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文档简介

Western Blot protocol主要试剂及缓冲液的配制1).30%丙烯酰胺:将29g丙烯酰胺和1g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。搅拌器帮助溶解,滤纸过滤除杂质,避光保存于4度冰箱。 2).10% SDS:称量10g十二烷基硫酸钠,加入80ml超纯水中,加热搅拌溶解,加水至100ml室温保存备用。3).10x蛋白电泳缓冲液:30.2gTris、188g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml 4).20转膜缓冲液:Tris 29g,Glycine 144g,SDS 2g 加水定容至1000ml配制1转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml,20transfer buffer 10ml,H2O 150ml)5).1.5M Tris 8.8: (注意温度对tris PH值的影响)18.15 g Tris 溶于80ml超纯水中,加浓盐酸调PH值8.8,定容至100ml。高温灭菌后室温保存。6).1M Tris 6.8:12.11g Tris 溶于80ml 超纯水,加浓盐酸调PH值6.8,定容至100ml。高温灭菌后室温保存。7). 10PBS: NaCl 80g,KCl 2g,Na2HPO4.12H2O 35.85g,KH2PO4 2.4g,用盐酸调PH至7.4,加水定容至1000ml8). 1xPBST(0.05% Tween 20): 10PBS 100ml,H2O 900ml, Tween 20 50ul9).10%(W/V)过硫酸铵:临时配,0.1g过硫酸铵溶于1ml 超纯水,4度冰箱保存3天10).丽春红染液储存液(0.1%(W/V)丽春红,5%(V/V)乙酸):,丽春红0.04g,冰醋酸2ml,超纯水 38ml11).封闭液:5%(W/V)脱脂奶粉溶于1X PBST 中,使用时现配。12) Stripping buffer (BME 800ul,SDS 2g,TRIS 0.756g,HCl调pH至6.7,加水定容至100ml)操作步骤1. 蛋白制备:10CM细胞平板,90%满度。弃培基,用5ml PBS清洗一遍,加入1 ml PBS用细胞刮将细胞挂下,移入2 ml EP管中,(将平板对光观察, 可以判断细胞刮下的完全度),可以用1ml PBS清洗一遍,将清洗液一并转入2ml EP管中。4000rmp离心1分钟。弃上清,以100ul PBS重悬沉淀,加入100ul 2loading buffer。将EP管置于金属浴中99处理10min(热处理管盖会崩开,在管盖上压一个重物)。置于冰上准备上样,或是-20度保存。按照之前的蛋白定量结果,10cm平板大约能提取450-600ug蛋白。2. 配胶和上样电泳1).配胶前先将玻璃板、梳子和电泳仪等洗干净,并将玻璃板晾干。2). 根据所检测蛋白的大小并参照表1选择丙烯酰胺的浓度,再根据表2配方配制分离胶。配制分离胶时要混合均匀并缓慢加入玻璃板里,注意分离胶与加样孔底间要留出1cm左右积层胶,用异丙醇封胶面。表1丙烯酰胺浓度(%)线性分离范围(kD) 1512-431016-687.536-94557-212胶浓度试剂表2 (一块胶的用量)分离胶积层胶8%10%12%15%5%ddH2O2.271.931.61.11.4030% PAGE1.331.672.02.50.33Tris.HCl1.3(1.5M tris 8.8)0.25(1 M tris 6.8)10%SDS0.050.0210% AP0.050.02TEMED0.0050.002总体积5ml2ml待分离胶凝后(约需15-30min,根据室内温度),倒掉ddH2O后,用滤纸条吸干水分。参照表2配制积层胶,到积层胶时尽量倒满(如果有些漏要及时补胶),插梳子前保证梳子的清洁。拔梳前,需要用刀片沿梳和玻板间隙划一次以除去玻璃板外的胶。待积层胶凝固后拔掉梳子,这时,若发现有上样孔歪斜,可以用注射器针头将上样孔调整好,之后将胶版装上电泳槽后,加上电泳缓冲液后待用,清洗时避免槽间隔异位。3). 样品上样:蛋白样品临上样前,13000rpm、1分钟高速离心,上样时取上清。80V电压跑浓缩胶,120V跑分离胶。参考marker条带,到相应位置时停止电泳。 上样品左右两边如果有空余泳道,可加等体积的1上样缓冲液,这样跑出来的胶好看。2.转膜(半干转,整个操作中戴手套,不要用手触膜)在电泳过程中,剪好与分离胶等大的滤纸10张和PVDF膜1张(国产电泳仪分离胶大小约为8.5cm5.5cm);配transfer buffer (20 ml 5transfer buffer,20ml甲醇,加水至100ml);先在容器中加入适量甲醇,放入PVDF膜(可切角帮助标记正反面),浸泡30s-1min后转移到转膜液中待用。然后将PVDF膜和滤纸每五张一起叠放整齐并在transfer buffer中浸透(保证中间无气泡)。打开电转仪,碳板要擦洗干净,可减低背景。在准备转膜的部位倒少量transfer buffer,把浸透的五张滤纸从中间慢慢覆盖到碳板上,并用少量transfer buffer湿润。电泳结束后,小心地将两块玻璃板分开,注意不能使胶有破损或变形,在胶的中间部分倒少量transfer buffer,将PVDF膜从中间慢慢覆盖到胶上(这样不容易产生气泡)。然后将边缘多余的胶(包括积层胶)切去,在预先放好的五张滤纸上再倒少量transfer buffer,然后膜在下、胶在上,放置在五张滤纸上。然后再在胶上倒少量transfer buffer,将另五张浸透的滤纸慢慢地从中间覆盖到胶上(滤纸、胶和膜的放置顺序如下图),如同时转两张膜,则可在第一块胶上铺十张滤纸,后再加第二块膜、胶和五张滤纸,操作同上。盖上转膜仪盖子,设置时间等,开始转膜,12V、48min。滤纸 5张胶PVDF膜滤纸 5张上下3. 丽春红染色:(初学者建议保留这一步,熟练后这一步可省略)转膜结束后,取出 PVDF膜,用甲醇浸泡后待甲醇挥发干、用铅笔标记出marker的位置。水洗一下,丽春红染色5min以确认蛋白是否有效地从胶转移到了膜上(丽春红可以与膜上的所有蛋白结合、但不会干扰特异蛋白随后与抗体的反应,而氨基黑与蛋白的结合则不可逆。也可以将胶用考马斯亮蓝染色,看胶上的蛋白是否已经完全转到了膜上) 。染色5min后水洗1-2次至出现较清晰的条带,拍照留存。拍照后可用水洗膜,直至红色消失。封闭:配5ml 1PBS (PBST)+ 0.25g脱脂奶粉的封闭液,待丽春红染色后,用水漂洗膜后,再用1PBST漂洗。封闭:TBST淋湿转膜下来的PVDF膜,摇床上封闭液室温封闭1h。5. 一抗孵育用PBST(封闭液)稀释一抗(PBS需要高压灭菌。抗体稀释倍数按照抗体说明书,一般abgent公司的一抗1:1000稀释后用来做),待封闭完成后,用PBST漂洗两次。孵育抗体,具体步骤如下:在培养板的板盖上铺一张大小适中的封口膜,将抗体滴加在封口膜的一端,镊子取出PVDF膜,在吸水纸上停留一会,之后正面向下,PVDF膜一端接触抗体后,慢慢盖向另一端。注意不能有气泡。之后再向膜上加少许抗体液。盖上盖子,水平置于4冰箱中,孵育过夜。一抗可回收,重复使用,一般3-5天内效果无妨。6. 二抗孵育按1:2000的比例稀释二抗(羊抗鼠或是羊抗兔)。先于摇床上PBST洗膜3次,每次10 分钟。用相

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