（化学专业论文）药物氨基酸衍生物酶促合成及选择性调控研究.pdf

摘要 摘要 酶促合成方法具有选择性高、反应条件温和等优点，使其在药物及其衍生物 的合成中已受到越来越多的关注，具有很好的应用前景。氨基酸由于其无毒以及 良好的生物相容性而被视为前药制备的理想载体。药物经氨基酸衍生化后还能够 改善药物口服生物利用度、提高药效降低毒副作用等。本论文发展了非水介质中 酶促选择性合成1 ，2 二醇类、核苷类等药物氨基酰化衍生物的方法。 论文研究了6 种天然氨基酸乙烯酯的合成( v i n y l n - b o c l - p h e 、 v i n y l - n - b o c l a l a 、v i n y l - n - b o c l - v a l 、v i n y l n - b o c l l e u 、d i v i n y l n - b o c l a s p 、 d i v i n y l - n - b o c l g l u ) 。所得高活性乙烯酯衍生物可作为酰基供体参与酶促酯交换反 应，合成药物氨基酸衍生物。其中二羧基氨基酸天门冬氨酸和谷氨酸的二乙烯酯， 在酶催化下合成可聚合的药物氨基酸衍生物单体，可用于制备性能新颖、生物相 容性好、可生物降解的高分子药物。 论文发展了非水介质中含多羟基药物衍生物的酶促选择性合成方法。研究了 酶促选择性合成1 ，2 二醇类药物可聚合氨基酸衍生物，该反应具有快速、高效和操 作简单的特点。以愈创甘油醚，氯酚甘油醚，美芬辛为研究底物，分别与n b o c l 天门冬氨酸二乙烯酯和n - b o c l 一谷氨酸二乙烯酯进行酶促反应，合成了6 种新颖 的二醇类药物可聚合氨基酸衍生物。通过系统的考察不同酶源、反应介质、反应 时间、体系含水量、反应温度、酶的重复利用率等条件对反应的影响。通过对反 应动力学研究，得到反应的初始反应速率和最佳反应时间。 论文研究了核苷类药物酶促选择性氨基酸衍生化反应。考察了氮杂胞苷、阿 糖胞苷和利巴韦林三种核苷类药物分别与两种氮保护氨基酸二乙烯酯以及四种含 不同侧链基团的氨基酸乙烯酯酶促反应，合成了6 种新颖的可聚合的核苷类药物 l 一氨基酸衍生物及2 0 种含不同侧链l 一氨基酸的核苷类药物衍生物。反应具有条件 温和、选择性高、产率好等特点。 论文研究了氮杂胞苷氨基酸衍生物的可控制选择性合成。在吡啶中由枯草杆 菌碱性蛋白酶催化氮杂胞苷与氨基酸乙烯酯的反应，选择性地发生在氮杂胞苷糖 环的伯羟基位置，并且枯草杆菌蛋白酶表现出很好的催化活性，反应产率较高； 摘要 在d m f 中通过脂肪酶p s 催化氮杂胞苷与氮保护氨基酸乙烯酯的反应，可以得到 在糖环的仲羟基上发生酰化反应的2 一d 一酰化和3 - 0 一酰化产物的混合物。通过改 变酶源和反应介质等条件实现了在氮杂胞苷不同位置发生反应的选择性控制。同 时考察了反应时间、反应温度、底物投料比、酶浓度等各种因素对酶促酯化反应 产率和选择性的影响。 论文以酶促合成的氮杂胞苷5 - o 一氮保护氨基酸衍生物为底物，在三氟乙酸作 用下脱保护制备了4 种新的氮杂胞苷氨基酸酯前药。研究了氨基酸酯药物的水溶 性和在不同p h 条件下的体外化学稳定性。结果表明：氨基酸酯前药具有良好的水 溶解性能；前药具有较好的化学稳定性，能够在一定程度上改善母药的不稳定性 能，同时发现前药在酸性条件下比在中性条件下稳定；前药氨基酸的侧链基团对 前药的化学稳定性有影响，含有大的侧链基团对前药的化学稳定性有利。 关键词：非水介质，酶促合成，氨基酸衍生化，可控选择性，氨基酸前药 a b s t r a c t a b s t r a c t e n z y m a t i cm e t h o d sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n t h es y n t h e s i so fp h a r m a c e u t i c a l c o m p o u n d sa n dt h e i r d e r i v a t i v e sd u et ot h e i rh i g h s e l e c t i v i t ya n dm i l d r e a c t i o n c o n d i t i o n s i nt h i st h e s i s ，s e l e c t i v ee n z y m a t i cs y n t h e s i so fs o m ed r u gd e r i v a t i v e s ，s u c h a s1 , 2 一d i o ld r u g sa n dn u c l e o s i d ed r u g s ，w e r ed e v e l o p e d i nt h i s p a p e r , w es y n t h e s i z e d s i x b o c p r o t e c t e da m i n o a c i d v i n y l e s t e r s ( v i n y l - n - b o c l p h e ，v i n y l - n - b o c l a l a ， v i n y l - n - b o c - l - v a l ，v i n y l - n - b o c l l e u ， d i v i n y l - n o b o c l a s p d i v i n y l n - b o c l - g i u ) t h e s ev i n y le s t e r sw i t hh i g ha c t i v i t y c o u l db e u s e da s a c y l d o n o r si nt h ee n z y m a t i ct r a n s e s t e r i f i c a t i o n p o l y m e r i z a b l e a m i n o a c y lv i n y l e s t e rd e r i v a t i v e so f d r u g c o u l db ea c h i e v e dv i a e n z y m a t i c t r a n s e s t e r i f i c a t i o nd r u gw i t hd i v i n y le s t e r so fa m i n oa c i d s t h eo b t a i n e dd r u g c o n t a i n i n g m o n o m e r sw i t hf u n c t i o n a l i z e da m i n oa c i dc o u l db ef u r t h e ru t i l i z e da s p r e c u r s o r sf o rb i o d e g r a d a b l ep o l y m e r i cp r o d r u g s t h es e l e c t i v e e n z y m a t i cs y n t h e s i s o fs o m e d r u g s d e r i v a t i v e s c o n t a i n i n g m u l t i h y d r o x y li nn o n - a q u e o u sm e d i aw a sd e v e l o p e d t h r e e1 , 2 一d i o ld r u g s ，g u a i f e n e s i n ， c h l o r p h e n e s i na n dm e p h e n e s i n ，w e r ec h o s e na ss u b s t r a t e s d i v i n y l - n - b o c - l a s pa n d d i v i n y l - n - b o c l - g l uw e r eu s e da sd o n o ra g e n t s s i xk i n d so fp o l y m e r i z a b l ea m i n o a c y l v i n y le s t e rd e r i v a t i v e so fd r u gw e r es e l e c t i v e l yp r e p a r e dt h r o u g he n z y m a t i cr e a c t i o n i t w a saf a c i a la n dq u i c km e t h o d m o r e o v e r t h ei n f l u e n c ef a c t o r so fe n z y m a t i cs y n t h e s i s i n c l u d i n ge n z y m es o u r c e s ，r e a c t i o nm e d i a ，r e a c t i o nt i m e ，w a t e rc o n t e n t ，e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt h ee f f e c to fe n z y m er e u s e dw e r ei n v e s t i g a t e d i i i a b s t r a c t f u r t h e r m o r e ，t h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t ea n dt h eo p t i m a lr e a c t i o nt i m ew e r er e s e a r c h e db y t h es t u d yo fr e a c t i o nk i n e t i c s s e l e c t i v e e n z y m a t i cs y n t h e s i s o fn u c l e o s i d e d r u g sa m i n o a c y ld e r i v a t i v e s i n n o n a q u e o u sm e d i aw a sa l s od e v e l o p e d e n z y m a t i ca m i n o a c y l a t i o no fa z a c i t i d i n e ， c y t a r a b i n a n dr i b a v i r i nw i t ht w o d i v i n y la m i n o c a r b o x y l a t e s a n df o u r v i n y l a m i n o c a r b o x y l a t e s w i t hd i f f e r e n ts i d ec h a i nw e r e d e v e l o p e dt o s i xk i n d so f p o l y m e r i z a b l ea m i n o a c y lv i n y l e s t e r sd e r i v a t i v e sa n dt w e n t yk i n d so fa m i n o a c y l d e r i v a t i v e so fd r u g si ng o o dy i e l d s t h ec o n t r o l l a b l es e l e c t i v es y n t h e s i so fa z a c i t i d n ea m i n o a c y ld e r i v a t i v e sc o u l db e a c h i e v e d c a t a l y s i sb ya l k a l i n ep r o t e a s ef r o mb a c i l l u ss u b t i l i s ( s u b t i l i n s i n ) i np y d d i n e c o u l df a c i l i t a t e dt h es i n g l es t e ps y n t h e s i so f57 一o a m i n o a c y la z a c i t i d i n ed e r i v a t i v e si n h i g hy i e l d s t h ea p p l i c a t i o no fa m a n ol i p a s ep sf r o ma s p e r g l l u sm e l l c u s ( l i p a s ep s ) i nd m fa f f o r d e dt h em i x t u r ep r o d u c t so f2 一o a m i n o a c y la n d3 一o a m i n o a c y i a z a c i t i d i n ed e r i v a t i v e s t h ec o n t r o l l a b l es e l e c t i v i t yo fd i f f e r e n tp o s i t i o no fa z a c i t i d i n e w a sa c h i e v e db yc h a n g i n gt h er e a c t i o nc o n d i t i o n s f o u rk i n d so fn o v e la m i n oa c i de s t e rp r o d r u g so fa z a c i t i d i n ew e r eo b t a i n e da f t e r d e p r o t e c t i o np r o c e s s t h ew a t e r - s o l u b i l i t ya n di n v i t r or e l e a s eo fa m i n oa c i de s t e r p r o d r u g sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d ，a n dt h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tp r o d r u gc a nb e c o n s i d e r e da sa p r o m i s i n gp r o d r u gf o r m m o r e o v e r , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h e m i c a l s t a b i l i t yr e s u l t sa n dt h es t r u c t u r e so fp r o d r u g sw a s d i s c u s s e d k e y w o r d s ：n o n a q u e o u sm e d i a ，e n z y m a t i cs y n t h e s i s ，a m i n o a c y ld e r i v a t i z a t i o n ， c o n t r o l l a b l es e l e c t i v i t y ，a m i n oa c i de s t e rp r o d r u g 浙江大学硕上学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿态堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 弓码 签字日期：_ 莎年6 月& e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 牿名 签字日期：瑚年6 月ge t签字日期：力一占年月彦e t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章绪论 第一章绪论 生物催化合成具有高选择性、底物专一性和反应条件温和等优点在有机合成 领域倍受到关注，并在药物合成、天然产物修饰、手性化合物拆分以及生物新化 料合成等研究领域中起着越来越重要的作用。特别是1 9 8 4 年，美国k l i b a n o v 教授 首次发现酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和很高的催化活性以来【l 】，非水介质 中的酶催化合成研究取得了一系列重要成果和突破性进展；在有机介质中，酶不 仅可催化通常的氧化、还原、水解、酯化、裂合、异构化等各种类型的反应【2 】，而 且可以催化许多新反应及在非水介质中酶催化混乱性；非水酶学已成为一个非常 活跃的研究领域，显示出重要的理论意义和实际应用价值。 1 1 酶促合成方法与药物氨基酸衍生化 药物衍生化是改善药物活性重要途径之一【3 】，如氨苄西林( a m p i c i l l i n ) 在胃肠道 以离子形式存在，生物利用度仅为2 0 3 0 ，将其羧基酯化得到匹氨西林 ( p i v a m p i c i l l i n ) 、仑氨西林( l e n a m p i c i l l i n ) 等，在体内的抗菌作用比氨苄西林强2 4 倍，且生物利用度可达9 5 。丝裂霉素c ( m i t o m y c i nc ) 为抗肿瘤烷化剂，其脂溶 性低，在环丙氨基的氮原子上引入苯甲酰氧甲氧甲酰基，可使脂溶性增大约2 0 0 0 倍f 4 】。然而，对含有多个羟基、氨基或羧基等官能团的药物选择性衍生化存在许多 困难。酶作为一种高选择性的催化剂，可实现反应在某一特定位置选择性地进行， 而且反应条件温和能耗低，在绿色化学工业生产中具有很好的应用前景【2 】；尤其是 随着酶工程、介质工程以及底物工程的发展，酶的活性和选择性不断提高，将成 为有机合成的强有力工具。 国外很多研究小组从事酶促合成与药物衍生化、手性药物拆分方面的研究。 如荷兰的s h e l d o n 教授1 5 从事酶促催化方法学及离子液体等绿色介质中生物催化有 机合成等方面的研究；德国t h e i l 教授 6 - 7 1 通过研究酶的结构和活性催化中心，实 现二醇类药物及相关化合物通过连续两步酶促拆分，另外对反应的介质在拆分中 的影响进行研究；西班牙的g o t o r 教授f 8 】主要研究核苷类化合物选择性酶促合成 及酶促不对称合成方法，同时针对不同的选择性进行酶促反应机理理论计算研究。 浙江大学硕上毕业论文 美国哈佛大学w a l s h 教授【9 l 从事天然产物的生物合成，并致力于酶促反应的机理方 面的研究。国内在药物的酶促合成研究中也已取得较大进展。中科院北化所的王 梅祥教授系统地研究腈和酰胺化合物在细胞催化下的化学选择性、区域选择性和 立体选择性水解反应，同时建立和发展了一些复杂杂环化合物的合成方法 ! o - 1 1 】。 华东理工大学的许建和教授研究组主要从事生物催化剂的定向筛选，生物催化选 择性的人工调控，非水相生物催化研究集中于非水相溶剂系统中酶催化剂的激活 方法，以及高效非水相酶反应器的构建与长期运行等 1 2 - 1 3 j 。华南理工的宗敏华教 授主要研究领域为生物合成与转化、生物制药，同时进行离子液体绿色化学工作 的探索1 4 。1 引。浙江大学的杨立荣教授主要研究非水介质中的酶工程研究，手性中 间体以及生物肽合成1 6 - 1 7 】。 氨基酸由于其低毒以及良好的生物相容性被视为制备前药的理想载体。近些 年来，药物氨基酸衍生物的合成研究已经成为药物化学等研究领域的热点 1 8 - 1 9 1 。 例如已经被f d a 批准的万乃洛韦刎就是阿西洛韦的l 缬氨酸酯前药，口服生物利 用度远高于母药。a m i n d o n 课题组2 1 】合成了吉西它宾和氟脲苷的氨基酸酯前药， 与母药相比，提高了药物的口服生物利用度、增加了药物的稳定性等。p i g n a t e l l o 等2 2 1 合成了氟吡洛芬与长脂肪族烷基侧链氨基酸结合的前药，该药物氨基酸衍生 物是一种两亲性衍生物，使得他们更容易与生物膜相互作用并穿过，极大提高药 物的生物利用度。 1 2 本论文选题目的与研究内容 近年来，药物氨基酸衍生物合成及其性能的研究已成为一个新的热点。同时， 利用天然氨基酸中的二羧基氨基酸或者二氨基氨基酸构建高分子前药，如将氨基 酸作为载体引入高分子药物中，可使药物具备高分子药物优点外还具有生物相容 和生物可降解的特点。把酶促方法引入到氨基酸衍生物的合成中已经引起人们的 极大兴趣。酶促药物氨基酸衍生化反应能够在温和条件下完成，发挥了酶的立体 选择性和区域选择性等固有特征，为化学家和药物学家提供了一个比化学法合成 更为简便和经济的方法f 2 3 1 。 本论文选择了? 药物氨基酸衍生物酶促合成及选择性调控研究”作为研究课 2 第一。章绪论 题，主要内容包括以下几个方面： 1 、合成可聚合药物氨基酸衍生物。通过合成制备二羧基天然氨基酸( l a s p 、l g l u ： 二乙烯酯作为酰基供体，与愈创甘油醚、氯酚甘油醚、美酚辛、氮杂胞苷、阿糖 胞苷和利巴韦林等药物，在非水介质中酶促合成可聚合药物氨基酸衍生物，并考 察各种因素对酶促酯交换反应的影响。 2 、合成核苷类药物氨基酸衍生物及其羟基选择性调控研究。通过合成天然氨基酸 ( l p h e 、l a l a 、l v a l 、l - l e u ) 乙烯酯作为酰基供体，与核苷类药物( 氮杂胞苷、 阿糖胞苷、利巴韦林) 等，在有机溶剂中酶促合成核苷类药物氨基酰化衍生物， 考察了各种因素对酶促反应的影响；并详细研究酶、溶剂等因素对核苷类药物的 羟基选择性，实现伯羟基和仲羟基可控选择性合成。 3 、研究核苷类药物氨基酸衍生物前药的溶解性及体外降解等性质。 参考文献： 1 z a k sa ，k l i b a n o va m ，s c i e n c e ，1 9 8 4 ，2 2 4 ：1 2 4 9 2 张玉彬，生物催化的手性合成，化学工业出版社，北京，2 0 0 2 3 m o z h a e vv v ，b u d d ec l ，r i c hj o ，t e t r a h e d r o n ，1 9 9 8 ，3 9 71 4 尤启东主编药物化学，化学工业出版社，北京，2 0 0 4 5 w e g m a nm a ，j a n s s e nm h a ，s h e l d o nr a ，a d v s y n t h c a t a l ，2 0 0 l ：6 7 3 4 3 6 h u n g e r h o f fb ，s o n n e n s c h e i nh ，t h e i lf a n g e w c h e m i n t e d 铷吣1 ，4 0 ：2 4 9 2 7 l e m k ek ，l e m k em ，t h e i lej o 豫c h e m 1 9 9 7 ，6 2 ：6 2 6 8 8 g a r c i a u r d i a l e se ，a l f o n s oi ，g o t o rv ，c h e m r e v ，2 0 0 5 ，j d 5 ：313 9 p a t e lr n ，a d v s y n t h c a r 0 1 ，2 0 0 1 ，6 7 ：3 4 3 1 0 w a n gm x ，y a n gh b za m c h e m s o c 2 0 0 4 ，1 2 6 ：1 5 4 1 2 儿w a n gm x ，z h a n gx h ，z h e n gq ya n g e w c h e m i n t e d 2 0 0 4 ，4 3 ：8 3 8 1 2 l i uy y ，x uj h ，h uy 上m o lc a t a l b ：e n z y m 2 0 0 0 ，1 0 ：5 2 3 1 3 x uw ，x uj h ，p a nj ，g uq ，w ux y o r g l e t t 2 0 0 6 ，8 ：1 7 3 7 1 4 l o uw y ，z o n gm h ，s n f i t ht j g r e e nc h e m 2 伽1 6 ，8 ：1 4 7 1 5 l o uw y ，z o n gm h c h i r a l i t y2 0 0 6 ，1 8 ：8 1 4 1 6 z h a n gt z ，y a n gl r ，z h uz q e n z y m em i c r o b t e c h n 0 1 2 0 0 5 ，3 6 ：2 0 3 1 7 z h a n g 】，w uh e ，y a n gl r j m o lc a t a l b ：e n z y m 2 0 0 4 ，3 1 ：6 7 1 8 b a i l e yp d 。b o y dr ，b r o n kj r ，e ta 1 ，a n g e w c h e m i n t e d ，2 0 0 0 ，3 9 ：5 0 5 3 浙汀大学硕士毕业论文 1 9 l i ，f j ，m a a g ，h ，a l f r e d s o n ，t zp h a r m s c l2 0 0 8 ，9 7 ，11 0 9 2 0 s h i n k a ii ，o h t ay ，b i o o r g m e d c h e m ，1 9 9 6 ，4 ：1 ；f r i e d r i c h s e ng m ，c h e nw ，b e g t r u pm ， e ta 1 ，e l lr z 尸h a r m s c l ，2 0 0 2 ，1 6 ：1 2 1 s h i nh c ，k i mj s ，v i g ，b s ，e ta 1 ，b i o lp h a r m b u l l ，2 0 0 6 ，2 9 ：2 4 7 ；l a n d o w s l ( jc p ，v i g b s ，s o n gx q ，e ta 1 ，m 0 1 c a n c e rt h e r ，2 0 0 5 ，4 76 5 9 ；l a n d o w s k ic p ，s o n gx q ， l o r e n z iel ，e ta 1 ，p h a r m r e s ，2 0 0 5 ，2 2 ：1 51 0 2 2 p i g n a t e l l or ，p a n t bv ，s a l m a s os e ta 1 ，b i o c o n j u g a t e c h e m 2 0 0 8 。1 9 ：3 4 9 2 3 姚日生主编，药用高分子材料，化学工业出版社，北京，2 0 0 3 4 第二章酶促药物衍生化与氨基酸衍生物的研究现状 第二章酶促药物衍生化与药物氨基酸衍生物的研究现状 酶作为生物催化剂和一般的催化剂相比较，其具有很高的催化效率、很好的 选择性、高度的底物专一性以及酶活性可以受到调节和控制等优点。酶促合成的 方法已经作为有机合成中一种非常重要的工具1 1 。自1 9 8 4 年美国k l i b a n o v 教授圆 首次发现酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性以来，非水介质 中的酶催化的研究取得了突破性的进展。相比水相介质中的酶催化反应，我们已 经知道酶在有机相中也显示出相应的功能，并且活性，选择性，稳定性可以调节 和改变，甚至他们的天然构型可以在无水的环境中从部分失活的状态中重新获得 口】。此外，生物技术研究表明，与水介质相比，酶在非水介质中存在很多优点。如： 显著的提高底物的溶解度，通过简单的调整反应介质而不是酶本身就可以改善其 选择性，酶的热稳定性提高，在酯交换反应中有利于平衡向合成的方向移动，消 除由水引起的不必要的副反应等【4 l 。所有这些都可以看出非水介质中生物转化的研 究非常活跃和引人注目。 经过近二十年的发展，非水介质中的酶促合成已经成为了有机合成化学的一 个重要的新领域【5 】。通过酶促方法合成各类药物衍生物已有很多相关报导，生物催 化的方法已成功用于维生素、氨基酸、核苷、甾体、抗生素等以及各类手性药物 的制备中，这是有机合成化学领域的一项重要进展，体现出了重要的理论价值和 应用潜力，并已出现许多科研成果。 目前，非水酶学的研究主要集中在3 个方面：第一，非水酶学基本理论的研 究，它包括影响非水介质中酶催化的主要因素以及非水介质中酶学性质；第二， 通过对酶在非水介质中结构与功能的研究，阐明非水介质中酶的催化机制，建立 和完善非水酶学的基本理论；第三，利用上述理论来指导非水介质中酶催化反应 的应用，通过酶促的方法合成各类化合物f 6 i 。本章主要对以有机溶剂为主体的非水 介质中各类药物衍生物的区域选择性酶促合成以及药物氨基酸酯前药的研究作一 综述。 浙江大学硕上毕业论文 2 1 酶促区域选择性合成各类药物衍生物 2 1 1 药物的衍生化原理及酶促方法的意义 ( 1 ) 前药原理 1 9 5 8 年，a l b e r t t 7 1 最早提出前药( p r o d r u g ) 这个概念，是指一类在体外无活性 或活性较小，在体内经酶或非酶作用，释放出活性物质而产生药理作用的化合物。 它常常是把活性药物( 原药) 与某种无毒性化合物相连接而成。这种把有生理活 性的原药潜伏化，而利用其在体内逐渐转变为有效药物的道理，称之为前药原理。 前药设计的目的是为了改变药物的物理化学性质，原药经修饰后，可以达到提 高药物对靶部位的选择性；或改善药物在体内的药代动力学过程；或可延长作用 时间；或提高生物利用度；或降低毒副作用；或提高化学稳定性；或可增加水溶 性；或可改善药物的不良气味；或消除特殊味道及不适宜的制剂性质等多种目的f 8 】。 例如阿昔洛韦( a c y c l o v i r ) 是一种有效的抗疱疹病毒药，但水溶性差。通过设 计它的水溶性前药地昔洛韦( d e s c y c l o v i r ) 【9 l ，使其在水中的溶解度比阿昔洛韦大 1 8 倍，同时地昔洛韦口服吸收也比阿昔洛韦高。红霉素( e r y t h r o m y c i n ) 遇酸不稳 定，将其2 7 位羟基酯化得到红霉素碳酸乙酯，提高了稳定性和抗菌活性，而且还 减少了红霉素的苦味( 图2 1 ) 【8 】。 r = h ，红霉素 r = 一c o o c 2 h 5 ，红霉碳酸乙酯 图2 - 1 红霉素及其衍生物 f i g 2 - 1e r y t h r o m y c i na n di t sd e r i v a t iv e 对于某些需要在特定部位起作用的药物，利用体内各器官的酶系统的差异，可 设计具有靶向性的前药。设计时需要研究该部位酶的作用和药物代谢方式，制成 相应的前药，在特定部位酶作用下产生活性代谢物而发挥作用。如己烯雌酚 ( d i e t h y l s t i l b e s t r 0 1 ) 是治疗前列腺癌的有效药物，但对患者会产生雌激素副作用。 研究发现，前列腺肿瘤组织中磷酸酯酶的含量很高，利用这一特点，设计其前药 己烯雌酚二磷酸酯( 图2 2 ) 【8 】。服用后，己烯雌酚二磷酸酯容易分布到磷酸酯酶 6 第二章酶促药物衍生化与氨基酸衍生物的研究现状 较高的前列腺，使癌组织中浓度高于正常组织，并经磷酸酯酶水解释放出己烯雌 酚，从而增加了对前列腺肿瘤组织的选择性，降低了全身的雌激素副作用和毒性。 r = h 乙烯雌酚 r = p o f f i乙烯雌酚二磷酸酯 图2 2 乙烯雌酚和乙烯雌酚二磷酸酯 f i g 2 2d i e t h y l s t i b e s t r o la n di t sd i - p h o s p h a t ed e r i v a t i v e 制备前药的方法有多种，主要依据母药和载体分子的结构而定。一般说来，醇 类羟基是容易代谢的基团，药物设计中常常把羟基酰化，可采取形成酯，缩醛或 缩酮、醚等的形式，以延长药物的半衰期，改变药物的溶解度及生物利用度等方 面的性质。含羧基的药物，在口服给药时，常对胃肠道产生刺激且不易吸收。因 此具羧基药物常需要进行化学结构修饰以改善性质，羧酸类易形成酯、酰胺等， 如布洛芬( i b u p r o f e n ) 对胃肠道有刺激性，经衍生化成甲酯后，刺激性大为改善。 胺类可采用形成酰胺、亚胺、偶氮、氨甲基化等形式；羰基类则可通过s c h i f f s 碱、 肟、缩醛或缩酮的形成来制备前药【8 】。 ( 2 ) 酶促合成药物衍生物的意义 生物催化的药物合成是一个由有机化学、药物化学、生物化学以及微生物学 等多学科交叉的研究领域。1 9 6 0 年，诺华( n o v o ) 公司通过对地衣形芽孢杆菌 ( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 深层培养发酵大规模制备了蛋白酶，从此开始了酶的商品 化生产【l 】。经过近半个世纪的研究，生物催化法成为一种标准的有机合成方法。酶 作为一种高效的、高选择性的生物催化剂，能在温和的条件下催化反应的进行， 并且可以回收反复利用，同时可避免通过使用重金属作为催化剂所带来的环境问 题；酶的种类繁多，可催化多种化学反应，已成为有机合成化学领域的项重要 进展，具有广阔的应用前景【lo 】。 许多药物均含有羟基，氨基，羧基等官能团，通过对其中一些官能团进行选 择性的修饰来制备前药的方法对药物的发展非常重要。但是对于含有多个相同或 相似官能团的药物来说，对其某一特定官能团进行结构修饰，用传统的化学方法 需要繁琐的保护和去保护方法，且有些反应条件苛刻，副反应多。而酶作为一种 7 浙江大学硕士毕业论文 选择性的催化剂被用于许多药学上重要化合物的合成中】。例如，s q 3 1 7 6 5 ( 1 ) 是一种重要的钙通道阻断剂( c a l c i u mc h a n n e lb l o c k e r ) ，可由取代的苯并氮杂卓2 ， 3 一二酮衍生物2 经生物催化法制备，鲑色诺卡氏菌( n o c a r d i as a l m o n i c o l o r ) 可以 对映体选择性地还原酮2 得到相应的醇3 ，后者经n 一烷基化可以得到s q 3 1 7 6 5 ( 图2 3 ) 1 2 1 。醇脱氢酶还可以方便地，选择性地还原的二羧酸中间体。氧化酶 a s 3 6 5 被广泛地用于许多治疗试剂的区域选择性的氢化中，包括重要的甾体衍生 物如氢化可的松等【l3 1 ，也可用在一种重要的降血糖药物一格列吡嗪中选择性地将 两个甲基中一个氧化为羧型1 4 o c a i c u mc h a n n e ib i o c k e r1 3 图2 - 3s q 31 7 6 5 对映体选择性还原 f i g 2 - 3e n a n t i o s e l e c t i v e l yr e d u c t i o no fs q 31 7 6 5 水解酶是生物催化反应中使用最多的一类酶，由它们所催化的水解反应及相 关逆反应如酯化、酰胺化等在药物合成中有着广泛应用，尤其是区域选择性和立 体选择性的酶促酰化在药物的发展中起着重要的作用，所得到的产物可以是最终 产物，也可以作为合成反应中的( 手性) 中间体【l o 】。例如，生物碱粟配精胺 ( c a s t a n o s p e r m i n e ) 是一个强的糖苷酶抑制剂，结构式如图2 4 ，具有抗癌和抗 h i v 的作用【l5 1 。据报导粟配精胺酰基衍生物具有更强的活性，它可以通过酶催化 的区域选择性酰化反应而制备。由于其含有四个化学性质相似的仲羟基，通过化 学方法区域选择性地酰化来制备比原药更有用的衍生物，需要繁琐的、多步的保 护和去保护过程；相比而言，s u b t i l i s i n 蛋白酶和c h r o m o b a c t e r i u mv i s c o s u m 脂肪酶 可以一步、高产率的酰化特殊的羟基位置，得到更具有活性的衍生物【16 1 。大量文 献报导了区域选择性的酶促酰化在核苷、氨基酸、抗生素以及天然产物等合成中 应用，以下对近十多年来的相关文献作一小结。 8 第二章酶促药物衍生化与氨基酸衍生物的研究现状 图2 4 粟配精胺 f i g 2 - 4c a s t a n o s p e r m i n e 2 1 2 核苷类药物的酶促衍生化 核苷类药物作为病毒类疾病的主要治疗药，近年来受到了广泛关注，特别是 拉米夫定、阿昔洛韦等高效低毒抗病毒药物的研制成功，为广大患者带来了福音。 尤其是许多嘌呤和嘧啶核苷类似物作为重要的抗癌药物，如氟尿嘧啶、阿糖胞苷 等药物对急性白血病、结肠癌、乳腺癌等有很好的疗效【l7 1 。然而，临床上使用的 核苷类药物仍然存在脂溶性差、生物利用度低、毒副作用大、耐药性等问题，另 外，诸多病毒类疾病如肝炎、艾滋病等仍缺乏有效的防治手段，这些都预示着抗 病毒药物的研究依然是当务之急1 8 】。因此，对该类药物结构类似物的合成及研究 开发已成为核苷类药物的一个主要研究方向。通过制备核苷前药可以改善其生物 利用度及药代动力学、靶向药物到特定病变部位、延长作用时间、降低毒副作用、 提高抗病毒及抗肿瘤效价和扩大抗病毒谱【1 9 1 。近年来，利用酶的高选择性，对含 有多官能团的核苷化合物进行结构修饰已成为生物催化的一个新的研究热点。 早在1 9 8 8 年，r i v a 掣2 0 1 首次报导了用枯草杆菌蛋白酶在d m f 中选择性酯化 腺苷和尿苷的伯羟基。枯草杆菌蛋白酶的反应活性和选择性随着酰化试剂和溶剂 的变化而得到提高。g o t o r 研究小组报导了脂肪酶催化的，以肟酯作为酰化试剂的 核苷类化合物的区域选择性酰化2 1 1 ，并对核苷类化合物衍生物的酶促合成作一综 述2 2 1 。他们首次对脂肪酶催化的无环核苷的酰化反应做了研究，制备了具有抗病 毒性质的喹诺酮无环核苷的前药1 2 3 1 。 嘌呤1 ( 5 0 6 u 7 8 ) 是一种抗自血病试剂，在二氧六环中通过选择性的酶促合 成制备得到的5 单酯具有更好的溶解性，可以增加生物可利用度，同时反应的转 化率可以高达9 9 【2 4 1 ，如图2 5 所示。该反应用化学方法很难实现，这是由于在 化学法中将优先酰化一n h 2 。 9 浙汀大学硕上毕业论文 ( , 5 0 s u r a ) 2 图2 5 酶促合成5 0 6 u 7 8 的单酯衍生物 f i g 2 - 5e n z y m a t i cs y n t h e s i so fm o n o e s t e rd e r i v a t i v e so f5 0 6 u 7 8 g o t o r 小组通过大量的酶和溶剂的筛选实现了在不同部位区域选择性的酯交 换反应。发现脂肪酶c a l b 在t h f 和二氧六环中对胸苷和腺苷的5 位伯羟基具有 选择性，而用p s l 酶在吡啶中对3 位具有很好的选择性【2 5 1 ，如图2 6 所示。当酰 化试剂和溶剂改变时，两种酶的选择性没有发生变化。n o z a k i 等1 2 6 用脂肪酶p s 和k w i 5 6 对5 一氟尿苷的3 位羟基进行酯化得到较好的产率，发现脂肪酶m 对2 7 位羟基具有特殊的选择性，而脂肪酶c a l 对伯羟基具有很好的选择性，对不同溶 剂的反应发现t h f 效果最好。 h 0 1阜 o + 丫乒r h o 鹈 r n a o r 口i o 醅o m 钉 图2 - 6 对2 7 脱氧核苷的选择性催化酯交换反应 f i g 2 - 6l i p a s ec a t a l y z e dr e g i o s e l e c t i v et r a n s e s t e r i f i c a t i o no f2 - d e o x y l n u c l e o s i d e 我们课题组也对核苷类化合物酶促酰化的选择性做了研究舱7 1 ，结果发现，在 同一种溶剂丙酮中，不同的酶具有不同的选择性，如图2 - 7 所示。m l i p o z y m e 催化剂2 一脱氧尿苷的酯化时，反应发生在核糖中c 57 的伯羟基上；而在猪胰脂肪酶 ( p p l ) 催化下，反应选择性发生在2 脱氧尿苷核糖中的仲羟基c 一3 上。进一步的 研究表明，在t 心和二氧六环中，c 一37 位的酯化也较好。 1 0 第二章酶促药物衍生化与氨基酸衍生物的研究现状 tlipozyjc00 c h = c h 2一 图2 7 酶促区域选择性合成2 ，- 脱氧尿苷3 和5 乙烯酯 f i g 2 - 7e n z y m a t i cr e g i o s e l e c t i v es y n t h e s i so f3 一a n d5 一0 一v i n y l2 - d e o x y n u c l e o s i d ee s t e r s 日本的t o k i w a j