（基础兽医学专业论文）鸡、猪、牛bpi活性部位基因的克隆和序列分析.pdf

摘要本实验选取莱航鸡、长白猪、荷斯坦奶牛三种动物为研究对象，运用分子克隆技术，分别对这三种动物杀菌通透性增加蛋白( b p i ) 的n 端活性部位基因进行克隆和序列分析。为进一步了解鸡、猪、牛b p i 基因的生物学功能、研制开发防治g n b 感染性疫病的重组b p i 生物制剂提供科学的理论基础。实验结果如下： p m n s 及其r n a 的提取采用密度梯度离心法，分离出猪、牛嗜中性粒细胞( p m n s ) ，并将此法加以改进，成功地分离鸡p m n s 。实验表明，三种动物鸡、猪、牛的p m n s 浮力密度分别为1 0 8 5 1 0 9 0g m l 、1 0 8 0 1 0 8 5g m l 、1 0 8 0 1 0 8 6g m l 一。应用t r i z o lr e a g e n t 试剂盒抽提r n a 法，对三种动物的p m n s 进行r n a 抽提，经2 o 琼脂糖凝胶电泳后出现2 8 s 和1 8 sr n a 两条清晰的条带，说明所提r n a的完整性可用于r t p c r 扩增；分光光度计检测其r n a 在2 6 0 n m 和2 8 0 h m 时的0 d值，计算鸡、猪、牛r n ao d 2 6 0 0 d 2 8 0 值分别为1 8 、1 7 、1 9 。实验所得r n a纯度很高，满足实验要求。2 引物设计与r t - p o r 扩增根据g e n b a n k 中登录的鸡、猪、牛b p in 端基因序列，自行设计了三对引物( 鸡：p 15 c g 驻坐缱幽g c t g g c a a g g t c t g g a g g3 ，p 25 a t a a g aa t 堡堡堡堡g c c g g g a c c a c g g a t3 1 ：猪：p 35 g c g t c g a c a t g a c t t t g a c c tg a g t g t g g a g g3 ，p 45 c g a a g c t t c a g g c t g c t g c c g g a c g t3 ；牛：p 55 a c c a a cc c t g g c a t t g t c3 p 65 a g a c t c g a t t c g t t t g c g3 ) 。在引物p 1 、p 2 的5 端设计了e c o ri 、n o ti 酶切位点和相应的保护碱基，以便于对鸡b p i 基因进行定向克隆和鉴定。运用反转录聚合酶链式反应( r t p c r ) 技术，首先反转录合成鸡、猪、牛b p i 基因的c d n a 第一链，然后p c r 扩增c d n a 。电泳结果显示三种动物的b p i 基因r t p c r 产物分别约在2 8 0 b p 、1 4 0 b p 、5 0 0 b p 处出现特异性条带。3 鸡b p l 基因的克隆及鉴定将鸡b p i 基因的r t p c r 产物纯化，插入到克隆载体p m d 一1 8 的多克隆位点中，构建重组质粒p m d 一1 8 一b p i ，转化大肠杆菌d h 5a ，a m p 抗性筛选，得到阳性克隆质粒。并将该阳性克隆质粒进行p c r 鉴定，电泳得到约2 8 0 b p 大小的特异性条带；为进一步确定外源基因的存在，将初步怀疑为的阳性克隆质粒用e c o ri 、n o ti 进行双酶切鉴定，电泳结果显示，获得了预期大小( 2 8 4 b p ) 的基因片段：说明b p i 基因已插入p m d 一1 8 ，重组质粒构建成功。4b p i 基因的序列测定与分析将鉴定后的鸡阳性克隆质粒p m d - 1 8 一b p i 和猪、牛b p i 基因的r t p c r 产物测序。测序结果显示：从鸡p m n s 的r n a 中扩增获得了大小约为2 8 4 b p 的b p in 基因片段；从猪p g i q s 的r n a 中扩增获得了大小约为1 4 4 b p 的b p in 基因片段；从牛p m n s 的r n a 中扩增获得了大小约为5 0 0 b p 的b p in 端基因片段。将测定的序列结果进行b l a s t ，比对结果显示：鸡b p i 基因序列与报道序列基本一致，有三个碱基发生突变；猪b p i 基因序列与报道序列一致；牛b p i 基因序列与报道的有两个发生突变；而三种动物b p i 的氨基酸序列都分别同报道的氨基酸序列完全一致。运用d n h s t a r 分析软件对实验所得目的基因片段序列进行分析，结果表明猪、牛b p in 端基因序列同源性达到了8 6 ，氨基酸列同源性达到了7 5 ；而鸡b pi n 端氨基酸序列与猪、牛b p in 端氨基酸序列同源性很低。以上结果表明：本实验依据哺乳动物p m n s 密度梯度离心的提取方法，在提取猪、牛p m n s 的基础上，将分离液的密度梯度加以改变，提取了鸡p m n s 本实验成功的克隆出鸡、猪、牛b p in 端部分基因序列。关键词：杀菌通透性增加蛋白鸡猪牛克隆鉴定序列分析g e n ec l o n i n ga n ds e q u e n c i n go ff u n c t i o n a ld o m a i no fb a c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t yi n c r e a s i n gp r o t e i n si nc h i c k e n ，p i ga n dc o wt h el a in a v i g a t i o nc h i c k e n ，t h el a n d r a c e ，t h ed u t c hs t a nc o ww e r ec h o o s e da se x p e r i m e n ta n i m a l s ，m o l e c u l a rc l o n et e c h n o l o g yw a sa d o p t e dt oc a r r yo nt h ec l o n e ，a n dt h es e q u e n c ed e t e r m i n a t i o na n da n a l y s i so fn - t e r m i n a la c t i v es i t e so fb p ii nt h r e ek i n d so fa n i m a l s t h e s ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sp r o v i d et h es c i e n t i f i ct h e o r ya n df o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo fb i o l o g yf u n c t i o no fb p ig e n ei nc h i c k e n ，p i ga n dc o w , a n dt h ed e v e l o p m e n to fr e c o m b i n a n tb i o l o g yp r e p a r a t i o nw h i c hp r e v e n t sg n bi n f e c t i o u sd e s e a s e s 1e x t r a c ti o no fp m n sa n dr n at h ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g ew a su s e dt os e p a r a t en e u t r o p h i lg r a n u l a rc e l l( p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ，p m n s ) o ft h ep i ga n dt h ec o w ，a tt h es a m et i m e ，t h ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g ep r o c e s sw a si m p r o v e dt os e p a r a t es u c c e s s f u l l yp m n so fc h i c k e n ；t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h eb u o y a n c yd e n s i t yo fp m n si nc h i c k e n ，p i g ，c o ww a sr e p e c t i v e l y1 0 8 5 1 0 9 0 ，1 0 8 0 - 1 0 8 5 ，1 0 8 0 - 1 0 8 6 t r i z o lr e a g e n tw a sa d o p t e dt oe x t r a c tt h er n ao fp m n s ，2 8 sa n d18 sr n ab a n d sw e r ef o u n db y2 0 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s i ti n s t a t e dt h a te x t r a c t e dr n aw a sw h o l ea n dm e e t e dt h en e e do fr t - p c re x t e n s i o n ；t h eo dv a l u e so fa l lr n a sa tw a v e l e n g h so f2 6 0 r i ma n d2 8 0 n mw e r ed e t e r m i n a t e db ys p e c t r o p h o t o m e t e r ，t h er a t i ob e t w e e nt h er e a d i n g sa t2 6 0 n ma n d2 8 0 n m ( o d 2 6 0 0 d 2 8 0 ) w a sr e s p e c t i v e l y1 8 ，1 7 ，1 9 t h er e s u l ts u g g e s t e dt h ep u r i t yo fo b t a i n e dr n aw a sv e r y h i g ha n ds a t i s f i e dt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t 2p r i m e rd e s i g na n dr t p c re x t e n s i o na c c o r d i n gt ot h eg e n e s e q u e n c eo fb p io ft h ec h i c k e n ，t h ep i ga n dc o ww h i c hr e g i s t e r e di ng e n b a n k ，t h r e ep a i r so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e dr e s p e c t i v e ly ( c h i c k e n ：p 15 c g 堡趔旦要a t g c t g g c a a g g t c t g g a g g3 ，p 25 a ta a g a a t 堡鱼堡垒c c g g g a c c a c g g a t3 ；p i g ：p 3 g c g t c g a c a t g a c tt t g a c c t g a g t g t g g a g g37 p 45 g a a g c t t c a g g c t g c t g c c g g a c g t3 ；c o w ：p 55 a c c a a c c c t g g c a t t g t c3 p 65 a g a c t c g a t t c g t t tg c g37 ) f o rt h ep u r p o s eo ft h ed i r e c t i o n a lc l o n ea n dt h ea p p r a i s a lo fb p i ，eo ria n dn o tis i t e sa n dt h ec o r r e s p o n d i n gp r o t e c t i o nb a s i cg r o u pw e r ed e s i gn e da t57 t e r m i n a lo fp 1 p 2 r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ni i( r t - p c r ) w a sf i r s t l ya d o p t e dt os y n t h e s i z et h ef i r s tc h a i no fc d n ao fb p ig en ei nt h ec h i c k e n ，t h ep i g ，a n dt h ec o w , t h e nc d n aw a se x t e n d e db yp c r th ee l e c t r o p h o r e s i sw a su s e dt oa n a l y s et h er t - p c rp r o d u c t so fb p ig e n e ，r e su l t ss h o w e dt h a tt h es p e c i f i cb a n d sw e r ef o u n di n2 8 0 b p ，1 4 0 b p ，5 0 0 b p 3c i o n ea n dt h ei d e n t f i c a t i o no fb p lg e n ei nc h i c k e nr t - p c rp r o d u c t so fb p ig e n ei nc h i c k e nw e r ep u r i f i e d ，t h e nw e r ei n s e r t e dt om u l t i p l ec l o n i n gs i t e so fp m d 1 8r f l a s m i dv e c t o r , f o r m e dr e c o m b i n a n to m d 1 8 b p ip l a s m i d ，w h i c hw a st r a n s f o r m e dt oe c o l id h 5 a ，p o s i t i v ec l o n ep l a s m i dw a ss c r e e n e dw i t l la m pr e s i s t a n c es c r e e n i n g i no r d e rt oc o n f i r mt h ep r e s e n c eo ff o r e i g ng e n e p o s i t i v er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si d e n t i f i e d 、v i t l le c o ri n o tid o u b l ee n z y m ec u tr i n g ，t h ee l e c t r o p h o r e s i sr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ea n t i c i p a t e ds i z ef 2 8 4 b p ) g e n ef r a g m e n tw a so b t a i n e d ；a n dw a sa p p r a i s e db yp c s p e c i f i cb a n da b o u tt h e2 8 0 b ps i z ew a sf o u n dw i t ht h ee l e c t r o p h o r e s i s t h e s er e s u l t ss t r o n g l ys u g g e s t e dt h a tt h eb p ig e n ew a si n s e r t e dt op m d 一1 8p l a s m i d sa n dr e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 4s e q u e n c ed e t e r m i n a t i o na n da n a l y s iso fb p lg e n et h er e c o m b i n a n tp l a s m i d ( p m d - 1 8 - b p i ) o f c h i c k e na n dr t - p c r p r o d u c t so f t h eb p ig e n eo fp i ga n dc o ww e r ea l ls e q u e n c e d t h ed a t ao b t a i n e ds u g g e s t e dt h a tt h en - t e r m i n a lg e n ef r a g m e n t so fb p lw h i c hw e r ee x t e n d e df r o mr n ao fp m n si na l lt e s t e da n i m a l sw e r eo b t a i n e d ，b u tt h es i z eo ff r a g m e n t sw a sd i f f e r e n t ，a b o u t2 8 4 b p ，1 4 4 b p ，a n d5 0 0 b pw a sr e s p e c t i v e l yf o u n di nc h i c k e n ，p i ga n dc o w t h ed e t e r m i n e ds e q u e n c er e s u l t sw e r ea n a l y s e dw i t hb l a st ，r e s u l t ss h o w e dt h a tt h r e eb a s i cg r o u p sm u t a t e di nc h i c k e n t w ob a s i cg r o u p sm u t a t e di ne , o wa n dt h er e s tw a sc o n s i s t e n tw i t l lt h o s eo ft h er e p o r t s ，n om u t a t i o nw a sf o u n di np i g b u tb p ia m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h r e ek i n d so fa n i m a l sw a sr e s p e c t i v e l yc o n s i s t e n tw i t ht h a to ft h er e p o r t s n ed n a s t a ra n a l y s i ss o f t w a r ew a sa d o p t e dt oa n a l y s eo b t a i n e dg e n ef r a g m e n t s ，r e s u l t ss h o w e dt h a th o m o l o g yo fn t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c eo fb p ib e t w e e nt h ep i ga n dt h ec o ww a s8 6 a n d7 5 ，b u ta m o n gt h ec h i c k e n ，t h ep i ga n dt h ec o ww a sv e r yl o w t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tp m n si nc h i c k e nb es u c c e s s f u l l ye x t r a c t e dw i t hi m p r o v e dd e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g e ；a n dn - 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b a s e p a i r千碱基对l u r i a 。b e r t a n il b 培养基l a c t o s ez ( z - 半乳糖苷酶基因l i p o p o l y s a c c h a r i d e ! b i n d i n gp r o t e i n脂多糖，内毒素m i n u t er a i nm i l l i g r a m毫克m i l l i l i t e r毫升n a n o g r a m纳克o p t i c a ld e n s i t y光密度r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s e逆转录聚合酶链反应c h a i nr e a t i o np d b o n u c l e o f i d ea c i d核糖核酸r i b o s o m en u c l e o t a s ei n h i b i t o rr n a 酶抑制剂r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e每r a i n 转数s e c o n d秒vt r i suu lt r i m y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n eu n i tm i c r o l i t e r三羟甲基氨基甲烷单位微升困独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名么丛时间：勿帕年月乃日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：第一导师签名丝净辱时间：力一苫年月够日时间：2 砷占年6 月巧日文献综述在抗微生物感染中，嗜中性粒细胞( p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ，p m n s )起着重要的作用，内含多种抗菌物质，现已从p m n s 嗜天青颗粒中，分离出多种抗菌蛋白质，其中以杀菌通透性增加蛋白( b e c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t y i n c r e a s i n gpr o t e i n ，b p i ) 的研究最为瞩目【1 1 。b p i 占其细胞总蛋白的o 5 - - 1 ，在粒细胞分化的早幼粒阶段合成并储存于胞浆颗粒中，也微量存在于细胞表面。随着进一步的研究发现，参与变态反应和寄生虫感染的嗜酸性粒细胞其胞浆嗜酸性颗粒中也含有b p i 。最近，t a k a h a s h i 和l e v y 等【2 。3 j 分别在人及小鼠的皮肤和黏膜上皮细胞发现b p i 的存在，同时证明在b p i 发囊和黏膜上皮抗感染的过程中起着重要作用。b p i 的分子量为5 5 k d ，由4 5 6 个氨基酸所组成：与l p s 的类脂a 具有高度亲和力，能识别结合并能中和光滑型l p s 以及类脂a ，它可能代表了一种内生型l p s 调节分子，下调机体对l p s 的应答反应，具有强大的杀灭革兰氏阴性菌g n b ( g r a mn e g a t i v eb a c t e r i u m ) 、中和内毒素的功能。结构上b p i 与l p s 结合蛋白( 1 i p 叩0 1 y s a c c h a r i d eb i n d i n gp r o t e i n l b p ) 具有极高的同源性，b p i 和l b p 氨基酸序列有4 5 的同源性f 4 ，均由4 5 6 个氨基酸组成，同属l p s 结合蛋白家族。l b p 是由肝脏合成的急性时相反应蛋白，主要存在于循环血液中。二者n 端均能与l p s 的类脂a 结合，但b p i 与l p s 的亲和力比l b p 与l p s 的亲和力高5 0 7 0 倍【5 j ，l b p 的c 端能将l p s 转运到宿主细胞的l p s 受体上。尽管两种蛋白结构特征相似，但作用却相互拮抗，b p i 与l p s 结合后，能抑制l p s 活化单核细胞、巨噬细胞和p m n s 等效应细胞表面c d l 4 分子，阻断信号向细胞内的传导，而l b p 与l p s 的结合则提高l p s 在效应细胞中的活性，促进l p s 信号向细胞内的传导【6 j 。l p s 最终的生理效应取决于这两种内毒素结合蛋白在组织中的相对浓度( 图1 ) 。圜l p sl b p l p s一+b p i 一瓣b p i 几p sj lf i gis c h e m a t i cs h o w i n g t h ed i f f e r e n te f f e c t so f l b pa n d b p io n t h e l p s - i n d u c e d i n f l a m m a t o r yc a s c a d eb p i 三维结构显示，整个分子由平面对称的n 端结构域和c 端结构域形成“回飞棒”状结构，分子中由多个氨基酸构成的疏水口袋正好与l p s 类脂a 结合。业已证实，重组的完整蛋白和2 3 k d 蛋白能成功地保护志愿者免遭内毒素的攻击，试验动物免受g n b 的感染，而且能增加g n b 细菌细胞壁的通透性，导致细菌死亡 7 1 。这为研制既有抗菌作用又有中和内毒素功能的畜禽内源性多肽开辟了崭新的一页。重组b p l 2 1 和b p l 2 3 在i i 期临床研究中显示良好的效果，对创伤后出血性休克，部分肝切除肠源性内毒素移位，感染性休克等有较好的治疗作用，在脑膜炎脓毒症患儿的临床试验中，死亡率比预计的低的多 8 1 。b p i 作为一种“超级抗生素”被认为是一种存在巨大潜力的抗内毒素和g n b 感染的药物，已成为研究的热点。1 嗜中性多形核粒细胞( p m n s ) 与内源性抗菌肽p m n s 在宿主抗御病原微生物( 尤其是细菌) 入侵的防御过程中起着十分重要的作用。病原菌侵入机体后，p m n s 能够向感染灶移动和聚集，将其吞噬包绕形成吞噬泡，再通过氧依赖和非氧依赖的途径杀灭来犯细菌。氧依赖的抗菌机制是通过氧化剂发挥作用来完成，而非氧依赖的抗菌机制则依赖于吞噬过程q b p m n s的多种能阻止病原菌增殖并能将其有效杀灭的细胞毒性抗菌蛋白和肽的释放来实现。p m n s 在吞噬g n b 的过程中，释放的细胞毒性抗菌肽能阻止细菌的增殖，改变外膜，使对正常情况下不能通过细胞壁的疏水小分子的通透性增加，p m n s匀浆及其提取物均具有这种作用。这些发现促使人们对p m n s 中具有杀灭大肠杆菌f e s c h e r i c h i a c o l i ，e c o l i ) 等g n b 并使通透性增加的成分进行深入研究，进而从人和兔p m n s 中分离, h q , b p i n 。除专职的吞噬细胞外，编码抗菌多肽的基因也表达于其它细胞。近来发现胃肠道和呼吸道上皮细胞也能产生数种与p m n s 种多肽密切相关的蛋白，并能够参与机体的防御功能，尽管上皮细胞这些基因产物的生物学作用尚未明确，但人们普遍认为这些内源性抗菌肽很可能在加强宿主上皮屏障抗御微生物侵袭中起着重要作用【l0 。对哺乳动物p m n s 研究发现，p q s 能产生多种广谱、具有抗病原微生物的内源性抗菌蛋白，这些多肽包括：分子量约3k d 的多肽，如、b 防御素以及c a t h c l i c i t h i n s 的抗菌片段；小分子蛋白，如p 1 5 s 、溶菌酶以及某些分子量为1 4 k d a 的磷脂酶a 2 ；较大蛋白，如分子量约3 0 k d 的某些蛋白酶及其类似物a z u r o c i d i n c a p 3 7 ：5 5 k d 的b p i 。这些抗菌蛋白共同作用，以消除入侵的病原微生物。国际上b p i 的研究正方兴未艾，倍受人们的关注与重视，目前美国f d a 已批准r b p l 2 l r b p l 2 3 进行扩大的期临床实验。b p i 的发现及其应用，为人类战胜c 烈b 引起的严重感染性疾病带来了新的希望。2 杀菌通透性增加蛋白( b p i ) 的分布及特点1 9 7 8 年w e i s s 等i l l 】从健康人和慢性粒细胞白血病患者的p m n s 种提取得到2天然b p l 分子( n b p l 5 5 ) ，次年e l s b a c h 等【1 2 】从兔p m n s 中分离到b p i 。郑江、周红等【1 3 1 从猪p m n s 中提取并纯化得到b p i 。b p i 的等电点为p h 9 8 ，表观分子量为5 5 k d ，纯化的蛋白对数株e c o l i 、伤寒沙门菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素d 得以穿过细胞壁而进入菌体，故而得名。b p i 得杀菌和通透性增强活性在p h 7 0 时最大，m 9 2 + 、c a 2 + 肝素能抑制其活性，8 0o c 力n 热l o m i n 可灭活。人和某些哺乳动物得b p i 定位于胞浆颗粒中，对血细胞得研究表明b p i 主要存在于p m n s 中，为p m n s的主要抗菌成分，占其总蛋白的0 5 1 ，在粒细胞分化的早幼粒阶段合成并主要储存于胞浆初级颗粒中，b p i 基因在p m n s 细胞表面也有表达【1 4 1 。这种细胞定位可能与其在细胞膜表面的功能密切相关。b p i 对g n b 具有杀灭作用，编码基因位于第2 0 条染色体，介于q 1 1 ，2 3 和q 1 2 之间 1 5 】，其表达限定在粒细胞前体中。b p i 被蛋白酶水解后，裂解为2 5 k d 的n 一末端和3 0 k d 的c 一末端。b p i的c 一末端与抗菌活性无关，研究发现c 一末端能促进外周血自细胞摄取e c o l i ，后者通过结合b p in 一末端而发挥抗菌作用【1 6 。细胞中b p i 的平均含量约6 5 士6 9 9 1 0 8 b p n i ”l ，推测全白细胞含量为5 x 1 0 。m l ，则b p i 的含量为3 2 9 9 m l 血液。因为通常b p i 储存在p m n s 细胞中，在血浆中的含量很低( o 2 2 1 n g m l 血浆) ，血清中b p i 的含量( 4 9 7 2 1 n g m l血清) 比血浆含量高3 7 倍，表明在血液凝固过程中从p m n s 细胞中释放出b p i ，量约为1 。这种b p i 的释放也许无生理意义，但最近的研究支持体内血凝过程中b p i 的释放( 可能有其它物质的释放) ，是对创伤或损伤的一种反应，b p i 在损伤局部起到抗菌作用1 1 。b p i 在体内的存在方式与其功能范围有密切的关系，m a r r a 认为b p i 主要在p m n s 膜表面发挥作用，而不释放入血；d e n t e n c e r 研究则认为b p i 在病理情况下释放入血，并在细胞外发挥作用【珀1 。c a l a f a t 等【2 伽研究发现参与变态反应和寄生虫感染的嗜酸性粒细胞其胞浆嗜酸性颗粒也含有b p i ，应用免疫电镜研究发现b p i 定位于未成熟和成熟嗜酸性粒细胞。嗜酸性粒细胞b p i 含量为1 7 9 n g 5 x 1 0 6 个细胞，低于p m n s 含：l ( 7 1 0 n g 1 0 6 1 。嗜酸性粒细胞中b p i 的存在表明嗜酸性粒细胞参加宿主对g n b 入侵的防御作用，同时也表明b p i可能具有抗御寄生虫感染的作用。3b p i 的结构天然b p l 分子由4 5 6 个氨基酸残基组成，成熟b p l 分子n 端带有一段由3 1个氨基酸残基组成的疏水信号肽。b p l 分子最显著的特点是一级结构内带电残基的不对称分布：n 端的碱性氨基酸残基比酸性氨基酸残基多1 6 个( 2 8 个赖氨酸精氨酸，1 2 个天冬氨酸谷氨酸) ，而c 端则含有2 0 个碱性氨基酸残基和2 2 个酸性氨基酸残基，略显酸性。两者之间为一亲水、富含脯氨酸的蛋白敏感区，该区将具有杀菌功能的n 端与具有膜锚定功能的c 端连接起来。经蛋白酶水解后n b p l 5 5 可裂解为2 个片段，即2 5 k d 的n 端( n b p l 2 5 ) 具有n b p l 2 5 杀菌和中和内毒素的活性。b p l 分子电荷的不对称分别使得带正电荷的n 端能够促进b p i 与g n b细胞壁上带负电荷的l p s 之间的静电作用口”。幽2b p l 分于结橱f i 9 2t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f b p ip r o t e i n运用x 一线晶体衍射技术，b e a m e r 等口2 1 人获得了b p l 分子的晶体结构f 图2 ) 。整个分子呈罕见的“回飞棒”状，大小约为1 3 5 3 5 x 3 5 n m ，由两个大小相似的结构域( n 端和c 端结构域) 组成，其中n 端含有脯氨酸的2 1 肽相连。b p i 两个结构区均含有两个n - 螺旋和一个高度扭曲的反向b 折叠，蛋白分子中部则由两端结构区起始部位残基之间所形成的一个较小的反向b 折叠相连。两个结构域形成3个结构单元，每个结构域的末端为环状，两个环之间的b 折叠形成一个界面，两个结构域的二级结构和局部也相似，提示该蛋白存在假二倍对称。整个b p l 分子结构同已知的其它蛋白结构不同，是一种新型的蛋白折叠方式 2 3 】。b p l 分子每端( n 端的1 0 1 9 3 a a 残基和c 端的2 6 0 4 2 1 a a 残基) 均含有三个相同的c 端结构域成分称为螺旋a 、折叠b ( 图3 ) 。在每个结构域内，长螺旋位于折叠c o o h囤3 拉长的b p i 假对称示意图f i g3s c h e m a t i cd i a g r a mo f b p is h o w i n g t h ee l o n g a t e ds h a p ea n de m p h a s i z i n g i t sp s e u d o s y m m e t r y e l e m e n t so ft h en h 2 - t e r m i n a ld o m a i n ( r e s i d u e s1 - 2 2 9 ) a r es h o w ni ng r a y ，a n dt h ec o o h - t e r m i n a ld o m a i n ( r e s i d u e s2 5 1 - 4 5 6 ) i nb l a c ks t r a n d sa r e i n d i c a t e d b ya r r o w sa n d h e l i c e s a r es h o w n r e c t a n g l e s的凹面，螺旋轴与p - 折叠股形成约6 0 。角。b p l 分子中由c y s l 3 5 和c y s ”所形成的二硫键将螺旋b 锚定于折叠n 的最后一股，位于n 端和c 端两个环之间为一扭曲的、7 股反向平行d 折叠结构，其中4 股来自n 端，3 股来自c 端。中部折叠结构成两个结构域之间的界面，提示存在着几个由3 - 折叠股间的氢键所稳定的二聚体界面。b p i 的两个结构域结构上的相重合，二者均与其它蛋白的折叠方式无相似之处，结构排列分析也未发现其与任一己知的折叠方式相匹配。两个重合结构域之间的显著差异在于n 端结构域上含第4 5 、9 6 位残基的环和c 端结构域上含第2 8 0 、3 4 8 位残基的环，由于n 端结构域第4 5 位和第9 6 位残基附近的环与l p s结合及其杀菌活性有关，故这些差异对其功能十分重要。两个结构域不仅缺乏序列上的同一性( r b p i r b p l 2 l 。上述结果揭示b p i 对细菌细胞膜具有相似的细胞毒作用。近三十年来，人们对b p i 的天然蛋白及其基因工程重组蛋白已经进行了较系统的理论和应用研究，除了用于治疗g n b 感染性疾病外，还开发出一系歹i j b p i 衍生肽，如抗真菌药，抗血管形成类药等；最近，a l e x a n d e r 等h 4 谰腺病毒介导的b p i转基因小鼠模型体内外实验均显示腺病毒为载体的重组b p i 介导的基因转化可进行细胞外分泌，分泌蛋白b p i 能有效中和l p s ，并且减少致炎细胞因子t n f 2 a 和巨噬细胞炎症蛋白2 的产生。国内，第三军医学者周红、肖光夏等开展了b p i 功能区结构模拟肽的分子设计、筛选和鉴定【l3 】工作，得到了1 个具有强效杀菌和中和内毒索活性的模拟肽分子 4 5 1 ，该课题组还进行了对猪源b p i 在大白鼠内毒索血症、脓毒血症、烧伤脓毒血症模型上的体内、体外生物活性的实验，研究表明：b p i 对内毒素血症及脓毒血症大鼠具有明显的保护作用，说明猪源b p i 的体内、体外生物活性是一致的【l 引。为了延长r b p l 2 3 在体内的半衰期，军事医学科学院微生物流行病研究所徐俊杰等已完成了重组b p l 2 3 - f m 1 融合蛋白在c h o 细胞中的表达t 4 6 1 ，第四军医大学马越云等完成t i g gf a b b p i 融合蛋白真核表达载体的构建及其在c h o 细胞中的表达【4 ”，首都医科大学则进行t b n f e 一1 重组融合蛋白表达载体的构建及其在e c o l i 中的表达【4 引。综上所述，具有杀菌、中和内毒素、抗真菌、中和肝素等多种生物学活性的b p i ，作为具有良好的应用前景内源性抗菌蛋白，人们相信b p i 在治疗危机生命的严重感染中将起到积极的促进作用；随着科技的发展和越来越多的学者参与到研究b p i 的队伍中来，b p i 的神秘面纱也终会被揭开。1 0引言1 1 研究的目的和意义目前，由革兰氏阴性菌( c r a mn e g a t i v eb a c t e r i u m ，g n b ) 弓i 起伴有严重内毒素血症的畜禽临床感染性疾病日益严重，加之盲目滥用抗菌药物导致耐药性的产生，使得此类疫病防治呈现难以控制的局面1 4 9 , 5 0 1 。因此寻找特异杀灭g n b 并中和内毒素的有效防治措施一直是关注的焦点。有关g n b 感染介导发生内毒素血症的防治，从抗血清、抗类脂a 单抗、多种抗细胞因子抗体到n o 合成酶抑制剂已进行广泛的研究，仍无特效方法口1 1 。近年来，随着内毒素血症发病机理的研究深入，发现存在人和动物嗜中性多形核粒细胞( p o l y m o r p h o