分子生物学许晓东.ppt

2染色体与DNA,2.1染色体,2.1.1染色体概述,染色体(chromosome)是细胞核中载有遗传信息的物质，在显微镜下呈丝状或棒状，由核酸和蛋白质组成，在细胞发生有丝分裂时期容易被碱性染料着色，因此而得名。同一物种内每条染色体所带DNA的量是一定的，但不同染色体或不同种中间变化很大。,原核细胞染色体外裹着稀疏的蛋白质，其中一部分与DNA的折叠有关，另一些则参与DNA复制、重组及转录过程。真核细胞的染色体中，DNA与蛋白质完全融合在一起，其蛋白质与相应DNA的质量比约为2:1.,人类染色体显微结构图,19Mb210genes,240Mb,3453genes,2.1.2真核细胞染色体的组成,1.蛋白质,包括组蛋白和非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。,组成：DNA，组蛋白，非组蛋白，RNA,富含赖氨酸和精氨酸,组蛋白的特性1.进化上的极端保守性特别是H3、H4，牛、猪、大鼠的H4完全相同2.无组织特异性仅发现两个例外（鸟鱼两栖红细胞H1-H5，精细胞鱼精蛋白）3.肽链上氨基酸分布的不对称性N端碱性氨基酸C端疏水氨基酸4.组蛋白的修饰作用甲基化、乙酰化、磷酸化、ADP核糖基化等5.富含赖氨酸的组蛋白H5只存在于鸟类、两栖类等含有细胞核的红细胞中非组蛋白（含量约为组蛋白的60-70%）包括酶类和细胞分裂有关的蛋白（收缩蛋白、骨架蛋白、核孔复合物蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白）高速泳动蛋白（highmobilitygroupprotein,HMG蛋白）能与DNA结合，也能与H1作用，可能与超螺旋结构有关。DNA结合蛋白可能是一些与DNA复制或转录有关的酶或调解物质。A24非组蛋白C端与H2A相同，功能不详,2.真核生物基因组DNA,特点：含有大量的重复序列；功能DNA序列大多被非功能DNA隔开。C值(Cvalue)：一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象(C-valueparadox)：C值往往与种系进化的复杂程度不一致。,不重复序列一个或几个拷贝，占DNA总量的40-80%，序列长约750-2000bp.单拷贝基因也可以合成大量蛋白：蚕丝心蛋白DNA104mRNA109protein中度重复序列重复次数10-104，占DNA总量的10-40%，编码rRNA、tRNA和某些结构蛋白。高度重复序列卫星DNA(satelliteDNA)，占基因组的10-60%，由6-100个碱基组成，大多位于染色体着丝粒，功能不明，可能与染色体的稳定性有关。,3.染色质和核小体,染色质DNA的Tm值比自由DNA高。染色质DNA的复制和转录活性比自由DNA低。DNA酶I对染色质DNA的消化慢于纯DNA。,延伸Tm值,核小体是一种串珠状结构，由核心颗粒和连结线DNA两部分组成，可描述如下：每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1；由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成核心颗粒；DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合；相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA。,真核生物基因组的结构特点基因组庞大存在大量重复序列大部分为非编码序列（90%）转录产物为单顺反子(见下页解释)真核基因是断裂基因，有内含子存在大量顺式作用元件（启动子、增强子、沉默子）存在大量的DNA多态性有端粒结构,相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）。,延伸：什么是顺反子,2.1.3原核生物基因组,1结构简练绝大部分编码蛋白质,2存在转录单元功能相关的基因往往集中在一起，它们可被一起转录成多顺反子mRNA,3有重叠基因,阅读框改变或不改变,2.2DNA的结构,2.2.1DNA的一级结构,DNA（脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid）的组成成分：,核糖和脱氧核糖,嘌呤(purine),嘧啶(pyrimidine),多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生,DNA的方向是5-3（蛋白质是N-C）DNA通常以线性或环状形式存在DNA通常是双链的(dsDNA)，少数是单链的(ssDNA)DNA的一级结构是指4种核苷酸的排列顺序。,GC丰富区易形成左手螺旋反向重复的片段易形成发夹结构,一级结构对高级结构的影响：,延伸：,5TCTCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGAGA33AGAGAGAGAGAGATCTCTCTCTCTCT5,5NNNGAAGGTCCNNNNGGACGTTCNNN33NNNCTTGCAGGNNNNCCTGCAAGNNN5,反向重复序列（invertedrepeatsequence）,回文结构（Palindrome）,NNNNCGCGTAGCGCATATGCNNNNNN,2.2.2DNA的二级结构,DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。,B-DNA的反向平行双螺旋结构,克里克的草图,大沟通常是蛋白质与DNA相互作用的部位,DNA缠绕在组蛋白上,右手螺旋：A-DNA,B-DNA左手螺旋：Z-DNA,B构象：生物体内天然存在的DNA几乎都以B-DNA存在。A构象：是在以钠、钾或铯作为反向离子时，将DNA纤维在75%相对湿度下进行X光衍射测定出来的。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链结构均为A构象。Z构象：在DNA进行转录或其他一些生理过程中会产生Z-DNA结构，之后DNA会放出能量，形成B-DNA。,扩展：其他结构,Hollidayjunction,由重复排列的端粒构成的脱氧核糖核酸四联体结构形态,2.2.3DNA的高级结构,DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。1965年Vinograd等用电镜发现SV40和多瘤病毒的环形DNA的超螺旋。,L=T+WL(linkingnumber)：环形DNA分子两条链间交叉的次数T(twistingnumber)：盘绕数W(writhingnumber)：超螺旋数,2.3DNA的复制,过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。,2.3.1DNA的半保留复制,最初推测的复制模型,2.3.2复制的起点、方向和速度,复制起点（复制原点）是固定的，能识别参与复制起始的特殊蛋白质。DNA从复制起点开始复制直到终点为止，每一个这样的DNA复制单位称为复制子（replicon）。,从复制起点开始，双链解开形成叉子状的生长点，叫复制叉（replicationfork）。,复制叉移动的方向和速度是多种多样的，但以双向等速移动为主。真核生物：双向等速原核生物：双向等速（大肠杆菌）双向不等速（枯草杆菌）先单向后双向（R6K质粒）单向（ColE1质粒）,2.3.3复制的几种主要方式,1线性DNA双链的复制,所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5向3端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是53；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5端如何起始呢？,延伸端粒是染色体末端的DNA重复序列，作用是保持染色体的完整性。DNA每次复制端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。,通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如噬菌体（成环）、T7噬菌体（多聚分子）。DNA可形成特殊的结构。如草履虫的线性线粒体DNA在末端形成发夹，使分子没有游离末端。某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA。末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）。,?,二聚体,3-OH,3-OH,专一性核酸内切酶,T7噬菌体的末端复制,PoxvirusDNAreplication,腺病毒通过蛋白引发的DNA复制,Schematicrepresentationofthechromosomeenddecoratedwithmembersoftheshelterincomplex.(A)Linear(top)andfoldedT-loop(bottom)structuralstatesofthetelomerearedepicted.Notethatintheopenlinearconformation,POT1alonemightbesufficienttoconfer3overhangprotection.(B)Ananti-parallelintramolecularG-quadruplexeitheralone(top)orinthecontextofaT-loop(bottom)mightperformacappingroletoprotectthechromosometerminusfromdegradationbynucleasesorextensionbytelomeraseorALT.JCSNovember15,2009vol.122no.224013-4025,2环状DNA双链的复制,型（如大肠杆菌E.coli）,滚环型（rollingcircle）（如X174）,D-环形（D-loop）（如哺乳动物线粒体DNA）,2.4原核生物和真核生物DNA复制的特点,2.4.1原核生物DNA复制的特点,1DNA复制的引发,oriC(84min),（dnaA结合位点）,dnaA与OriC的结合启动了DNA的复制,不同原核生物的复制起始位点,HU+ATP,RNA引物：所有的DNA聚合酶都从3羟基端开始DNA合成。DNA复制首先需要由引发酶在DNA模板上合成一段RNA链，提供引发末端。长度111。,引发体primosome,引发前体preprimosome,引发酶Primase(DnaG),DnaBhelicaseDnaChelicaseassistantDnaTPriAPriBPriC,2DNA双螺旋的解旋,DNA解链酶(DNAhelicase)需要水解ATP获得能量。大部分沿模板的5-3方向移动，少数沿3-5方向移动(Rep蛋白)。单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB蛋白)防止单链DNA退火。原核生物SSB蛋白有协同效应。,DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)第一型拓朴异构酶（TypeItopoisomerase）：切断一股DNA，属于这类型的有拓朴异构酶I与拓朴异构酶III等。第二型拓朴异构酶（TypeIItopoisomerase）：切断双股DNA，属于这类型的有拓扑异构酶II与拓扑异构酶II等。,3冈崎片段与半不连续复制,冈崎片段(Okazakifragment)一般长约1000-2000个碱基，原核比真核长。,前导链Leadingstrand后随链Laggingstrand,然后，RNaseH降解RNA引物，DNA聚合酶I补齐缺口，再由DNA连接酶连接两个冈崎片段。,4复制的终止,Tus与约22bp的终止序列Ter结合，使dnaB不再解链。当复制叉前移，遇到重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA,PNASSeptember2,2019vol.105no.3512831-12836,5DNA聚合酶,细菌中，已有五种DNA聚合酶被发现。*DNA聚合酶I（PolI）：C端(Klenow片段)具有聚合酶活性和3-5外切酶活性；N端具有5-3外切酶活性；能去除冈崎片段5端得RNA引物；有内切酶活性。*DNA聚合酶II（PolII）：活性低，在DNA损伤修复中起作用。*DNA聚合酶III（PolIII）：活性强，具有聚合酶活性和3-5外切酶活性，在大肠杆菌DNA复制过程中起主要作用。*DNA聚合酶IV（PolIV）：SOS修复中发挥作用。*DNA聚合酶V（PolV）：SOS修复中发挥作用。,2.4.2真核生物DNA复制的特点,真核生物是多点复制，原核生物是单点复制。真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。,复制起始位点：自主复制序列(autonomousreplicatingsequence,ARS)这个序列是染色体正常起始复制所必需的。所有的ARS的DNA均有一段保守序列。,ARS能结合起始点识别复合物(originrecognitioncomplex,ORC)。,已发现15种真核DNA聚合酶，在哺乳动物细胞中有5种：Pol：做为引发酶合成RNA引物，然后做为DNA合成酶延伸此段RNA引物；合成数百个碱基后，将后续的延伸过程交给Pol与。Pol：在DNA修复中起作用。Pol：复制线粒体DNA。Pol：Pol与Pol是真核细胞的主要DNA聚合酶。（前导链）Pol：填补引物空隙，切除修复，重组。（冈崎片段）（真核生物DNA聚合酶一般不具有外切酶活性，推测有其他的酶参与校对。）去除冈崎片段：分两步，RNA酶H1切断DNA-RNA，FEN1蛋白降解RNA片段，DNA连接酶连接两个冈崎片段。,2.4.3DNA复制的调控,大肠杆菌染色体DNA的复制调控复制起始不依赖于细胞分裂，复制终止则能引发细胞分裂。复制调控主要发生在起始阶段。dnaA-ADP复合物；非甲基化GATC-SeqA复合物,SchematicrepresentationofmechanismstolimitinitiationofchromosomereplicationinE.coli.TheDnaAproteincanbindATPorADP(A),bindtooriCandseparatetheDNAstrands(B).AfterloadingoftheDnaBhelicase,primase,andtheelongationmachinerytheDnaA-boundATPmaybereducedtoADPbytheB-clamp,whichispartofthepolymerasecomplexyellowellipse,(C).ItshouldbenotedthatthisATPhydrolysismaycontinueaslongastheB-clampisloadedandnotonlyshortlyafterinitiation.ThenascentDNAstrandsareunmethylated(red)andtheSeqAproteinbindshemimethylatedDNA(D)andsequestershemimethylatedoriC.SeqAremainsboundatthehemimethylatedoriClongafterthereplicationforkhaspasseddatA,whichtitratesalargeamountofDnaA(E).Notethedifferenceinscaleinthedifferentpanels.EMBOreports1,6,479483(2000),对dam-E.Coli的研究表明，半甲基化的OriC不能发动一轮新的复制在复制过程中，OriC的半甲基化状态约保留13min。而在基因组其它区域的GATC位点，在复制后1.5min内即被甲基化。,ColE1质粒DNA的复制调控,引物RNA前体的转录起始于复制起点上游555个核苷酸处，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。RNA1的编码区在引物RNA编码区的5末端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5末端互补。RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起负调控作用。,（负调控）,当不存在RNA1时，RNA引物前体形成自身的发夹结构，起类似终止子的作用当前体RNA与RNA1互补配对时，类终止子效应消失，引物前体的转录被继续，阻止了RNaseH加工引物前体,3.真核细胞DNA的复制调控（1）细胞生活周期水平调控DNA复制只发生在S期S期的主要事件是DNA复制，该过程将准确生成两套半保留的染色体。对此，有人提出“DNA复制执照”假说，该假说认为细胞中存在一种因子使DNA仅能复制一次。且该因子将不断降解从而使DNA复制于G2期中止，并直至下一次M期重新接触到该因子才可继续复制。有实验证明Mcm、Orc蛋白等成分构成了执照因子。（2）染色体水平调控不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定的时间顺序在S期起始复制（3）复制子水平调控各个复制子按专一的时间顺序活化。,2.5DNA的修复,维持DNA序列的保真性；可在复制前后进行；有多种修复机制来纠正DNA损伤；DNA修复失败可能导致突变和肿瘤。,怎么损伤的？,1自发损伤DNA复制中的错误（10-1-2-10-5-6-10-10）DNA自发性化学变化（碱基异构、脱氨基、脱嘌呤嘧啶、碱基修饰）2物理因素紫外线电离辐射3化学因素烷化剂碱基类似物（5-溴尿嘧啶）EB,2.5.1错配修复,2.5.2切除修复,AP位点所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能够特异性切除受损核苷酸上的N-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点(apurinic/apyrimidinicsite)。AP位点AP核酸内切酶DNA聚合酶IDNA连接酶,1.碱基切除修复,2.核苷酸切除修复,2.5.3重组修复,有时在进行DNA修复之前，受损环的DNA链常常还能进行复制。在这种情况下，受损亲代链的复制受损坏碱基的干扰，跨过这段损坏序列后，此时在新的一个起点继续开始复制，此时新合成的子代链的碱基序列就有了一个缺口。这种缺口可以通过重组修复机制纠正。这种修复机制有点类似于遗传重组。当进行第二轮复制时，如果损伤还留在母链上