相的菌丝生长抑制能力最强。然后， 再根据各个萃取相的极性和抗生活性( 抗细菌、抗真菌及抑藻) 的不同，分别择运 用硅胶柱层析、硅胶薄层层析、大孔树脂层析以及s e p h a d e x l h 2 0 凝胶层析等分离 手段，结合相应的生物活性跟踪检测，对铁钉菜中活性组分进行进一步的分离。 对极性低的石油醚萃取相，我们选用硅胶柱层析作为主要分离手段。通过对石 油醚相进行硅胶柱层析分离得到了i s l 、i s 2 、i s 3 、i s 4 、i s 5 五个组分并进行了活 性测试，结果显示i s 3 和i s 4 的抑藻活性最好。通过进一步硅胶柱层析从i s 3 中分 离到了组分i s 3 1 ，从i s l 中分到了i s l 1 和i s l 2 。采用藻细胞计算的方法测定了 i s 3 1 和i s 4 对海洋小球藻、球形棕囊藻和铜绿微囊藻的半抑制浓度e c 5 0 ，结果显 示i s 3 1 和i s 4 两个组分对球形棕囊藻的抑制效果最好，总体上看，i s 3 1 对各种藻 v 福建师范大学张迪硕士学位论文 的抑制效果普遍好于i s 4 。最后，将分离到的部分组分进行了c a 2 m s 分析发现i s l 的主要成分有两个一个为十五烷，另一个为棕榈酸乙酯；i s 2 的主要成分为角鲨烯 ( 全e ) 一2 ，6 ，1 0 ，1 5 ，1 9 ，2 3 一六甲基一2 ，6 ，1 0 ，1 4 ，1 8 ，2 2 一二十四碳己烯，其有抗肿瘤、 抗心血管疾病、抗氧化的功效；通过g c m s 分析从i s 3 1 分析出2 ，2 ，6 一三甲基辛 烷和2 ，4 一二甲基苯并( h ) 喹啉2 个组分。 氯仿相的抑菌能力具有一定的广谱性，抑菌试验显示其对各供试细菌不论革兰 氏阳性菌还是阴性菌都有较好的抑制效果。因此，进一步测定了其对7 种供试细菌 的最低抑制浓度( m i c ) ，结果显示其对供试菌中的烂尾病病原菌、大肠杆菌、枯草 芽孢杆菌的抑制效果最好，m i c 可达到3 1 2 5 m g m l 。通过薄层层析结合活性检测从 氯仿萃取相中分离到了抗菌活性较好并且具有一定的广谱性的t l f 0 7 9 条带。通过 g c - m s 分析发现r f 0 7 9 条带的主要成分为( 2 ，2 二甲基3 甲基磺酰氧丙基) 4 ( 2 甲 基一3 一环己酮) 丁酸( ( 2 ，2 - d i m e t h y l 一3 - m e t h y l s u l f o n y l o x y p r o p y l ) 4 一( 2 - m e t h y l - 3 - o x o c y c l o h e x y l ) b u t a n o a t e ) 其很有可能是r f 0 7 9 条带抗菌活性主要来源。 极性较强的正丁醇相表现出良好的菌丝抑制活性，因而对进行进一步的大孔树 脂层析分离，并结合菌丝生长抑制活性检测，实验结果显示具有真菌菌丝抑制活性 的成分集中在3 0 5 0 乙醇洗脱部分中。对大孔树脂层析分离得到的组分进行 2 0 0 n m 5 0 0 h m 的全波长扫描发现其在2 8 3 n m 处吸光度达最大值，故尝试以2 8 3 n m 为检测波长对大孔树脂洗脱组分进行了s e p h a d e xl h 2 0 凝胶层析，分离到一个组分 峰l ，通过对其进行菌丝抑制活性检测发现其具有一定的菌丝抑制活性，但是较大 孔树脂洗脱部分其活性低得多。通过对正丁醇相大孔树脂洗脱部分的g c m s 分析 发现了一些苯甲酸类的物质如三甲基硅烷2 ，4 双( - - 甲基硅氧烷基) 苯甲酸盐 ( t r i m e t h y l s i l y l2 , 4 - b i s ( t r i m e t h y l s i l y l o x y ) l b e n z o a t e ) 、3 , 4 一双( 甲氧羧基) 苯甲酸 ( 3 ，4 b i s ( m e t h o x y c a r b o n y l ) b e n z o i ca c i d ) 。由于苯甲酸及其盐类本身就是一种有效的 抗真菌药物，故推测铁钉菜正丁醇萃取相的菌丝抑制活性可能和此类物质有关。 总的来说，铁钉菜的提取物中存在着活性不错的抗菌、抑藻活性物质，通过对 它们在溶剂系统中分配情况和分离方法的研究，可以为进一步研究铁钉菜活性天然 产物提供借鉴，同时对其中一些活性组分中的主要成份的分析鉴定可以为进一步寻 找相关活性的天然产物及化学修饰合成新的药物提供参考资料。 摘要 a b s t r a c t a b s t r a c t ：i nt h i ss t u d y , t h ex s h i g eo k a m u r a ew e r ee x t r a c t e db ye t h a n o la n de t h e rt og e t c r u d ee s t r a c t s c r u d ee x t r a c t sw e r ee x t r a c t e di nt u r nw i mt h ep e t r o l e u me t h e r , c h l o r o f o r m ， e t h y la c e t a t e ，n - b u t a n o lt og e td i f f e r e n te x t r a c t i v ef r a c t i o n s t h ed i f f e r e n te x t r a c t i v e f r a c t i o n sw e r ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nb ya p p r o p r i a t ew a y , f o re x a m p l et h es i l i c ag e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , m a c r o p o r o u s - r e s i nc h r o m a t o g r a p h y a n dt h es e p h a d e x l h 2 0g e lc h r o m a t o g r a p h y s e v e r a lc o m p o n e n t sw e r eg o tf r o mt h e e x t r a c t i v ef r a c t i o n s t h e s ec o m p o n e n t sw e r et e s t e df o rt h e i ra n t i b i o t i ca c t i v i t i e sa g a i n s t s o m ef u n g i ，b a c t e r i aa n da l g a e ，e v e n t u a l l ys o m ea n t i b i o t i cc o m p o n e n t sw e r ef o u n d t h e c o m p o n e n ti s 3 1a n di s 4s h o w e ds t r o n gr e s i s t a n c et ot h eg r o w t ho fa l a g e ，w h i c ht h e7 2 h e c s 0t og l o b o s ar e s p e c t i v e l yu pt o51 5 m # la n d5 9 3 r a g l ；t h er f 0 7 9t l cf r a c t i o n f r o mc h l o r o f o r me x t r a c th a ss t r o n gi n h i b i t o r ya c t i v i t yt ob a c t e r i a , g c - m sa n a l y s i s s h o w e dt h a tt h em a i na c t i v ei n g r e d i e n to fr f 0 7 9f r a c t i o na sp o s s i b l ei s ( 2 ，2 一d i m e t h y l - 3 - m e t h y l s u l f o n y l o x y p r o p y l ) - 4 - ( 2 一m e t h y l - 3 - o x o c y c l o h e x y l ) b u t a n o a t e ；t h en - b u t a n o le x t r a c t o fl s h i g eo k a m u r a ey e n d ow a sc h r o m a t o g r a p h yi nm a c r o p o r o u sr e s i na n dt h e3 0 - 5 0 e t h a n o le l u a t es h o w e dg o o di n h i b i t o r ya c t i v i t yt ot h eg r o w t ho fs o m ep l a n tp a t h o g e n i c f u n g ih y p h a k e y w o r d s ：i s h i g eo k a m u r a e ；a n t i a l g a e ；a n t i b a c t e r i a l ；a n t i f u n g a l ；a c t i v i t yc o m p o e n t s h i 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)韭迪学号至q q 鱼q 皇墨窒专业植物堂：所呈交 的学位论文( 论文题目：铁钉菜抗菌和抑藻活活性物的研究) 是本人在 导师指导下，独立进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除论 文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研究工作做出贡献的个人 或集体，均己在论文中作了明确说明并表示谢意，由此产生的一切法律 结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 指导教师签名： 抑? 乞 签字胁砷年么月夕日 绪论 绪论 海洋是孕育地球生命的摇篮，海洋占地球表面积的7 1 ，其中生活着2 0 多万种 的生物，其生物量占地球生物总量的比重达到了8 7 ，长期以来人类一直在广泛地 开发陆生动植物天然活性产物并取得了丰硕的成果，极大了改善了人们的生产和生 活。海洋物种繁多是地球上最大的资源能源宝库，目前为止人们对海洋生物的认识 和开发仍相当有限，利用率仅为1 左右，用于研究的海洋生物仅几千种，但是对海 洋天然产物的初步开发已经给人类带来了1 万多种的海洋天然产物，而且其中许多具 有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、止血等药理活性。虽然与来源陆生植物的1 5 万多种天然 产物相比并不海洋天然产物的成果还不那么的丰硕，但是从从资源研究的角度上看 海洋应当是天然产物开发的最大库源，蕴含着巨大的开发潜力。 由于海洋环境高盐度、低温差、高压力的特点使得许多生活于海洋环境中的生 物体内具有不同于陆生生物的活性物质，目前在国外已报道的30 0 0 种海洋生物化合 物中，就发现近5 0 是陆地生物所未见的或差异很大的天然产物，其中一些来源于 高温，高压或低温的极端环境中的海洋生物天然产物更是具有一些非常独特的功能。 海洋天然产物的特异结构和药理作用是陆源生物所无法比拟的海洋药物具有显著 的药理稳定性和强效性，毒副作用相对较小，对防治癌症、艾滋病、心脑血管病、 老年病等疑难病症具有独特效应，已成为开发新药、特药的主要方向之一。 目前对国内外所研究海洋天然产物按其化学类型可将它们归为甾醇、萜类、皂 甙、聚醚大环内酯、脂肪酸、多糖、烃类、类胡萝素类、生物碱、氨基酸、多肽、 蛋白质等化合物类型。活性研究则囊括了抗菌、抑制藻、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、 免疫增强或抑制、抗心脑血管疾病等生物学活性研究领域。国内外已获得应用的研 究成果主要有角鳖烯、海星代血浆、刺参粘多糖、喹啉酮、藻酸双脂钠p s s 等。 海藻( a l g a e 或s e a w e e d s ) 是海洋生物资源的重要组成部分，估计全世界海洋中生 长有1 5 0 0 0 余种海藻。自8 0 年代以来，从海藻中发现了许多具有活性的新化合物在 海藻中所发现的这些活性物质，在抗病毒，抗菌、抗肿瘤方面显示出很大的潜力。 例如：d o n a l d 从海藻p c a r t i l a g i n o u m 分离得到具有广谱抗菌活性的4 种环状多卤 单萜化合物n 1 ；还有从钝型凹顶藻l a u r e n c i a ob t u s a 分离得到的具有抗肿瘤活性的溴 代醚类化合物u 1 ；具有抗病毒活性的硫酸多糖s a e 等。 福建师范张迪硕士学位论文 由于海藻生物活性物质对于解决人类健康问题及环境问题具有巨大的潜力和优 势，现在海藻除被用作食品工业原料、饲料和肥料以外，其药用生物活性物质越来 越受到人们的关注。海藻天然产物的研究与开发已成为了海洋天然产物研究的主要 方向之一。由于本文的研究对象就是海藻铁钉菜，因此，下文将对海藻天然产物研 究的现状做一个概述。 海藻天然产物研究现状 海藻在海洋生态系统中处于生产者和被捕食者的地位，海藻不但能够在生长过 程中富集环境中的无机物( 包括溴、碘、氯等卤素) 同时为了应对捕食者的捕食以 及其他海洋植物的竞争海藻还常常能合成出一些具有细胞毒或抗菌活性的活性物质 来保护自身。随着社会的发展和人们生活习惯的改变以及环境污染的急剧，新兴的 疾病不断出现，仅病毒病世界上每年就新增2 3 种，人类迫切的需要新的药物来解 决这些新增的疾病，然而陆生植物天然产物经过长时间的开发后资源日益减少，于 是在海藻的一些化学生态学现象启示下研究者们将搜寻的目光转向海藻天然成分， 期望从中获得新的特效药物。自6 0 年代人们提出“向海洋要药 的口号起，近4 0 年来海洋化学及海洋药物学得到了很大的发展。人们对海藻天然产物及其活性进行 深入的研究，发现了一批具有良好的抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗细菌、免疫增强 或抑制、抗氧化等功能的活性物质，其中甚至有一些已经得到了生产应用，其中有 效的抗癌新药r h i z o x i n 和抗真菌新药f u s a r i e l i n a 是两个成功的例子乜_ 3 一】。 全世界海藻约有1 5 0 0 0 余种陆1 ，迄今被人类利用的主要是红藻、褐藻和绿藻三 大类，约1 0 0 余种左右1 。目前研究的方向主要集中在筛选具有抗菌、抗肿瘤、抗 病毒、抗氧化活性物质方面，对于抑制藻、免疫调节、酶抑制等方面的研究相对较 少。研究内容上主要是集中在活性成分分离以及活性测试上。伴随着现代分析技术 及手段的发展一些先进的分离分析技术诸如超临界流体萃取技术、高速逆流色谱、 高效液相色谱技术等也被运用到海藻天然产物的研究中极大的提高了海藻天然产物 研究的工作效率。在活性测试技术方面，一些活性测试模型如k o b a y a s i 等人建立的 稻瘟霉生物监测模型口j 8 等的运用使得藻类天然活性产物的筛选更加的快速、方便 和可信。 海藻中的抗菌活性物质 目前关于海藻抗菌活性筛选的报道有很多，通过研究结果可以发现海藻的抗菌 绪论 活性顺序大致为褐藻 红藻 绿藻嘲。提取物抗菌活性较强的海藻主要集中在褐藻门 的网地藻目d i c t y o t a l e s 、墨角藻目f u c a l e s 和红藻门的仙菜目c e r a m i a l e s n 刀。近年 来，还发现海藻类提取物对耐药性细菌也具有抑菌作用。例如v a i r a p p a n 等人从红 藻属筛选出几种卤代化合物，通过对临床上2 2 株病原性细菌、7 株耐药性细菌的抑 菌试验，发现4 种倍半萜和多溴化吲哚不仅对革兰阳性细菌具有广谱抗菌性，而且 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( m r s a ) 、耐青霉素肺炎链球菌 ( p e n i c i l l i n r e s i s t a n t - s t r e p t o c o c c u sp n e o m o n i a ，p r p ) 、耐万古霉素肠球菌f e e z ) 也表现 出抑菌作用。这对于临床应用是十分有价值的n 引。 研究发现海藻中的抗菌活性物质多为结构独特的卤代化合物、胆碱、酚类、萜 烯类、多烯脂肪酸等。 卤代化合物 例如海门冬属中的具有抗菌活性的卤代甲烷，c h a r l e ss v a i r a p p a n ( 2 0 0 3 ) 从仙菜 目凹顶藻属的l a u r e n c i am a j u s c u l a d ? 分离出了两种卤化物e l a t o l 和i s o o b t u s o l ( 结构如 下图的1 、2 ) 。其中e l a t o l 显示了显著的抗三种细菌的活性n 羽。 3 a 另据报道，在d e l i s e a p u l c h r a 中分离到的一种卤代呋喃酮如下图，具有良好的 抗细菌活性，可阻止多种病原菌聚集形成菌落，将有可能用于治疗胆囊纤维化患者 肺部的铜绿假单胞菌慢性感染毛蚓。 毯f c 强 酚类化合物 从海藻分泌出的多酚类物质对微生物具有广谱抗性( 包括丝状真菌，酵母菌，细 菌，病毒等的抑制) ，并且在相应的抑制浓度下不影响动物体细胞的生。w r a t t e n 与 m a r r a y 从红藻凹顶藻属l o k a m u r a i 及三n i d i f i c a y a m a d a 中分离得到的酚类化合物 福建师范张迪硕士学位论文 l a u r i n t e r o 及其脱溴化合物就是一类酚类抗菌成分( 下图的5 、6 ) 1 7 , 1 8 o 还有从马尾 藻、红藻、绿藻中分离得到的含硫、氮的酚类高活性的抗菌物化合物马尾藻素 ( s a r g a n i n ) ，其抗菌效果胜过一些已知的抗生素如金霉素、红霉素、氯霉素等n 9 捌。 以及从圈扇藻( z d 聆刃衍v 讲p 5 f 嘲日托口) 分离得到了三种带2 0 碳骨架的间苯三酚( 如下图 的1 、2 、3 ) ，具有抗金黄色葡萄球菌和枯草芽抱杆菌活性及抑制细胞分化的细胞毒性 2 l 】 ( 。绷 c )窖箕一譬c 绪论 海藻中的抑藻活性物质 近年来，随着环境污染的加剧，以及近岸水产养殖业的迅速发展，我国赤潮的 发生呈现出“大范围、高频率、多种类、快节奏 的特点啪1 对海岸生态环境造成了 巨大的威胁，采取有效措施控制赤潮已经刻不容缓。 海洋大型海藻不仅能够净化水质减轻水体污染，在其生长过程中也能够对赤潮 微藻的生长形成长期的营养竞争从而控制赤潮微藻的生长b 们。此外，有些海藻在其 生活过程中还会对周围环境释放相生相克类的化合，从而抑制赤潮微藻的生长，即 使在海藻死亡后有些海藻其体内的一些成分释放到水体中后还能对赤潮微藻形成有 效的抑制陬钉3 。目前，大型海藻对微藻生长的抑制作用的研究大都集中在生态学层 面，即对其共生体系竞争情况的研究较多，例如王悠、俞志明等对石莼( u l v a p e r t u s a ) 、江蓠( g r a c i l a r i al e m a n e i f o 删西) 与东海原甲藻( p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e ) 、 塔马亚历山大藻( a l e x a n d u mt a m a r e n s e ) 生长的影响的研究等1 。而对海藻体内抑 藻活性物质的直接研究较少。事实上，对天然抑藻物质的研究已经十分的广泛，只 不过目前这些研究的对象主要集中在陆生植物以及一些高等的水生植物( 主要是淡 水品种) 例如对水稻、大麦秸秆的化感物质以及香蒲、水葫芦、芦苇的抑藻物质的 研究等等啪1 。利用已发展的抑藻物质研究方法对海洋生物天然产物资源库进行筛 选应当是很有发展前景和研究意义的。 南春容等研究了孔石莼水溶性抽提液对3 种赤潮藻( 赤潮异弯藻、中肋骨条藻和 塔玛亚历山大藻) 生长的影响，发现孔石莼水溶性抽提液( 1 2 5 - - - 2 1 0g l 。1 ) 对各赤 潮藻种的生长皆表现出明显的抑制效应，当孔石莼水溶性抽提液的浓度达2 1 0g l 1 时，赤潮异弯藻和中肋骨条藻被完全致死，塔玛亚历山大藻的生长受到强烈抑制。经 高温处理后的孔石莼水溶性抽提液对赤潮异弯藻和中肋骨条藻的抑制效应完全消 失，对塔玛亚历山大藻的抑制效应明显减弱m 1 。王仁君，唐学玺等人通过共培养的 方法，研究了鼠尾藻( s u r g a s s u mt h u n b e r g i i ) 培养水的过滤液、新鲜组织、干粉末、水 溶性抽提液对赤潮异弯藻( h e t e r o s i g maa k a s h i w o ) 和中肋骨条藻( s k e l e t o n e ma c o s t a t u 聊) 生长的抑制效应，并证明了抑制物质的存在，实验结果表明鼠尾藻新鲜组织、干 粉末及水溶性抽提液对赤潮异弯藻和中肋骨条藻的生长具有显著的抑制作用，且在 较高浓度下对两种赤潮微藻的生长具有致死效应h 力。 k a k i s a w a 首先对海藻中的微藻毒性物质进行了研究，他们从褐藻岗村枝管藻 c l a d o s i p h o no k a m u r a n u s 中分离得到了o e t a d e c a - l z ，9 z ，1 2 z ，1 5 z - t e t r a e n o i e a c i d 福建师范张迪硕士学位论文 ( o d t a ) 并测试了其对3 7 种微藻的抑制活性，他们发现o d t a 能够抑制包括微藻 c h a t t o n e l l am a r i n a ，c h a t t o n e l l aa n t i q u a ，h e t e r o s i g m aa k a s h i w o ，g y m n o d i n i u m n a g a s a k i e n s e ，g y m n o d i n i u ms a n g u i n e u m 在内的各种浮游藻类。他们还发现一些高不 饱和的脂肪酸例如花生四烯酸和二十碳五烯酸也有和o d t a 类似的抑制活性h 射。 1 9 9 8 年s u m k i 等人从壳状珊瑚藻l i t h o p h y l l u ms p p 中分离得到一个a l l e l o p a t h i c 物质， 该物质具有抑制赤潮异弯藻且a k u s h i w o 和褐藻皱海带l a m i n a r i ar e l i g i o s a 的游动孢 子的活性n 钔。2 0 0 0 年韩国研究者通过对韩国海岸2 8 种海藻的抑藻活性的研究发现 红藻小珊瑚藻的甲醇提取物能够强烈地抑制赤潮藻多环旋沟藻c o c h l o d i n i u m p o l y k r i k o i d e s 的生长，不但如此，就连红藻小珊瑚藻的藻体粉末在6 6 m g m l 的浓度 下对超过六种的有害微藻都有良好的抑制效果嘞1 。2 0 0 3 年，j i n 和d o n g 的研究发现 孔石莼u l v a p e r t u s a 新鲜藻体和干粉在共培养实验中都能强烈地抑制赤潮异弯藻h a k u s h i w o 莉塔玛亚历山大藻a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e 的生长瞄u 。2 0 0 5 年m o c h a m m a d a m i n a l a m s j a h 等人对日本长崎海岸的3 7 海藻的抑藻实验发现绿藻裂片石莼 ( u l v a c e a ec h l o r o p h y t a ) 的甲醇提取物对矗a k a s h i w o ，d 1 u t e u s ，gm i k i m o t o i , e a p o n i c a 四种赤潮藻表现出强烈的抑制效果啼孙。a m i n a l a m s j a h 等人通过硅胶柱层 析、o c t a d e c y l 。s 色谱、高效夜色相色谱( h p l c ) 等手段从对裂片石莼( u l v a c e a e c h l o r o p h y t a ) 的甲醇提取物分离得到了3 个具有抑藻活性的化合物并鉴定了它们的 结构h e x a d e c a - 4 ，7 ，10 ，13 - t e t r a e n o i ca c i d ( h d t a ) ，o c t a d e c a - 6 ，9 ，12 ，15 一t e t r a e n o i ca c i d ( 0 d t a ) ，和q 1 i n o l e n i ca c i d ( 下图1 、2 、3 ) 这三个化合物对赤潮藻赤潮异弯藻月： a k a s h i w o 的半致死浓度l c 5 0 分别达到了1 3 5p g m l ，o 8 3 1 _ l g m l 和1 13 i - t g m l 呻1 。 沿尸、八凡h 2 0 0 7 年m o c h a i i l i n a da 瑚i na 1 锄s j a h 等人从裂片石莼( u l v a c e a ec h l o r o p h y t a ) 分 绪论 离得到d 一亚麻仁油酸和亚麻油酸并测试了这两种化合物对6 种微藻的抑制效果，结 果发现在参与测试的藻中赤潮异湾藻胁t e r o s i g m aa k a s h i w o 对这两种化合物最敏感， 它们的半致死浓度l c 5 0 分别达到了o 5 8 “g m l 和1 9 1 1 x g m l 。而微藻g y m n o d i n i u m i m p u d i c u m 和h e t e r o c a p s ac i r c u l a r i s q u a m a 对这两种化合物则最不敏感，当这两种 化合物的浓度达到1 0 0 0 p g m l 都未对它们表现出明显毒性作用，可见这两种抑藻物质 对微藻的抑制是一种选择性抑制。研究还发现这两种油酸对鱼类、浮泳动物和哺乳 动物细胞都没有明显的毒性啤1 。 现代天然产物分离分析新技术进展 天然提取物的粗提物中的成分是极其复杂的，其中活性成分更是少量或者微量 的，这些活性分子在生物体中可能仅仅只有十万分之几或者百万分之几，并且分散 在整个组织中。如何将活性成分从化合物中提取分离出来并达到一定的纯度，进而 对其进行鉴定是天然产物研究中的关键也是核心的技术问题。 萃取、普通柱色谱、薄层层析、重结晶等这些传统的分离手段在天然产物研究 扣已有较长的应用历史，发挥了重大的作用，这些传统的分离手段虽然不及现代一 些新兴的分离方法来得高效和灵敏，但是它们作为基础的和辅助的分离手段仍然具 有十分重要的地位。随着多学科互相渗透和对浸提原理及过程研究的深入，许多诸 如超临界流体萃取技术、制备型高效液相色谱技术、高速逆流色谱技术、分子蒸馏 陵术、膜分离技术、气一质联用、核磁共振等新的提取技术不断出现，大大提高了 天然产物分离分析的工作效率啼翮。这些新技术相比传统分离技术具有高分辨率、高 效、节能和环保等优越性，显示出极大的应用前景。以下将对天然产物研究乃至生 产中新兴的应用前景广阔的分离、纯化技术进行一个简单的概述。 超临界流体萃取技术( s f e ) 超临界流体萃取技术( s f e ) 是2 0 世纪6 0 年代兴起的一种新型化合物分离技术， 2 0 世纪8 0 年代中期以来，由于具有选择分离效果较好，提取效率高、产物没有有机 溶剂残留、有利于热敏物质和易氧化物质萃取的特点，该技术逐渐被应用到天然产 物的提取与分离上并展现出良好的应用前景嘞1 。当流体的温度和压力处于它的临界 温度和临界压力以上时，称该流体处于临界状态，此状态下的流体为超临界流体 ( s u p e r c r i t i c a lf l u i d ，简称s c f ) ，超临界流体既不同于气体，也不同于液体。它的特 福建师范张迪硕士学位论文 殊性质使其在测定组分的萃取中有以下特点。首先，它具有与液体相似的密度，因 而具有与液体相似的较强的溶解能力；其次，溶质在其中扩散系数与气体相似，因 而具有传质快、提取时问短的优点，提取完全一般仅需数1 0m i n ；超临界流体的表 面张力为零，这使它很容易渗透到样品的里面，带走测定组分；超临界流体的选择 性强，通过改变萃取的条件，如温度、压力等，可以选择性地萃取某些组分；超临 界流体在通常状态下即成为气体，因此萃取后溶剂立即变为气体而逸出，容易达到 浓集的目的。以超临界流体作为萃取剂从溶液中提取被溶解的物质的过程称为超临 界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，i 简称s f e ) 睛7 1 。目前，由c 0 2 化学性质稳定， 安全无毒无味，且临界条件容易达到，能耗低易操作等优点已成为超临界流体萃取 工艺中广泛使用的环境友好型溶剂嘲1 。s f e c 0 2 己成功地从中药中提得挥发油、生 物碱、苯丙素、黄酮炎、有机酚酸、苷类、萜类以及天然色素等成分酬。 超临界二氧化碳萃取技术的特点晦8 1 1 、安全易操作，能耗低。 由于c 0 2 本身无毒，不易燃以及容易达到临界条件的特点决定了以c 0 2 为溶剂的超 临界流体萃取工艺具有安全易操作，能耗低的特点。此外，在溶剂分离与回收方面， c 0 2 超临界萃取齐i j 具有容易回收和可循环使用的特点，这又进一步降低了其使用成 本。 2 、c 0 2 超临界流体萃取兼具精馏和萃取的特点。 溶质的蒸气压、极性、分子量大小是影响溶质在超临界流体中溶解度大小的 重要因素，萃取过程中被分离物质间挥发度的差异和它们分子间作用力的大小这 两种因素同时在起作用。( 1 ) 亲脂性、低沸点的组分容易萃取( 2 ) 化合物的极性越 强越难萃取( 3 ) 化合物的分子量越大，越难萃取。( 4 ) 对对挥发度和极性差别较大 的混合物具有分馏的效果。 3 、适用于热敏性物质的分离 低的操作温度与密闭的操作系统使得c 0 2 超临界流体萃取工艺能够有效地防止 热敏成分和易氧化成分的分解与氧化。萃取过程的低温性使得一些低挥发性和易热 分解的物质能够在远低于其沸点的温度下被萃取出来，从而避免了其中某些热敏性 组分在传统的加热蒸馏中出现的分解，焦结、聚合的问题。 4 、无溶剂残留 c 0 2 超临界流体在于萃取成分分离后，便转化成为气体，完全没有溶剂的残留。 绪论 有效地避免了传统溶剂提取中有毒容积残留的问题，同时也大大地改善了提取过程 中的操作环境。 5 、极性选择范围较广 c 0 2 超临界流体的极性是可以改变的，在温度条件不变的情况下，只要改变压 力或者加入适当的夹带剂例如乙醇等，就能用于提取不同极性的物质。因此，c 0 2 超临界流体萃取的极性选择范围是十分的广泛的。 超临界c 0 2 流体萃取技术的应用 超临界c 0 2 流体萃取技术现已广泛地应用于有机化工石、医药、食品、环保以 及分析化学等领域陆引，从研究成果来看，其用于萃取分离的物质主要包括生物碱、 醌类、香豆素、黄酮类、皂苷类、多糖及挥发油等嗍。 c 0 2 超临界流体萃取技术在生物碱分离过程中，由于生物碱的极性偏大，其往 往需要加压或使用夹带剂来增加流体的溶解能力和提高其选择性嘲1 。金氏等利用超 临界c 0 2 萃取技术研究花椒中的麻味成分，实验中以乙醇作为夹带剂进行试验，能够 大幅度改变超临界流体的极性，增强其对极性成分的溶解能力，从而达到了萃取分 离花椒中麻味成分的目的呻3 。 c 0 2 超临界流体非极性溶剂的特性使得其对天然产物中的萜类和芳香族化合物 及其衍生物具有很好的溶解能力，能够进行较好的萃取【5 引。在这类成分中s p e 应用 比较成功的是青蒿素和丹参酮。何春茂等对黄花蒿中萃取青蒿素的s p e 工艺进行了 优化和研究，得到了高纯度的青蒿素产品阳。 应用c 0 2 超临界流体萃取技术提取黄酮类化合物具有速度快，收率高的优点。 例如萧效良等利用c 0 2 超临界流体萃取技术提取丹参中的活性成分，结果表明一次 提取物中的丹参酮i i 的含量大于2 0 ，水溶性有效成分含量大于3 5 ，收率是常规 提取法的两倍以上随羽。 挥发油的组分多为低沸点，易氧化物质，因此在使用传统的水蒸气蒸馏法时常 常造成这些成分的破坏，从而严重影响收率。c 0 2 超临界流体对这类低极性低沸点 低分子量的挥发性物质具有很好的溶解能力，运用c 0 2 超临界流体萃取技术提取挥 发油类物质能够有效地避免有效成分的分解和大大地提高收率嘲1 。李著等( 1 9 9 6 ) 用 超临界c 0 2 流体技术从当归中萃取分离出挥发油，并用g s m s 技术对其进行研究， 从中分离鉴定了3 8 个成分，并进行了含量测定，挥发油收率达到1 5 3 。 此外，超临界流体的特点使得其很容易与其它分析技术联用。近年来，超临界 福建师范张迪硕士学位论文 流体萃取超临界流体色谱法( s f e s f c ) 联用技木也开始应用于生物分析的领 域口副，超临界流体色谱( s f c ) 与h p l c 相比就具有分离速度快，更易除去分离产物 中溶剂，可适用于不挥发及热不稳定化合物的分离等一系列优点，与s f e 配合使用， 提取、浓缩、分离可一次性完成。因而具有更广阔的应用领域，常可替代气相色谱 ( g c ) 和i - i p l c ，有报道综述了s f c 在天然产物分离中的应用，国内也有这方面的 报道。 高效逆流色谱 逆流色谱( c c u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称c c c ) 是利用溶质在两种互不相 溶的溶剂中的分配系数不同，将不同溶质分离的液一液分离方法。高速逆流色谱 阻i g hs p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称h s c c c ) 是国际上于上世纪8 0 年代 以来在液一液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，其分离原理是利用螺旋柱 在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，达到 稳定的流体动力学平衡态，同时保留其中的一相( 固定相) ，利用恒流泵连续输入另 一相( 流动相) ，流动相载着溶质( 样品) 进入螺旋柱并不断反复穿过固定相，流动相不 断地穿过固定相，使样品在两相之问也不断反复地进行分配，由于样品中各组分在 两相中分配系数不同，导致在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品各组分按分 配系数的次序，依次得到分离临删。 目前，高速逆流色谱已经广泛地应用于于生化、生物工程、医药学、天然产物 化学、有机合成、化工、环境分析、农业、食品、地质、材料等领域，国际上有数 十个国家及地区的著名研究机构和大学在从事逆流色谱技术的研究及在各个领域的 应用工作。其中包括美国n i h ，英国b r u n e l 大学，瑞士l a u s a n n e 大学，法国l y o n 大学 等。i 刍2 0 0 0 年9 月起国际逆流研究领域每隔2 年举行一次世界逆流色谱学术会议 慨州。我国高速逆流色谱技术在的应用较早，技术水平在国际领域也处于领先地位。 目前，我国是世界上为数不多的高速逆流色谱仪生产国之一。我国的深圳同田生化 技术有限公司是全球第一家多分离柱高速逆流色谱仪专业生产企业旧1 。 高速逆流色谱的特点 高速逆流色谱技术的特点有以下几点嘲6 羽： ( 1 ) 操作简单易行，h s c c c 无需对样品进行复杂的处理，粗样可直接上样而不 会对柱子造成任何损害。出峰可以在线检测，且可以和灵敏度高的检测技术联用， 方便快捷准确。 绪论 ( 2 ) 应用范围很广：h s c c c 中使用的两相溶剂体系组成可以是任意的，因而从理 论上讲h s c c c 可以适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合具有广 阔的应用前景。 ( 3 ) 无需固体载体：由于不使用周体载体所以不会出现吸附、污染、峰形拖尾以 及样品损失等现象。因此h s c c c 在经过多次重复分离均可以实现较好的重现性以及 得到较高的回收率。 ( 4 ) 产品纯度高：它的分离效率高，可以达到几千个理论塔板数，尤其在天然产 物组分分离提取中有较高的分离度，有的样品经过一次分离就可以得到一个甚至多 个单体。只要选择正确的溶剂体系，可以将样品分离后得到高于9 0 纯度的产品。 ( 5 ) 上样量大适用于制备型分离。高速逆流色谱仪它的进样量大，可以从毫克到 克量级，一次进样量可以达到几十毫升，这对于样品的制备纯化显示出很大的优势。 高速逆流色谱在天然产物研究中的应用 高速逆流色谱用从1 9 8 5 年于天然药物化学成分的分离以来已取得了丰硕的研究 成果。目前，高速逆流色谱法主要应用在提取分离天然产物中的黄酮、生物碱、香 豆素、萜类、皂苷、多酚类和葸醌类衍生物等有效成分，并取得了满意效果。简 要概况如下： 生物碱类：生物碱是植物中一类重要的天然含氮化合物，在植物中分布非常广 泛，对疾病治理和药物发展等具有重要作用。n o 于1 9 9 4 年用新型的p h 区带提取逆 流色谱技术从植物c r i n u mm o o r c s 的抽取物中得到了3 个纯的生物碱，此技术是高速 逆流色谱的一个较大的突破，它使植物的分离提取每次很方便地就达到了克量级们； 陈建华等利用高速逆流色谱技术，以正己烷正丁醇水( 4 ：1 ：5 ) 溶剂系统，在6 h 内从中国特有植物千层塔( 蛇足石杉) 中分离到八个有效成分部位，值得一提的是中 国独创的世界级新药石杉碱甲就是其中一个组分口们；此外研究者通过应用高速逆流 色谱技术分离了茶叶( 咖啡碱和茶碱) 、贝母( 贝母素甲和贝母素乙) 、附子( 1 5 a - 羟基 新乌碱) 、黄柏( 小檗碱和巴马亭) 、金果橄( 巴马亭) 、苦参、青叶胆( 龙胆碱) 和红豆杉 ( 紫杉醇) 、黄连( 巴马亭、小劈柴、表小劈柴和黄连碱) 、洋金花( 莨菪碱、东莨 菪碱) 、从峨眉千里光( 金缘千里光碱、阔叶千里光碱和新阔叶千里光碱) 等植物中 的生物碱m 侧。 黄酮类：黄酮类化合物是一类比较重要植物化学成分，黄酮类分离制备方面也 开始采用高速逆流色谱法去解决一些比较难得到的组分。如蔡定国等9 0 分钟内进样 福建师范张迪硕士学位论文 2 m l ，完成3 个单体的分离，得到异鼠李素约3 m g ，山奈酚约7 m g 和槲皮素约1 0 m g ， t l c 鉴定为单一斑点，唧l c 测定3 种单体含量均在9 8 以上，填补了国内此三种对 照品的空白口9 1 。陈四平等用氯仿甲醇水( 4 ：3 ：2 )