（植物学专业论文）杜塘水库浮游藻类群落特征及微囊藻的分离培养.pdf

摘要 中文摘要 本研究在2 0 0 8 年3 月至2 0 0 9 年2 月期间对漳州杜塘水库浮游藻类组成与数量 进行调查和统计。杜塘水库浮游藻类春季以硅藻为主，夏季以绿藻为主，而秋冬季 又以硅藻为主，总体浮游藻类的群落结构为代表中营养型的蓝藻、绿藻、硅藻和鼓 藻型特征。细胞密度结果显示杜塘水库水质处于贫中营养和中营养水平之间；多样 性指数和藻类群体组成分析表明杜塘水库属于1 3 一中污染带。同时通过在2 0 0 8 年 监测水体的基本水质参数，d o 、c o d m n 、b o d 5 的监测结果符合地表水环境质量标 准( o b 3 8 3 8 - - 2 0 0 2 ) 的i 类标准，综合叶绿素a 、氨氮含量、总磷、总氮含量 等指标显示杜塘水库水质里中一富营养化水平，然而营养状态综合指数t s i m 值为 5 5 1 1 ，水质已达到富营养型水平。综合浮游藻类与水质参数结果分析杜塘水库水质 营养水平应在中一富营养程度，有向富营养化转化暴发水华的潜力。另外，以标准藻 种蛋白核小球藻作为试验藻种，对杜塘水库水样进行藻类增长潜力试验，试验结果 表明n 营养盐是该藻增长的刺激因子。 本论文还对杜塘水库微囊藻属种类进行研究，鉴定出包括挪氏微囊藻、惠氏微 囊藻、假丝微囊藻、坚实微囊藻及史密斯微囊藻在内的5 种微囊藻。对监测期间常 见的挪氏微囊藻进行分离纯化以及鉴定并对影响其生长的环境因子进行初步研究： 分离成功的微囊藻初步鉴定为挪氏微囊藻( m i c r o c y s t i sn o v a c e k i is t r a i nd u t a n g ) ，其 生长曲线符合典型的s 型单细胞藻类生长曲线，细胞平均生长速率常数k 为0 5 0 8 ， 细胞平均倍增时间为4 7 h 。该株挪氏微囊藻i t s 序列长度约为4 6 0 5 0 0 b p ，m c y b 序 列p c r 检测结果为阴性，为不产毒的藻株。该藻在实验室培养的最适条件为：2 5 3 0 、初始p h 9 5 、2 0 0 0 3 0 0 0 1 u x 、1 3 7 5 m g l 氮浓度、5 4 m g l 磷浓度。 关键词：漳州杜塘水库浮游藻类水质评价挪氏微囊藻环境因子 中文文摘 中文文摘 杜塘水库位于福建省漳州市云霄县境内，建成于1 9 5 8 年，水库集水区面积约为 2 4 2 1 k m 2 ，实际库容为1 2 7 x 1 0 7 m 3 ，水面面积约0 9 k i n 2 ，最大水深约3 0 m ，平均水 深1 4 m ，是东山县及邻近的常山经济开发区等乡镇的主要饮用水源，年供水量约 1 2 5 5 x 1 0 1 m 3 ，供水人口2 4 1 万人。2 0 0 7 年9 、1 0 月份，杜塘水库发生大面积水华， 水库表层水体呈现浓绿色，局部水面形成粘液状粘稠物质，直接威胁到当地居民的 生活饮用水安全，引起了省市有关部门的高度重视。杜塘水库自建库以来未对浮游 藻类进行过长期的跟踪研究，本文通过对杜塘水库浮游藻类的种类组成和种群数量 的定性和定量分析，并结合水质指标对水质进行初步评价，另外还对杜塘水库水样 进行藻类增长潜力测试，由之确定其主要的限制或刺激藻类生长的营养物质，了解 水体的营养状态，以期为杜塘水库水体富营养化的防治及分析水华成因提供重要的 参考资料。同时，由于杜塘水库的水华优势种为微囊藻，所以对杜塘水库微囊藻属 的种类的监测和研究对水体水华的成因分析和防治具有重要意义。本课题在监测期 间对杜塘水库微囊藻属的种类组成进行研究，并对监测过程中较常见的微囊藻进行 分离纯化，对其生长特性进行初步的研究，并采用分子生物学方法初步对其产毒性 进行研究，同时本课题还研究了主要的环境因子温度、初始p h 值、光照强度、 氮磷营养盐对其生长的影响。 浮游藻类调查结果表明杜塘水库浮游藻类春季以硅藻为主，夏季以绿藻为主， 而秋冬季以硅藻为主，总体浮游藻类的群落结构为代表中营养型的蓝藻、绿藻、硅 藻和鼓藻型。藻类细胞密度全年在0 3 7 1 0 4 + m e 和1 9 3 1 0 4 个m l 之间，总体 结果显示杜塘水库水质处于贫中营养和中营养水平之间；生物的多样性指数能反应 出不同环境下浮游藻类个体分布丰度和水体污染程度，指数越小，水质污染程度越 大。通过计算s h a n n o n - w e a v e r 多样性指数假7 ) 和m a r g a l e f 多样性指数( d ) ，多 样性指数轻污染寡污到1 3 中污，综合多样性指数和藻类群体组成分析表明杜塘水 库属于1 3 中污染带。同时通过在2 0 0 8 年监测水体的基本水质参数，d o 、c o d m b 、 b o d 5 的监测结果符合地表水环境质量标准( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) 的i i i 类标准，全年 p h 值在6 8 9 8 6 8 之间，为中性偏弱碱性；高锰酸钾盐指数( c o d m n ) 浓度较低，在 1 3 4 2 6 2 m g l 之间( 中营养型) ；叶绿素a 浓度除了1 2 月的2 1 7 6 和9 月份的7 7 3 v 福建师范大学理学硕士学位论文 | i l ( 中营养型) 外，其余均小于5ug l ( 贫中营养型) 【l 】；水库的总磷浓度大 部分o 0 5 m g l ( 中富营养型) ；总氮浓度除5 月份为o 0 2 m g l ( 为极贫营养型) ， 其余在0 5 4 1 8 2m g l 之间，达到中富营养型以上；氨氮浓度除了4 月份时的 0 7 4 m g l ( 中富营养型) ，总体较低，约0 2 m g l 左右( 贫中营养型) 。综合各项 水质指标表明杜塘水库水质呈中一富营养化水平。营养状态指数( t s h l l ) 结果： t s i m ( c h l ) 在3 2 8 2 5 8 2 l 之间，平均值为4 4 5 7 ，属于中营养型水平；t s i m ( s d ) 在 5 2 7 5 6 6 0 2 之间，平均值为5 8 9 5 ，达到富营养型水平；t s i m ( t p ) 值在4 8 7 0 - 7 2 5 2 之间，平均值为6 1 8 0 ，属富营养型水体，营养状态综合指数值( 总t s i ) 在4 6 7 8 7 2 5 2 之间，平均值为5 5 1 1 ，水质已达到富营养型水平。综合浮游藻类与水质参数结果分 析杜塘水库水质营养水平应在中富营养程度，有向富营养化转化暴发水华的潜力。 另外，以标准藻种蛋白核小球藻作为试验藻种，对杜塘水库水样进行藻类增长潜力 试验，试验中小球藻的生长速度随着n 0 3 - - n 浓度的升高而增大。而添加p 的实验 组中的小球藻的生长却受到一定程度的抑制，且抑制程度随着p 浓度的增高而增大。 添加n - 心实验组的小于相同浓度的全n 组但大于相对应的全p 组。由此结果表明n 营养盐是该水体增长的刺激因子，推测试验原水中磷供应充分，氮磷比小于l o 。 ， 在监测期间，本实验用2 5 号浮游生物网在水面上捞取微囊藻水样进行观察和种 类组成研究，共鉴定出5 种微囊藻：假丝微囊藻、挪氏微囊藻、坚实微囊藻、惠氏 微囊藻、史密斯微囊藻。采用毛细管法结合等比稀释平板法分离出监测期间较为常 见的挪氏微囊藻株( m i c r o c y s t i sn o v a c e k i is t r a i nd u t a n g ) ，群体胶被无折光、边缘不 明显，细胞排列较稀疏，多成对出现，细胞问隙一般大于其细胞直径，群体细胞较 单细胞小，直径5 - 8 i _ t m 。对其1 6 sr d n a - 2 3 sr d n a 的i t s 序列和微囊藻毒素合成基 因m c y b 进行p c r 扩增，结果显示该株微囊藻的i t s 序列长度约为4 6 0 5 0 0 b p ，m c y b 序列p c r 检测结果为阴性。其生长曲线符合典型的s 型单细胞藻类生长曲线，在生 长期前5 天，增长较为缓慢，为生长延滞期，第5 天后，进入对数生长期，在第6 天达到最大日增长速率为0 5 ，对数生长期持续到第1 3 天，此后进入衰亡期。细胞 平均生长速率常数k 为0 5 0 8 ，细胞平均倍增时间为4 7 h 。 本文通过测定生长曲线、比生长速率以及叶绿素a 、类胡萝卜素、藻蓝蛋白三 种色素含量的变化，对分离纯化的挪氏微囊藻杜塘株的生长影响因子进行研究，结 果表明：初始p h 值为中性偏碱性时有利于该微囊藻的生长，当初始p h 值为9 5 时 该藻的生长达到最大值。该株微囊藻对氮的依赖性很强，在缺氮及低氮条件下，很 v i 中文文摘 快就变黄、死亡，当氮浓度为1 3 7 。5 m g , l 或2 4 7 m g l 时，其生长及各项生理指标达 到最大值。此株微囊藻对磷的依赖性没有氮强，当磷浓度为0 和较低的o 0 5 4 m g l 时，还能缓慢地生长，磷浓度为5 4 m g l 时，其生长情况最好。挪氏微囊藻杜塘株 不适于在较低温度中生长，在1 5 条件下，第二天藻培养液就变白、死亡：2 0 。c 条 件下该藻生长速度缓慢，2 5 3 0 c 是其适宜的生长温度。此微囊藻在1 0 0 0 , - - 5 0 0 0 1 u x 范围内，短时间的高光照，有利于其生长，然而到生长后期，4 0 0 0 5 0 0 0 1 u x 的微囊 藻出现生长抑锘j j 现象，比生长速率趋于平缓，细胞内色素比例发生变化，类胡萝卜 素比值升高以抵抗高光强，综合各项生长指标，光照强度在2 0 0 0 - 3 0 0 0 范围内最适 宜该微囊藻的生长。 v a b s t r a c t a b s t r a c t i n v e s t i g a t i o no nc o m p o s i t i o na n da b u n d a n c ed i s t r i b u t i o no fp h y t o p l a n k t o nw a s c a r r i e do u td u r i n gm a r c h2 0 0 8a n dj a n u a r y2 0 0 9i nd u t a n gr e s e r v o i rz h a n g z h o u t h e m a i nc o n c l u s i o n sw e r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ：c h l o r o p h y t aa n dc y a n o p h y t aw a s d o m i n a n ti ns u m m e r , w h i l eb a c i l l a r i o p h y t aw a sd o m i n a n ti no t h e rt h r e es e a s o n s p h y t o p l a n k t oc o m m u n i t ys t r u c t u r eo fd u t a n gr e s e r v o i rw a sc h l 一c y a - b a e c o s t y p e ， w h i c hr e v e a l sm e s o t r o p h i cw a t e rq u a l i t y r e s u l t sb a s e do nc e l ld e n s i t ys h o w e dt h a tt h e r e s e r v o i rw a sp o o r - m e s o t r o p h i co rm e s o t r o p h i c ，w h i l ei tw a s1 3 - m e s o - p o l l u t e dj u d g i n g f r o mb i o l o g i c a ld i v e r s i t yi n d e x p h y s i c a la n dc h e m i c a lt a r g e t so ft h er e s e r v o i rw e r e m o n i t o r e di n t h em e a n t i m e a c c o r d i n gt ot h ee n v i r o n m e n t a lq u a l i t ys t a n d a r df o rs u r f a c e w a t e r ( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) ，d o 、c o d m n 、b o d 5a r ei nl i n ew i t ht h ei i it y p e c h l a ，t p , t n , a m m o n i an i t r o g e nc o n t e n ta n do t h e ri n d i c a t o r ss u g g e s tt h a td ut o n gw a s m e s o e u t r o p h i c a t i o n t r o p h i cs t a t ei n d e x ( t s i n l ) w a s5 5 1 1 ，w h i c hh a da c h i e v e dt h e e u t r o p h i cl e v e l b a s i n gu p o nt h ep h y t o p l a n k t o nr e s u l t sa n dp h y s i c a l c h e m i c a lt a r g e t s ，t h e n u t r i t i o n a ll e v e lo fd u t a n gr e s e r v o i rw a sm e s o e u t r o p h i c ，b u tt h e r ew a sa ni n d i c a t i o no f t h et r e n d st o w a r d se u t r o p h i c a t i o n t h ea l g a lg r o w t hp o t e n t i a lt e s tb yw a t e rf r o md u t a n g r e s e r v o i rs h o w st h a tt h en i t r o g e ni st h es t i m u l a t i o no f a l g a lg r o w t h f i v es p e c i e so fm i c r o c y s t i si nd u t a n gr e s e r v o i rw a si d e n t i f i e dd u r i n gt h es a m p l i n g t i m e 。t h e ya l em n o v a c e 勋zm w e s e n b e r g i i , m p s e u d o f i l a m e n t o s a , m s m i t h i ia n dm f i r m a 。o ft h e s e ，脱n o v a c e k i lw h i c hw a sf o u n d e do f t e ni nd u t a n gr e s e v o i r , w a s i s o l a t e da n dp u r i f i e d t h eg r o w t hc u r v eo fm n o v a c e k i iu n d e rc u l t u r ew a sss t y l ea n di t s a v e r a g eg r o w t hr a t ec o n s t a n ta n da v e r a g ed o u b l et i m e sw a s0 5 0 8a n d4 7 h ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t so fm c y bp c rw a sn e g a t i v ea n dt h ei t sl e n g t hs h o w e dt ob e4 6 0 - 5 0 0 b p r e s e a r c ho i lg r o w t hf a c t o ro fm n o v a c e m is t r a i nd u t a n gs h o w e dt h eb e s tc o n d i t i o nf o r g r o w t h o ft h i s a l g a e w a sa s f o l l o w s ： 2 5 3 0 ，2 0 0 0 - 3 0 0 0 1 u x ， n i t r a t e c o n c e n t r a t i o n - 一1 3 7 5 m g l ，p h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o n - - - 5 4 m g l ，p hv a l u 一5 k e y w o r d s ：d u t a n gr e s e r v o i r ；p h y t o p l a n k t o n ；w a t e rq u a l i t ya p p r a i s a l ；m n o v a c e k i i ； e n v i r o n m e n t a lf a c t o r s i l l 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)匿碧垡学号至q q 鱼q 皇圣垒专业植物堂 所呈交的学位论文( 论文题目：杜塘水库浮游藻类群落特征及微囊藻的 分离培养) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除论文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研究 工作做出贡献的个人或集体，均已在论文中作了明确说明并表示谢意， 由此产生的一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，耳口： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复常哇手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 学位论文作者签名：解争 签字日期：珈叼年月7 日 指导教师签名： 签字日期： 关干乞 “月夕日 绪论 绪论 1 水体富营养化 1 1 富营养化概念 水体富营养化是指水体因输入过量氮、磷等营养物质，引起水中浮游藻类和大 型水生植物的过度繁殖，水体溶解氧降低，造成其他水生生物的死亡，并伴随其他 一系列的水体生态与水质变化的过程。 水体富营养化的一般过程是，氮磷等营养物质输入的增加，为浮游藻类的生长 提供了适宜的营养条件，导致水华或赤潮；水体清洁度下降，有机物和富营养物质 在底泥中积累进一步消耗底部水体中的氧，水体中其他水生生物大量死亡；氮磷等 营养盐的沉积以及水体中死亡生物的分解与转化，在水底形成巨大的营养物储存库， 在特定的条件下会再次释放出来，从而导致水体富营养化程度的进一步恶化，破坏 水体生态环境 2 1 。 1 2 富营养化研究现状 富营养化已经成为一个全球性的重大水环境问题，引起了广泛重视。国外学者 对水体的藻类研究开始较早，相关报道也较多。早在2 0 世纪初，卢曼( n a u m a r t , 1 9 1 9 ) 首次将贫营养和富营养概念引入到湖泊研究领域中，并提出富营养化问题。近4 0 年来，随着世界上大规模的水体富营养化不断加剧，各国学者纷纷进行与藻类增殖 密切相关的湖泊形态学、水文学以及水质和底泥特征的考察和研究，相继提出各种 划分和评价湖泊水质营养状态的标准：吉村判定标准( 1 9 3 7 ) ；沃伦威德负荷量标准； 捷尔吉森湖泊营养类型判定标准；相崎守弘湖泊营养程度评分标准；卡森( c a l s o n ) 营养状态指数法( t s i ) 等，目前使用较多的是卡森营养状态指数法 2 1 。 国内对富营养化的研究起步比较晚，前期研究内容主要是在湖泊富营养化形成 机理和评价体系上，近几年才开始对富营养化防治技术进行研究。采用的方法归纳 起来主要包括内、外源的控制、生态工程技术和管理技术【3 1 。研究表吲4 】：我国目 前6 以上的湖泊、水库处于富营养化的水平，其中重富营养和超富营养的占2 ， 我国五大淡水湖泊中的太湖、巢湖均已极度富营养化一使得富营养化成为我国目 前与今后相当长一段时期内的重大水环境问题。 福建师范大学理学硕士学位论文 2 水环境的藻类生物学评价 浮游藻类是水生态系统生物资源的重要组分，作为水环境中的主要自养生物， 是物质代谢和能量循环的初级生产者，浮游藻类在水生态平衡中起着非常重要的作 用。而富营养化引起浮游藻类的过量增加，又是水质变坏、危害水体资源利用的主 要原因，不同的藻类对污染物的敏感性不一样，对污染物的反应可以发生在细胞、 个体、种群乃至整个生态系统等各个生物组建水平【6 1 ，因而在富营养化的监测方面， 浮游藻类的应用极为广泛，较常见的有指示种类、优势种、多样性指数、生物量、 形态细胞学特征等。根据相关文献及专著【1 , 6 - 1 4 1 ，将一些在水环境监测中的常用的浮 游藻类生物学评价指标做以下概述。 2 1 指示生物法 指示生物( i n d i c a t o ro r g a n i s m ) 是指环境中对某些物质( 包括进入环境中的污染 物) 能产生各种反应或信息而被用来监测和评价环境质量的现状和变化的生物【1 0 1 。 指示生物法即是指根据对水体中不同污染物敏感的或有较高耐受性的生物种类的存 在或消失，来指示其所在水体内受某种特定污染物污染程度的高低，指示生物法是 最经典的一种生物监测方法。但是指示生物的种类和数量的分布不单纯决定于污染， 其他条件如地理、气候以及河流的流速等对其也有影响，因此单纯的禾i j 用指示生物 法存在较大的缺陷。 2 2 污水生物系统法 k o l k w i t z 和m a r s s o n ( 1 9 0 8 ，1 9 0 9 ) 提出污水生物系统( s a p r o b i es y s t e m ) ：他们 在调查后发现，受污染河流由于自净过程能够自上游往下游形成一系列在污染程度 上逐渐减轻的连续带，每一带都生存有大体上能表示这一带特性的生物，从而根据 一条河流中一定区域内所发现的生物区系来鉴别该区域的有机物程度投。这个系统 在监测、评价河流污染和自净程度方面起了积极的作用1 6 】，但因为工作量大、缺乏 定量关系以及对生物分类知识的要求较高，在实际应用上也存在一定昀局限性。 2 3 生物指数法 生物指数是依据不利因素导致生物种群结构改变，用数学形式表现种群结构来 评价水环境的质量状况。常用的主要有以下几种： 2 3 1 硅藻生物指数 绪论 通过检测到的硅藻种类数来计算生物指数，即： i _兰竺二兰! 3 ( b - 中污) ，妈( q - 中污) 3 ( 轻或无污染) ，1 3 ( 中污染) ，o l ( 重污染) 细胞密度( 1 0 6 l 1 )o 51 0l 91 0 4 04 l 8 08 1 - - 9 91 0 0 3 微囊藻鉴定的研究进展 微囊藻属( m i c r o c y s t i ss p ) 是富营养化水体的一种常见水华种类，随着世界范 围内水体富营养化的发展，微囊藻不仅产生严重的水华，影响水体生态系统的平衡， 有不少微囊藻种类或株系都能产生毒素及异味物质，直接影响水环境的安全，威胁 人类的健康，因此对水体中优势微囊藻的鉴别已经引起人们的高度注意。 3 1 传统方法 传统的藻类鉴定方法主要是根据不同藻都有表明其身分的特征，从物理方法原 理上进行鉴定，如形态学上的形态大小，色素体、贮藏物质等的差另w j t 2 5 1 。根据k o m 矗r e k 和a n a g n o s t i d i s ( 1 9 9 9 ) k o m h r e k ( 2 0 0 2 ) 最新的蓝藻分类系统，在微囊藻属的分类上， k o m h r e k ( 2 0 0 2 ) 提出包括群体形态、胶鞘结构、细胞直径、群体中细胞组成和密 度、色素、生活史在内的六个显性特征，重新对已报道的5 0 多种微囊藻进行修订和 再描述，结果只有1 2 种微囊藻被认可，至少有7 种被明确归入其他科属，还有2 0 多种 需要重新修订确定其分类地位【2 8 1 。而虞功亮等( 2 0 0 7 ) 根据k o m f i r e k ( 2 0 0 2 ) 提 出的微囊藻属分类的六个特征，对胡鸿钧等( 1 9 8 0 ，2 0 0 6 ) ，朱浩然( 1 9 9 1 ) ，何家 苑等( 1 9 9 6 ) 报道的2 6 种微囊藻重新分类，1 0 种被保留，2 变种被合并，6 种归入其 他科属，还有8 种存疑问需进一步修订 2 9 - 3 3 1 。 传统的鉴定方法需要操作者受过专业的分类训练，且长期从事此类工作方能胜 任，而且藻类的形态学特征受环境的影响变化较大，如k o m a r e k 报导的，在其培养 的种中，5 0 以上的培养株系的特点与该类群相关特性不相对应【3 4 】，所以单独根据 传统的鉴定方法要准确鉴定到种较难，给分类和系统发育的研究带来不确定性。 福建师范大学理学硕士学位论文 3 2 分子鉴定方法 随着分子生物学的兴起，z u e k e r k a n d l s d p a u l i n g ( 1 9 6 5 ) 认为核酸包含有系统发 生的最原始的信息，最早提出将基因型应用于分类和系统学研究。2 0 世纪7 0 年代后， 分子系统学在藻类鉴定中得到广泛应用【3 s 】，近年来，利用不同的通用弓 物去扩增 d n a 中的特定序列并对该序列进行分析已成为微囊藻藻株鉴定的一个重要途径，可 以弥补传统的形态鉴定中遇到的外观差异细微的主观判别困扰，解决了传统的鉴定 方法难以解决的问题，目前主要应用在微囊藻的鉴定上的目标基因有核糖体r n a 基 因( r d n a ) 以及蛋白编码基因等：1 6 s r r n a 和2 3 s r r n a 之间的基因问隔区( i n t e m a l t y t r a n s c r i b e ds p a c e r s ，i t s ) 是一个特殊的区域，具有较高的突变速率，可用于亲缘关 系较密切的某些藻类和细菌的分类鉴定可鉴定到种【3 6 1 ，在国内，陈月琴等( 1 9 9 9 ) 首次对微囊藻属r d n a 基因间隔区全序歹i j 作了报道【3 7 】，这个区域也是目前在分子鉴定 上采用较多的一个【3 7 4 6 1 。已报道的用于微囊藻分子鉴定的蛋白编码基因主要有藻蓝 蛋白基因和微囊藻毒素合成基因：其中藻蓝蛋白基因( p c ) 的两个藻胆色素亚基b 和q ( c p c b 和c p c a ) 之间的基因间隔区( i n t e r g e n i cs p a c e r , i g s ) 是一个高变区，可 用作株系鉴定，利用此序列能区分开巴西微囊藻的1 5 个种【4 7 1 。应用于鉴别微囊藻产 毒株和非产毒株的分子生物学方面的研究近年来越来越多【4 2 t ，微囊藻毒素合成基 因m 顿被全球的研究者应用于设计和构建基于p c r 方法的毒素基因检澳1 1 t 5 3 , 5 4 l 。 4 本研究背景及意义 对于大多数水库的保护，特别是具有饮用水功能的水库，水体的富营养化是其 最大问题。富营养化过程产生的众多藻类对自来水厂的处理能力的影响很大，在藻 类爆发期间，有些藻类带有毒性，还可能引起鱼类的大量死亡，甚至人员的中毒。 因此，控制富营养化并预防水华暴发是水库环境保护的重要工作之一。 2 0 0 7 年9 月漳州杜塘水库出现大面积水华，水华藻类为微囊藻，水质检测结果 显示水库的水质已达到严重富营养化水平，直接威胁到当地居民的生活饮用水安全。 事件发生后，在经过一系列原因调查后，在专家的指导下，当地政府采取排放水库 内藻类含量高的表层水、投放鲢鱼等一系列缓解水华的措施后，污染得到一定控制， 但是由于各方面条件的限制，前期的调查工作对水华原因只是根据已有成果而进行 的定性的分析，缺乏科学数据的支撑，无法采取有针对性的措施，从根本上消除水 体产生水华的根源，虽然现在水华得到控制，但是其隐患仍然存在。因此在福建省 绪论 环境监测站的主持下对杜塘水库富营养化污染问题进行全面的监测和调查研究，包 括浮游藻类调查和分析，以找出富营养化污染产生原因并提出消除污染的措施。 本研究通过对水体中浮游藻类的组成进行调查和监测，为全面监测杜塘水库水 质提供生物学依据，并结合水质指标进行综合分析，能更全面准确地反映富营养化 污染状况和发展趋势。本研究还对杜塘水库中的微囊藻属种类进行了较深入的研究， 包括种类组成、常见藻株的分离纯化及一些生物学特征的研究，微囊藻是爆发水华 的优势种，并且许多种类还含有毒素，因此研究水体中微囊藻的种类及一些生理生 态等特征，对水体水华成因及水源安全具有重要意义。 第一章杜塘水库浮游藻类的种类组成及种群数量 第一章杜塘水库浮游藻类的种类组成及种群数量 1 1 材料与方法 1 1 1 实验仪器与试剂 1 1 1 1 试剂 鲁哥氏液( 配制方法：称取碘化钾2 0 9 ，j j i l j x , 2 0 0 m l 食 2 0 m l 冰醋酸的蒸馏水， 待完全溶解后加入碘l o g ，贮存于密闭的棕色试剂瓶中) 甘油 1 1 1 2 仪器 2 5 号筛绢浮游生物网 1 l 定量采水器( 中国科学院水生生物所制) 1 l 塑料瓶、l o o m l 塑料瓶 试剂瓶 0 1 m l 浮游植物计数框( 中国科学院水生生物所制) o l y m p u sv a n o x 显微镜( 日本奥林巴斯有限公司) 双向磁力搅拌器7 8 2 ( 常州国华电器有限公司) 超纯水器m i l l i qp l u s ( m i l l i p o r e 公司) j j 型精密电子天平( 江苏常熟双杰测试仪器厂) 1 1 2 水样采集 1 1 2 1 采样时间 采样时间为2 0 0 8 年3 月至1 j 2 0 0 9 年2 月，其中2 0 0 8 年3 月1 0 月，每月两次，其余每 月一次。 1 1 2 2 采样点设置与水样采集 在水库的库尾、库心和坝前设置3 个采样点如图1 - 1 所示。 福建师范大学理学硕士学位论文 图1 - 1 牡塘水库采样点示意母 f i g1 - 1s a m p l i n gp o i n t so f d u t a n g r e s e r v o i r 水样的采集分定性和定量两种样品，定性水样用2 5 号筛绢浮游生物阿在水面上 层来回拖网5 m i n ；定量水样用定量采水器分上、中、下3 层各取样i l ( 其中库尾 点由于水深不足1 0 m 只分上下2 层) ，共8 组样品。 1 1 3 浮游藻类调查实验方法 1 1 3 1 水样处理 在采样现场用1 5 m l 鲁哥氏液固定定量水样，在实验室静置沉淀4 8 h ，除去上清 液后，加入4 的甘油防止水份蒸发，再定容至3 0 m l ，装在小口瓶中做好标签记号， 保存m 。 定性水样一部分用鲁哥氏液固定保存，一部分不固定作为活体观察样品， 1 1 3 2 浮游植物定性定性定量分析 定性分析：根据专著描述、图谱和文献描述3 2 , 3 3 , 5 5 , 矧，在显微镜下对浮游藻 类进行种类鉴定，优势种鉴定到种，其他至少鉴定到属。 定量分析采用ol m l 浮游植物计数框( 中国科学院水生生物研究所制) 计数： 单细胞按细胞计数，群体先计算代表不同体积时的细胞数，再根据群体体积大小分 别计算个体数，最后换算成细胞数，丝状体先计算出平均一个个体的细胞数，再以 个体数换算成细胞数，取样前要摇匀水样，计数时采用况琪军等( 2 0 0 4 ) 改良过的 行格法口7 1 ，即计算整片的百分之十五呈梅花型选格，分别为第2 ，第5 ，第8 行中 的第2 ，第5 ，第8 格和第3 ，第6 ，第9 行中的第3 ，第7 格) ，然后按公式n = n 鬻豢燃一黪癸 第一章杜塘水库浮游藻类的种类组成及种群数量 1 0 0 1 5 3 0 0 1 0 0 0 换算成每毫升水样中藻类的细胞个数，式中1 1 为1 5 框计得的藻 类细胞数。 1 2 实验结果 1 2 1 浮游藻类群落组成 通过种类鉴定和计数，共鉴定出浮游藻类8 门、6 0 属、9 3 种，分别属于隐藻门 c r y p t o p h y t a ( 4 种) 、蓝藻门c y a n o p h y t a ( 1 0 种) 、绿藻门c h l o r o p h y t a ( 4 8 种) 、 硅藻门b a c i l l a r i o p h y t a ( 2 1 种) 、裸藻门e u g l e n o p h y t a ( 4 种) 、金藻门c h r y s o p h y t a ( 1 种) 黄藻门x a n t h o p h y t a ( 1 种) 、及甲藻门p y r r o p h y t a ( 4 种) 等，其中蓝藻细 胞数量最多，占整个水库浮游藻类细胞数的5 3 3 9 ，而金藻门细胞数量最少，仅占 0 0 8 ( 详细种类组成及比例见附录1 ) 在全年的监测期间，各种藻类出现频率不一样，有的藻一年中只在少数几个月 份出现，如金藻门的锥囊藻只在0 8 年的3 、4 月份出现，绿藻门的美丽团藻只在0 8 年7 、8 月中监测到；而有的藻种类每个月都有出现，如绿藻门的盘星藻属、衣藻属、 栅藻属、硅藻门的小环藻、颗粒直链藻等。每个月的物种数都不相同。图1 2 列出 一年监测期内浮游藻类物种数的变化。 5 0 4 0 籁 熏3 0 霉 2 0 l o 0 梦萝梦梦梦秽梦梦萨梦梦芦黜 图1 - 2 杜塘水库不同月份物种数量变化 f i g 1 - 2m o n t h l yc h a n g eo f s p e c i en u m b e r so f d u t a n gr e s e r v o i rd u r i n gs a m p l i n gt i m e 1 2 2 浮游藻类数量 1 2 2 1 浮游藻类各门细胞数 从细胞密度来分析，通过图1 3 折线图可以看出，杜塘水库全年主要浮游藻类 群落细胞密度的变化主要是蓝藻门、硅藻门和绿藻门的季节变化。从图中可以看到， 福建师范大学理学硕士学位论文 在2 0 0 8 年春季( 3 月到5 月) 蓝藻门细胞密度最大，而到了夏季( 2 0 0 8 年7 月到9 月) ，绿藻门数量增多，与蓝藻门共同成为优势种类；秋冬季，则是硅藻门的细胞密 度最高。而其它门的种类数量较少，且变化趋势基本一致( 图1 4 ) 。 梦萝萝萝笋梦梦矿萨梦萨矿 + 隐藻f c r y p t o p h y t a- - - 4 - - 甲藻f q d i n o 曲y t a - x 一硅藻n b a c i l l a r i o p h y t a女蓝藻f 3 c y a n o p h y t a _ + 一金藻l c h r y s o p h y t a 月份 1 6 r 一绿藻f - 】c h l o r o p h y t a + 裸藻门e u g l e n o p h y t a 注：4 月份由于微囊藻群体上浮到水面，计数结果未显示出微囊藻数量，造成细胞密度的下降 图1 3 浮游藻类细胞密度月份变化 f i g 1 - 3m o n t h l yc h a n g e so f c a l ld e n s i 红o f a l g a ed u r i n gs a m p l i n gt i m e 0 月份 图1 _ 4 非优势门藻类密度月份变化 f i g1 - 4m o n t h l yc h a n g e so f d e n s i t yo f n o n - d o m i n a n ta l g a ed u r i n gs a m p l i n gt i m e 1 2 2 2 浮游藻类各门个体数 由于蓝藻门主要种类组成为微囊藻( m i c r o c y s t i ss p ) 、颤藻( o s c i l l a t o r i as p ) 和腔球藻( c o e l o s p h a e r i u mn a g ) 等细胞体积较小的种类，在生物量的所占的比例 o o o o o 0 o o o o o o o o o o o 0 o 0 o o 0 0 o 6 4 2 o 8 6 4 2 l 1 1 l ri七一世龆黑聂粼麟装趾 0 o 0 o 0 0 ； 衢 加 垢 加 5 1七一憾龆罂器脉麟糖矬 第一章杜塘水库浮游藻类的种类组成及种群数量 较小，故从个体数角度对杜塘水库浮游藻类的组成变化进行分析。从图1 5 看出， 在0 8 年3 月、1 2 月0 9 年2 月期间，硅藻门个体数最多，其中主要种类是美丽星杆 藻，0 8 年4 月水面有大量微囊藻上浮，蓝藻门占优势，但尚未形成水华密度，由于 计数样品在0 5 m 以下采得，故计数结果未显示出具体