（口腔医学专业论文）抑癌基因pten在口腔鳞状细胞癌及癌前病变中表达的研究.pdf

中国协和医科大学硕士研究生学位论文 摘要 抑癌基因p t e n 在口腔鳞状细胞癌 及癌前病变中表达的研究 p t e n ( 蛋白酪氨酸磷酸酶基因) 是近年发现的抑癌基因。作为后p 5 3 时 代突变率最高的抑癌基因，p t e n 是通过调控p i p 3 a k t 信号通路抑制细胞周 期进程及促进凋亡，从而抑制细胞生长。其在细胞凋亡、细胞周期停滞、细胞 粘附、移动和分化等诸多方面起重要作用。迄今为止，p t e n 基因在口腔粘膜 组织中的表达特点及其与口腔鳞状细胞癌的发生、发展的关系尚不清楚，国内 尚未见此方面的报道。 月谚：。、研究p t e n 和p 5 3 蛋白在e l 腔鳞状细胞癌及癌前病变中的表达及 其与临床病理特征的关系和对预后的影响。了解p t e n 在口腔鳞状细胞癌的发 生、发展中的作用。通过与p 5 3 基因表达的比较，了解p t e n 基因在口腔癌中 的地位、作用。 材料和方法：采用我院口腔颌面外科1 9 8 8 2 0 0 0 年口腔鳞状细胞癌4 6 例、正常口腔粘膜组织4 0 例、口腔扁平苔癣1 4 例、口腔白斑2 0 例，手术石 蜡标本切片后，用免疫组织化学法对p t e n 和p 5 3 蛋白表达水平进行检测及半 定量分析；并回顾临床病理资料。 结果：p t e n 蛋白表达阳性率在正常口腔粘膜组织中为7 2 5 ( 2 9 ，4 0 ) 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 口腔鳞状细胞癌组织中为1 9 5 7 ( 9 4 6 ) 口腔白斑病变中为4 5 0 0 ( 9 2 0 ) 口腔扁平苔癣病变中为5 7 1 4 ( 8 1 4 ) 。正常口腔粘膜组织中p t e n 蛋白表达 水平显著高于口腔鳞状细胞癌组织，经卡方检验差异有非常显著的统计学意义 ( p 0 0 1 ) ；1 3 腔鳞状细胞癌组织中p t e n 蛋白染色水平较之自身癌旁组织显 著下降( p 0 0 1 ) 。正常口腔粘膜组织中p t e n 蛋白表达水平高于口腔白斑和 口腔扁平苔癣组织，差异有显著性统计学意义( p o 0 1 ；p 0 0 5 ) 。正常口腔 粘膜组织中p 5 3 蛋白表达水平显著低于口腔鳞状细胞癌及口腔白斑、口腔扁平 苔癣组织( p o 0 1 ) 。分析临床病理资料发现，p t e n 蛋白表达阳性率与患者年 龄、性别、病变部位、临床分期及肿瘤复发无明显关系；癌分化程度高、不伴 颈淋巴结转移及生存期长的病例中p t e n 蛋白表达阳性率较高。p 5 3 蛋白在病 变分化程度低及临床分期较晚的病例中表达水平较高( p o 0 5 ) 。此外发现， 肿瘤分化程度低的病例中颈淋巴结转移率较高。合并颈淋巴结转移的病例生存 期限显著缩短( p 0 0 5 ) 。 结论：口腔癌前病变及口腔鳞状细胞癌的发生发展与p t e n 蚩臼表达水半 jfj：j劝一 降低有密切关系；p t e n 基因的表达在口腔鳞状细胞癌的发生中起重要作用， 且在病变早期阶段即已发挥作用。p t e n 蛋白的高表达可能与口腔鳞状细胞癌 、t p 、， r 1 ，譬 较￥饷垧床分期f 较少颈淋巴结转移及患者较长的生存期相关。p 5 3 在1 3 腔鳞 状细胞癌的发生、发展过程中发挥重要作用，其在预测口腔鳞状细胞癌患者预 后方面的价值可能不大。p t e n 与p 5 3 的表达存在一定的负相关趋势。在诸多 影响因素中颈淋巴结转移是降低口腔鳞状细胞癌患者生存期的重要因素。此外 中国协和医科火学硕士研究生学位论文 肿瘤分化程度可能影响患者生存期限。 关键词：旦e n 旦旦口_ 壁默细胞癌，瘴剪病变，癌前状态，抑癌基因， 免疫组织化学 _ _ _ _ _ _ h _ _ - _ - 一一 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t s t u d y o f e x p r e s s s i o n o fp t e n p r o t e i n i no r a ls q u a m o u s c e l lc a r c i n o m aa n dp r e c a n c e r o u sl e s i o n p t e n ( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i o nh o m o l o g u ed e l e t e d o nc h r o m o s o m e 10 ) g e n ei sat u m o rs u p p r e s s o rg e n et h a tf o u n d e dr e c e n t l y p u r p o s e ：t o s t u d yt h ee x p r e s s i o no fp t e np r o t e i n i no r a ln o r m a lm u c e s a ，p r e c e n c e m u s l e s i o na n d s q u a m o u s c e l lc a r c i n o m a ；a n dt oi n d i c a t et h es i g n i f i c a n c eo fp t e n i n v o l v e di nt h ee v o l u t i o no fo r a ls q u a m o u sc a l lc a r c i n o m a m e t h o d s ：f o u r g r o u p s o fp a r a f f i ne m b e d e ds p e c i m e na r ei n v o l v e di no u rs t u d y , w h i c hi n c l u d e 4 0n o r m a lo r a le p i t h e l i a l ，4 6o r a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，2 0o r a ll e u k o p l a k i a a n d1 4o r a ll i c h e np l a n u s t h ee x p r e s s i o no fp t e nw a so b s e r v e di na l lt h e s e s p e c i m e nb yi m m n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gm e t h o d ，a n dc o m p a r et h er e s u l t w i t ht h a to fp 5 3p r o t e i n r e s u l t s ：p t e ne x p r e s s i o nw a sl o c a t e di n7 2 5 ( 2 9 4 0 ) n o r m a lo r a le p i t h e l i a l ，1 9 5 7 ( 9 4 6 ) o r a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a 4 5 0 0 ( 9 2 0 ) o r a ll e u k o p l a k i aa n d5 7 1 4 ( 8 1 4 ) o r a ll i c h e np l a n u s t h e m i sas i g n i f i c a n tl o w e rp e r c e n t a g eo fp t e np r o t e i ni m m u n o r e a c t i v i t yi no r a s q u a m o u sc a l lc a r c i n o m aa n dp r e c a n c e r o u sl e s i o nt h a nt h a ti n m o r r n a lo r a e p i t h e l i a l ( p 0 0 1 ：p 0 0 5 ) 。s i m i l a r l y , t h e r ei sas i g n i f i c a n th i g h e rp e r c e n t a g e 6 一 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 o f p 5 3p r o t e i n i m m u n o r e a c t i v i t y i no r a l s q u a m o u s c e l lc a r c i n o m aa n d p r e c a n c e r o u s l e s i o nt h a nt h a t i nm o r m a lo r a l e p i t h e l i a l ( p 2 0 ， 5 0 ) 细胞核内可见棕黄色染色， 染色深。 蛋白染色级别的判定由病理科高年医师协助完成。 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 6 常规h e 染色方法( 略) 7 统计方法： 应用s s p s l 0 0 统计软件，对p t e n 及p 5 3 在正常口腔粘膜组织、1 7 1 腔 鳞状细胞癌及口腔粘膜癌前病变组织中表达水平进行卡方检验，考虑到口腔癌 前病变病例较少，统计中进行了校正。口腔鳞状细胞癌组织中p t e n 表达水平 与临床病理指标的关系采用费歇尔精确概率检验。生存检验采用k a p l a n m e i e r 法。 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 结果 1 p t e n 蛋白阳性表达表现 绝大多数棕黄色染色颗粒出现在上皮细胞细胞质内，颗粒染色强弱均匀。 极少数标本同时在细胞核中出现不均质的棕黄色染色，无明显颗粒。典型染色 细胞集中在表皮基底层。p t e n 表达表现为上皮基底层散在细胞、连续成片上 皮基底层的细胞或大量上皮细胞细胞质内棕黄色染色，颗粒染色明显，染色强 弱程度不同，与染色细胞数量正相关。上皮全层均可着色。上皮下腺体中腺泡 细胞不染色；导管细胞细胞质棕黄色染色，无明显颗粒。血管壁弹力纤维染色 深，血管内皮细胞染色中等强度。 2 p t e n 蛋白在正常口腔粘膜组织中的表达 2 1 正常口腔粘膜组织中p t e n 表达特点 正常口腔粘膜中p t e n 蛋白染色阳性表现为上皮基底层散在或连续成片细 胞或大量上皮细胞细胞质内棕黄色染色，颗粒染色明显，染色强弱程度分不同 等级，与染色细胞数量正相关。部分标本中p t e n 染色细胞遍布上皮全层，棘 层和角化层均可见阳性细胞广泛分布。可见染色颗粒，染色强度中等。 达 2 2 正常口腔粘膜和口腔鳞状细胞癌患者相对正常的口腔粘膜中p t e n 的表 4 0 例正常粘膜组织中9 例( 2 2 5 ) p t e n 蛋白染色强阳性；1 5 例( 3 7 5 ) p t e n 蛋白染色阳性；5 例( 1 2 5 ) p t e n 蛋白染色弱阳性；1 1 例( 2 7 5 ) 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 p t e n 蛋白染色缺失。总阳性率为7 2 5 ( 2 9 4 0 ) 。 分析正常口腔粘膜和口腔鳞状细胞癌患者相对正常的口腔粘膜中p t e n 表 达结果，经检验差异无统计学意义( p = 0 7 1 5 ) ，既二者有差异的可能性 0 0 5 ) ，年龄 6 0 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 岁组患者p t e n 表达阳性率高于年龄6 0 岁组患者，差别有统计学意义 ( p = 0 0 4 3 ) 。 表4不同年龄、性别病例p t e n 表达结果( 例) 3 p t e n 在口腔鳞状细胞癌组织中的表达 4 6 例口腔鳞状细胞癌组织中3 例( 6 5 2 ) p t e n 蛋白染色强阳性；5 例 ( 1 0 8 7 ) p t e n 蛋白染色阳性；1 例( 2 仃) p t e n 蛋白染色弱阳性： 3 7 例( 8 0 4 3 ) p t e n 蛋白染色阴性。总阳性率为1 9 6 ( 9 4 6 ) 。 比较3 0 例口腔鳞状细胞癌组织与相应相对正常口腔粘膜组织中的p t e n 表达水平，发现1 6 例患者口腔鳞状细胞癌病变内p t e n 蛋白免疫组化染色减 弱或缺失。将免疫组化染色级别转换为数字分级，口腔鳞状细胞癌病变内p t e n 蛋白免疫组化染色级别与本人癌旁组织比较，经配对t 检验证实口腔鳞状细胞 癌病变内p t e n 蛋白免疫组化染色较之本人癌旁组织染色减弱，差别有显著统 计学意义( p 00 5 2 5 11110605p 00 5 1 42 9 9 3 0 7 7 2 6 6 2p 00 5 3 3 3 3 0 2 6 6 7 0 1 6 6 7 1 05 0 0 3 07 7 3 33 3 3 04 3 4 0 0 0 4 2 1 2 2 5 1 4 2 9 3 8 1 0 高分化+ 中分 化病倒与低分 化病例比较 1 6 1 9 i 期+ i i 期病例 与期+ i v 期 病例比较： p 00 5 26 6 9 p 0 0 5 p 00 5 p o0 5 p 00 5 口腔鳞状细胞癌组织中不同年龄、性别、部位等一般临床指标间p t e n 蛋 白染色水平差异无显著统计学意义。高分化癌、不伴颈淋巴结转移及生存时间 较长的病例中p t e n 蛋白表达水平较高。但差异未达到统计学意义。 k a p l a n m e i e r 法分析p t e n 蛋白染色水平与患者生存时间的关系，p t e n ( + ) 组患者平均生存时间为8 6 个月，p t e n ( - ) 组患者平均生存时间为6 0 5 6 个月。经l o gr a n k 和b r e s l o w 检验p t e n 蛋白染色阳性患者生存时间比阴 2 4 中国协和医科人学硕 ：研究生学位论文 性患者长，差异未达到统计学意义( l o gr a n k 和b r e s l o w 检验p 值均 0 0 5 ) 。 具体如下： p t e n ( ) 组 s u r v i v a i1 1 m es t a n d a r de r r o r9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l mean：860 01 25 8( 6 13 4 ，1 1 06 6 ) p t e n ( + ) 组 s u r v i v a lt i m es t a n d a r de r r o r9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a i m e a n ：6 05 64 2 5(5 22 4 6 88 9 ) ( l i m i t e d t o 8 20 0 ) m e d i a n ：6 00 0( ，) s l a “s l i cd f s i g n i f i c a n c e l o g r a n k 7 713 8 0 1 b r e s l o w8 713 5 0 3 p t e n 表达水平与预后的关系 数摧 ( 注：本实验首先目的是了解p t e n 基因在正常组织与口腔鳞状细胞癌中 的表达水平有无差别、p t e n 异常表达是否在口腔鳞状细胞癌的发生中起作用。 若得到阳性结果，即p t e n 异常表达在口腔鳞状细胞癌的发生中确实起作用 则进一步研究p t e n 异常表达与复发、转移、预后等临床指标的联系。由于本 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 院多为外地患者，失访率较高( 1 9 4 6 ) 。因此对随访的2 7 例病例进行p t e n 异常表达与复发、颈淋巴结转移、预后等临床指标联系的分析，采用费歇尔精 确概率法检验。) 4 p t e n 在口腔粘膜白斑及扁平苔癣组织中的表达 2 0 例口腔白斑病变组织中3 例p t e n 蛋白染色阳性；6 例p t e n 蛋白染 色弱阳性；1 1 例p t e n 蛋白染色缺失( - ) 。总阳性率为9 2 0 ( 4 5 0 0 ) 。有 上皮不典型增生的病例p t e n 蛋白染色除1 例为弱阳性外均缺失，较之无上皮 不典型增生的病例p t e n 蛋白染色阳性率明显降低，但此差异无显著统计学意 义( p 0 0 5 ) 。 1 4 例口腔扁平苔癣病变组织中8 例p t e n 蛋白染色弱阳性；6 例p t e n 蛋白染色缺失( ) 。总阳性率为8 1 4 ( 5 7 1 4 ) 。 5 p t e n 蛋白在口腔粘膜不同病变组织中表达的比较 口腔鳞状细胞瘸组织中p t e n 蛋白染色水平显著低于正常口腔粘膜，经x 2 检验，差异有非常显著的统计学意义( p 值 0 们) 。口腔粘膜白斑和口腔扁平 苔癣中p t e n 蛋白染色水平也显著低于正常口腔粘膜，差异亦有显著的统计学 意义( p 值 0 0 5 分化程度 唇 舌 牙龈 颊 晨 高分化 1 1 中分化! 低分化 幅床分期 i 期 期 m i 期 i v 期 - + 颈淋巴结转移 1 0 2 3 2 8 3 8 + 3 2 1 3 1 2 1 2 6 4 1 6 0 4 1 5 0 4 1 1 1 0 1 6 2 6 2 8 7 7 1 5 4 5 4 8 0 0 0 6 6 6 7 1 0 0 1 2 1 8 2p o 0 5 6 3 3 3 1 0 0 8 3 3 3 9 47 4 6 0 5 3 ：8 5 6 6 6 7 7 0 0 0 7 14 2 6 8 4 2 7 50 0 高分化病倒与 中分化+ 低分 化病倒比较 5 0 0 7 i 期+ i i 期病例 与川期+ i v 期 病例比较： 4 8 0 4 p 0 0 5 生存 5 年 31118 3 3 3 5 毒8 2476667po0 5 p 5 3 表达水平与性别、年龄、病变部位、复发与否、颈淋巴结转移与否及 生存时间无显著性联系。肿瘤高分化病例与中、低分化病例比较，其p 5 3 蛋白 染色阳性率明显低于后者，差异有显著统计学意义( p = o 0 2 5 ) 。i 、期口腔鳞 状细胞癌p 5 3 蛋白染色阳性率高于、l v 期口腔鳞状细胞癌病例，差异有显著 统计学意义( p = o 0 2 8 ) 。 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 8 p 5 3 在口腔癌前病变组织中的表达 2 0 例口腔白斑病变组织中6 例p 5 3 蛋白染色强阳性；2 例p 5 3 蛋白染色 阳性；2 例p 5 3 蛋白染色弱阳性；1 0 例p 5 3 蛋白染色缺失( 一) 。总阳性率为5 0 0 0 ( 1 0 2 0 ) 。其中上皮有不典型增生的病例p 5 3 蛋白表达阳性率达1 0 0 ( 6 6 ) p 5 3 蛋白染色阳性，高于无上皮不典型增生的病例p 5 3 蛋白染色阳性率，经费 歇尔精确概率检验，差异有统计学意义( p c 0 0 5 ) 。 1 4 例1 3 腔扁平苔癣病变组织中3 例p 5 3 蛋白染色强阳性；4 例p 5 3 蛋白 染色中阳性；1 例p 5 3 蛋白染色弱阳性；6 例p 5 3 蛋白染色缺失( - ) 。总阳性 率为5 7 1 4 ( 8 1 1 4 ) 。 9 p 5 3 蛋白在口腔粘膜不同病变组织中的表达水平的比较 口腔鳞状细胞癌组织中p 5 3 蛋白染色水平明显高于正常1 3 腔粘膜，经x2 检 验，差异有非常显著的统计学意义( p 值0 0 1 ) 。口腔粘膜自斑和口腔扁平苔 癣中p t e n 蛋白染色水平也明显高于正常口腔粘膜中，差异亦有有非常显著的 统计学意义( p 值 o 0 1 ) 。 表9口腔粘膜不同病变组织中p 5 3 蛋白的表达( 例) 1 0 其他临床病理指标之间及与预后的关系 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 不同临床分期、病变不同分化程度及不同肿瘤直径间口腔鳞状细胞癌的复 发率及颈淋巴结转移率差异未达统计学意义。其中，随分化程度降低，口腔癌 颈淋巴结转移率趋向提高，p 值趋近0 0 5 。 表1 0 临床病理指标与口腔鳞状细胞癌复发、颈淋巴结转移的关系( 例) + p 值 + p 值 表1 1 临床病理指标与i = 1 腔鳞状细胞癌患者生存时间的关系( 例) 随癌细胞分化程度降低，口腔鳞状细胞癌患者5 年生存率表现下降趋势 p 值趋近0 0 5 。不同临床分期及不同肿瘤直径间患者5 年生存率差异不显著。 中国协和医科大学硕士研究生学位论文 复发、颈淋巴结转移的患者5 年生存率呈下降趋势，其中有肿瘤颈淋巴结转移 患者5 年生存率显著下降，差异有统计学意义( p 6 0 岁的病例中p t e n 染色阳性 率高于年龄6 0 岁的病例。但考虑到p 值= 0 0 4 3 ，接近临界值，且在口腔鳞状 细胞癌p t e n 蛋白染色的结果中未发现同样的差异。亦有文献曾报道，发现 p t e n 蛋白在年龄 5 0 岁的病例中表达水平明显较高。结果可能与不同研究的 抽样误差有关。因此考虑虽然本研究中年龄因素对p t e n 蛋白表达的影响有统 计学意义，但可能不具有实际意义。 _ _ _ _ ，一一 中国协和医科大学硕上研究生学位论文 本实验观察到4 0 例正常口腔粘膜组织中1 1 例p t e n 染色阴性。除了p t e n 表达在不同组织、器官中有一定选择性外，对其表达阴性可能有多种解释： 首先，p t e n 蛋白表达有个体差异，而由于检测方法所限，p t e n 蛋白免 疫组化染色呈阳性表现需蛋白聚集浓度达到一定水平，因此可能有部分病例因 未达到相应浓度从而染色未达可观察到的深度。其次，p t e n 蛋白在标本中的 稳定性以及翻译后调控、蛋白降解可能影响p t e n 蛋白的完整性，造成检出困 难。标本存放时间可能也影响抗原、抗体结合反应。当然在临床实用中病例标 本得到迅速检测，可以避免此影响。再次，本实验采用p t e n 单克隆抗体，较 之既往文献