（分析化学专业论文）水溶性cdsecds核壳纳米粒子的制备及其分析应用.pdf

中文摘要 第一章对半导体纳米粒子的制备方法及其与生物分子的结合方式以及蛋白 质测定研究进展进行了综述。 第二章以半胱氨酸镉配合物为前体，在水溶液中合成c d s e 纳米粒子，以 c d s 对其表面进行修饰，得到具有核壳结构的c d s e c d s 纳米粒子。采用x r d ， t e m 表征其结构及形貌；以荧光光谱研究了时间、p h 值、壳量、壳前体加入方 式、稳定剂用量等因素对c d s e c d s 光谱特性的影响。 第三章研究了水溶液中合成的半胱氨酸修饰的c d s e c d s 核壳纳米粒子与生 物分子溶菌酶相互作用的共振光散射光谱特性，详细考察了p h 值、离子强度等 因素对其相互作用的影响，并建立了以c d s e c d s 纳米粒子为共振光散射探针测 定溶茵酶的新方法。方法用于合成样品的分析，结果令人满意。 第四章基于h g ”对水溶液中合成的半胱氨酸修饰的c d s e c d s 核壳纳米粒子 荧光产生猝灭的现象，在对测定条件进行优化的基础上，建立了以c d s e c d s 纳 米粒子为荧光探针测定h 2 ”的新方法。 关键词：c d s e c d s 核壳纳米粒子，共振光散射，溶菌酶，荧光猝灭，h 9 2 + a b s t r a c t i nc h a d e rl ，ab r i e fo v e r v i e wf o rm es y n t h e s i sm e t h o do fs e m i c o n d u c t o r n a n o p a n i c l e s ，t h e i ri n t e r a c t i o nw i t hb i o m o l e c u l e s ，a n dt h ed e v e l o p m e n to fp m t e i n d e t e c t i o nw a sg i v e n i nc h a p t e r2 ，c d s en a l l o p a r t i c l e sc a p p e db yc d sw e r es y n m e s i z e di nt h e a q u e o u ss o l u t i o na tr o o mt e m p e r a t u r eu s i n gc y s t e i n ea st h es t a b i l i z e lx r a yp o w d e r d i a a c t i o na n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yw e r eu s e dt oa 1 1 a l y z em ec o r “s h e n n a n o p a n i c l e s s t r u c t u r ea n dd e t e r n l i n et h e i ra v e r a g es i z e ，s i z ed i s t r i b u t i o na 1 1 ds h a p e f l u o r e s c e n c es p e c t r aw e r eu s e dt op r o b et h ee h e c to ft i m e ，p h ，q u a l l t i t yo fs h e l l ， a d d i n g r a t eo fs h e l l p r e c u r s o r s a j l dt h e q u a n t i t y o fc y s t e i n eo nt h e s p e c t r a i c h a r a c t e r i z a t i o no fc d s e c d s i nc h a d t e r3 ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na m c t i o n a l i z e dn a n o - c d s e c d sw i t h l y s o z y m ew a si n v e s t i g a t e du s i n gr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gs p e c t r a t h ei n n u e n c eo f d hv a l u ea n di o n i cs t r e n 2 t ho nt h ei n t e r a c t i o nw a ss t u d i e di nd e t a i l an o v e lm e t h o d f o rl y s o z y m ed e t e c t i o nw a se s t a b l i s h e db yu s i n gf u n c t i o n a l i z e dn a n o c d s e ，c d sa s t h er e s o n a j l c el i g h ts c a t t e r i n gp r o b e t h i sm e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e m i n e1 y s o z y m e i ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t i o n i nc h a d t e r4 ，b a s e do nt h en u o r e s c e n c eq u e n c h i n go ff u i l c t i o n a l i z e d n a n o c d s “c d sb yh f + ，an e wm e t h o df o rt h er a p i dd e t e h n i n a t i o no fh 旷+ w a s f o u n d e db vu s i n 2f u n c t i o n a l i z e dn a n o a d s e g d sa st h ef l u o r e s c e n c ep r o b e k e yw o r d s ：c d s e c d sc o r e s h e l ln a n o p a r t i c l e s ； r e s o n a n c el i g h ts c a t t e “n g l y s o z y m e ； f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ：h 矿+ y9 6 8 6 9 6 7 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务：学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版：在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：柏芳 幽弼年5 月专口目 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 内部5 年( 毋k5 年，可少丁5 年) 秘密1 0 年( 最kl o 年可少于1 0 年) 机密2 0 年( 最k2 0 年，可少_ 丁2 0 年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究： ：作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 山水人承担。 学位论文作者签名 年月日 第一章前言 1 1 半导体纳米粒子 第一章前言 1 1 1 半导体纳米粒子的物理和化学特性 1 1 1 1 半导体纳米粒子的量子尺寸效应 量子尺寸效应研究最多的是吸收光谱和荧光光谱的蓝移现象。半导体纳米 粒子具有一些不连续的能级，这些能级能够通过调节粒子的尺寸而被改变。因 此只要改变粒子的尺寸，它的能级就会被改变，从而导致发射光的波长改变。 图1 1 显示了不同尺寸纳米粒子发射所对应的光谱变化【l ”。 h a n ys h a r p ，d i s t 1 c tc o i o 厂s e 耐3 3 i o nw a v 科e n o t h - m ) 巳c l 嵋u a l ：z n s e 2 9 0 n n 、o t l l e 门3 6 5 1 1 m 图ll 不同尺寸纳米粒子发射所对应的光谱变化 f i g u r e l 1t h ep h o t o l u m i n e s c e n c es p e c t r ao f z n s e ，c d s ea n d c d t cn a n o p a r t i c l e s 1 1 1 2 半导体纳米粒子量子限域效应 半导体纳米微粒的粒径r a b ( a b 为激子玻尔半径) 时，电子的平均自由程 第一章前言 受小粒径的限制，局限在很小的范围，空穴很容易与它形成激子，引起电子和 空穴波函数的重叠，这就很容易产生激子吸收带。随着粒径的减小，重叠因子 ( 在某处同时发现电子和空穴的概率i u ( o ) 1 2 ) 增加，即出现激子增强吸收蓝移， 这就称作量子限域效应。 1 1 1 _ 3 半导体纳米粒子的表面性质 纳米材料的表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原予数之比随粒径的 变小而急剧增大后所引起的性质上的变化。粒径在1 0r 矾以下时，将迅速增加表 面原子的比例。当粒径降到1n r n 时，表面原子数比例达到约9 0 以上，原子几乎 全部集中到纳米粒子的表面。由于纳米粒子表面原子数 增多，表面原子配位数不足和高的表面能。使这些原子易与其它原子相结 合而稳定下来，故具有很高的化学活性。利用所合成的纳米粒子表面存在着大 量的表面缺陷态，通过另一种具有更宽带隙的材料在其表面进行生长，这就是 所谓的核壳结构。不同的壳层厚度可以通过从两种材料之间的晶格参数及核的 尺寸而获得。与单独的c d s e 核比较，生长壳层之后的核壳纳米粒子显示了更加 优越的光学特性，图1 2 显示了核壳纳米粒子的生长过程以及在形成壳层之后的 光谱变化p “。】。 图1 2 核壳纳米粒子以及在形成壳层之后的光谱变化 f i g u r e1 2 f l u o r e s c e n c es p e c t mo f c o r ea n dc o r e s h e l ln a n o p a n j c l e s 1 1 1 4 介电限域效应0 6 j 2 第一章前言 介电限域是纳米微粒分散在异质介质中由于界面引起的体系介电增强的现 象，主要来源于微粒表面和内部局域场的增强。一般来说，过渡族金属氧化物 和半导体纳米微粒都可能产生介电限域效应。纳米微粒的介电限域对光吸收、 光化学、光学非线性等会有重要的影响。因此，在分析纳米材料光学现象时， 既要考虑量子尺寸效应，又要考虑介电限域效应。 1 1 2 半导体纳米粒子所具备的优点 与传统的有机荧光染料或镧系配合物相比【7 】，半导体纳米粒子具有许多特别 的光学特性。 ( 1 ) 半导体纳米粒子的激发波长范围很宽，这使得单个波长可激发所有的 半导体纳米粒子，这给生物学研究带来很大的方便。半导体纳米粒子的发射光 谱覆盖从紫外到红外区域，而很少荧光染料的发射波长能在8 0 0r l n l 以上。半导 体纳米粒子在生物材料荧光标记领域中的主要优点是可以使用同一激发光同时 进行多通道的检测【8 j 。例如，细胞学家根据细胞结合不同的抗体对细胞进行分类， 分子生物学家需要同时对成千上万个d n a 寡核苷酸进行检测，临床诊断需要对 不同的抗体或抗原同时进行检测。单通道的荧光标记探针只能对同一样品进行 反复多次检测，费时、费力、费试剂，有时候甚至是不可能的。虽然可找到具 有不同发射波长的有机荧光探针分子，但同时具有相同激发波长和不同发射波 长的有机荧光探针却不多。每种染料分子都需要自己相应的激发波长。半导体 纳米晶体组成和粒径大小不同时可发出不同波长的光，发射光谱半峰宽比普通 荧光染料窄，且峰形对称。这样，在一个可检测到的光谱范围内可同时使用多 个探针。两种核壳结构的半导体纳米粒子，一种发出绿色荧光，另一种发出红 色荧光，用于生物材料标记后用一个激发光源成功进行双通道检测，更多的有 关多通道检测的工作正在进行中1 9 j 。对于一些不利于在紫外或可见区域进行检测 的生物材料，可利用半导体纳米粒子标记在红外区域进行检测，完全避免紫外 光对生物材料的伤害，特别有利于活体生物材料的检测。与此同时，荧光背景 对检测信号的干扰也将大幅度降低。 ( 2 ) 半导体纳米粒子的发射波长可通过控制它的大小和组成来“调谐”，因 而可获得多种可分辨的颜色。如：紫外一蓝光( z n s ，z n s e ) ；可见光( c d s ， c d s e ，c d t e ) ；近红外光( c d s h g s c d s ，i n p ，i n a s ) 。 第一章前言 ( 3 ) 半导体纳米粒子具有较大的斯托克斯位移和狭窄对称的荧光谱峰，半 峰宽常常只有4 0 啪或更小。这样就允许同时使用不同光谱特征的半导体纳米粒 子，而发射光谱不出现交叠，或只出现很少交叠，使所标记的生物分子的荧光 光谱易于区分和识别。n i e 等【l0 j 发现将多种半导体纳米粒子组合进内部镂空的高 分子小球，不同的半导体纳米粒子之间并没有能量转移。而有机荧光分子的半 峰宽很宽( 约1 0 0r u n ) ，并且还有很长的拖尾，从而使同时使用不同的有机荧光 分子会出现发射光谱交叠的现象。 ( 4 ) 与有机荧光染料相比，半导体纳米粒子比较稳定，荧光光谱几乎不受 周围环境( 如溶剂、p h 值、温度等) 的影响，它可以经受反复多次激发，而不 像有机荧光分子那样容易发生荧光漂白。半导体纳米粒子的发光寿命比普通荧 光染料的寿命长1 2 个数量级，可采取时间分辨技术来检测信号，这样可大幅 度降低背景的强度，获得较高的信噪比。这为研究细胞中生物分子之间长时间 的相互作用提供了有力工具“2 ”】。半导体纳米粒子的荧光强度是罗丹明6 g 的2 0 倍，稳定性是它的l o o 倍，光谱线宽只有其三分之一。 ( 5 ) 半导体纳米粒子具有很好的生物相容性，而有机荧光染料或镧系配合 物则不具有这种优越性。总之，把半导体纳米粒子用于标记生物材料如细胞、 蛋白质和核酸，比使用有机荧光分子具有更好的荧光特性【1 2 ，”】( 参见表1 1 ) 。 用半导体纳米粒子补充或部分取代有机荧光标记材料，将开创超灵敏度、高稳 定性以及长发光寿命的生物检测技术。 1 1 3 半导体纳米粒子制备方法 目前制备具有高发光效率的半导体纳米粒子的方法主要是金属有机化学法 和水相合成法。 1 1 3 1 金属有机化学法 金属有机化学法是最常用的一种合成半导体纳米粒子的胶体化学方法，它 是迄今为止最成功的合成高质量纳米粒子的方法，己成功地用于i i v i 族和i i i v 族半导体纳米粒子的合成【1 6 ，1 7 ，18 1 。该方法通常是在无水无氧的条件下，用金属有 机化合物在具有配位性质的有机溶剂环境中生长纳米晶粒。即将反应前体注入 到高沸点的表面活性剂中，通过控制反应温度来控制微粒的成核与生长过程。 4 第一章前言 表1 1 半导体纳米粒子( z n s ，c d s e ) 与荧光染料( f i t c ，r 6 g ) 的荧光特性的比较 t a bj e1 1 c o m p a r j s o no f 们u o r e s c e n c es p e c t r a lp r o p e r t i e s0 f s e m i c o n d u c t o rn a n o p a n i c l e s ( z n s c d s e ) a n dc o m m o n l yu s e dn u o r e s c e n td y e s ( f i t c ，r 6 g ) 荧光物质 量子点 异硫氰基荧光索罗丹明6 g n u o r o o h o r cs ( z n s 圮d s c ) cr 6 g 量予产率o5 08 503 08 5， 半峰宽，n m11，3 5 吸收波睦，n m3 0 0 6 1 04 9 15 1 5 发射波长，n m4 8 0 6 3 05 16 5 1 55 5 5 光漂白时问，s9 6 0，1 0 朦尔吸光系数， l m o l c m 。l1o 。7 2 0 0 0， 1 1 3 1 1 制备单分散的半导体纳米粒子 半导体纳米粒子在有机体系中的生长温度可以在较大范围内选择与调节， 从而有利于控制粒子的成核和生长过程。如在三辛基氧膦( t o p o ) 中，可在3 5 0 。c 的温度下使粒子快速成核，然后通过大幅度降温来控制粒子的生长，从而控 制颗粒的尺寸分布。1 9 9 3 年，b a w e n d i 等人【1 9 】将金属有机化合物注入热的有机 溶剂中，通过高温，制备出了单分散的c d s e 纳米粒子。他们采用t o p o 作为有 机配位溶剂，用二甲基镉和t o p s e ( 三辛基硒膦，由三辛基膦t o p 和硒粉制得) 做前体，将其迅速注入到剧烈搅拌的3 5 0 0 c 的t o p 0 中。短时间内即有大量的 c d s e 纳米颗粒晶核形成。然后迅速降低温度至2 4 0 0 c 以阻止c d s e 纳米粒子继 续成核，随后升温到2 6 0 2 8 0 0 c 并维持一定时间，使c d s e 纳米粒子缓慢生长， 每隔一段时间( 5 l o m i n ) 取出部分反应液，根据其吸收光谱来监测晶体的生 长。当晶体生长到所需要的尺寸，将反应液冷却至6 0 0 c ，加入丁醇防止t o p 0 凝固，随后加入过量的甲醇，最后通过离心即可以得到c d s e 纳米粒子。 为了减少c d s e 纳米粒子的尺寸分散，采用尺寸选择沉淀法( s i z e s e l e c t i v e p r e c i p i t a t i o n ) 可进一步将不同粒径的粒子分开。通过控制c d s e 纳米粒子溶液中 丁醇和甲醇的量，可使不同粒径的粒子分批沉淀，从而得到分散较好的c d s e 纳 第一章前言 米粒子。此合成方法中所用的前体二甲基镉不仅价格昂贵，而且有剧毒，它在 常温下不稳定，甚至在高温下还会发生爆炸并放出大量的有毒气体，因此对实 验条件要求十分严格，而且不易控制所得到的半导体纳米粒子尺寸。为解决这 一问题，p e n g 等人【2 0 j 用c d o 代替二甲基镉，合成的c d s 、c d s e 和c d t c 纳米粒 子尺寸十分均匀。该法将c d o 、t o p o 和用作配体的己基磷酸或十四烷基磷酸混 合加热至3 0 0 0 c ，然后加入碲、硒或硫的溶液，加热到2 5 0 0 c ，直至纳米粒子生 长到需要的尺寸。 1 1 3 1 2 制备核壳结构的半导体纳米粒子 半导体纳米粒子具有大的比表面积，因此粒子的表面态与其化学、物理性 质有着密切的关系。由于半导体纳米粒子具有高的表面活性，使它们很容易团 聚在起从而形成带有若干弱连接界面的尺寸较大的团聚体：并且关于半导体 纳米粒子表面形态的研究指出，粒子的表面并不光滑，存在着许多缺陷22 1 。这 些都会影响纳米粒子的发光效率。利用各种有机和无机材料对纳米粒子的表面 进行修饰，可以有效地消除表面缺陷( 即表面钝化) 从而实现对纳米粒子性质 的微观调控【2 j 。通过对半导体纳米粒子表面的修饰，可以达到4 个目的：( 1 ) 改善或改变粒子的分散性；( 2 ) 提高粒子的表面活性：( 3 ) 使粒子表面产生新 的物理、化学、机械性能及新的功能；( 4 ) 改善粒子与其他物质之间的相容性。 具体的讲，表面修饰可以产生以下几种结果：( 1 ) 通过消除在半导体粒子表面 的非辐射电子一空穴( e 仇+ ) 复合缺陷态，可以导致激子荧光或缺陷荧光的增强 【3 1 3 3 ，蜘3 9 】；( 2 ) 增强半导体纳米粒子的光稳定性【2 3 ，2 4 】；( 3 ) 半导体粒子表面引 入新的陷阱，导致新发光带的出现【29 ，”，3 4 j ：( 4 ) 可使粒子表面发生的光诱导反应 的选择性和效率显著提高 1 9 j o ，4 ”。 两亲性有机分子( 表面活性剂) 修饰半导体纳米粒子的表面不仅能避免半 导体纳米粒子的聚集，而且对半导体纳米粒子表面具有一定的钝化作用【4 0 】。上 述方法就是通过有机溶剂( t o p o 、t o p ) 的配位作用钝化晶粒表面，阻止或降 低晶粒的生长速度，有效地调节粒子的尺寸；同时增加晶粒在有机溶剂中的溶 解度，从而达到提高半导体纳米粒子质量，改善其光学性能的目的。可是这类 单分散的半导体纳米粒子的荧光量子产率并不高( 大约只有1 0 左右) 【1 9 】。 为了提高量子产率，多年来，纳米工作者们进行了不懈的努力，他们发现 采用无机物，如z n s 42 1 、c d s 【2 4 】来钝化半导体纳米粒子的表面能大大提高其荧 6 第一章前言 光量子产率。1 9 9 6 年，h i n e s 和g u v o t s i o n n e s t 制备了具有核壳结构的z n s 包 被的c d s e 纳米粒子，在室温条件下其量子产率可高达5 0 。b a j l w e n d i 等 4 2 】 在此基础上，在其制备好的c d s e 纳米粒子外包覆了z n s ，使半导体纳米粒子的 量子产率从1 0 提高到3 0 5 0 。他们采用二乙基锌和六甲基二硅硫烷作为锌 和硫的前体，在达到所需要的温度时，将其缓慢滴加到含有c d s e 纳米粒子的反 应液中。这里温度的选择很重要：温度过高，c d s e 纳米粒子的晶核本身会继续 生长，破坏其尺寸分布：温度过低，将导致硫和锌的前体不完全分解，影响z n s 在c d s e 核上的结晶度。最终形成的c d s e z n s 纳米粒子的外层仍是由t o p o t o p 所钝化。包覆了z n s 的c d s e 纳米粒子的吸收光谱比单独的c d s e 纳米粒子的范 围宽，同时出现了红移。并且z n s 的厚度不同，c d s e z n s 纳米粒子的量子产率 也随之变化。 由金属有机化学法制备的纳米粒子具有结晶性好、尺寸均一( 相对标准偏 差r s d 1 5 ) h 引，因此并没有受到人们的重视。近几年来，对水相中性能优良 的半导体纳米粒子的需求日益增加。若将有机合成法制得的半导体纳米粒子转 移到水相，其步骤比较繁琐，最重要的是处理后得到的半导体纳米粒子水溶液 的稳定性大大降低，最多放置2 个月就会出现沉淀【4 4 】。因此人们想到了直接在 水溶液中合成半导体纳米粒子的方法，从而使水相合成法取得了飞速的发展。 水相合成法的基本原理是在水中加入稳定剂( 如巯基化合物等) 【4 5 郴】，通 过水相离子交换反应得到纳米粒子。与金属有机化学法相比，水相合成法操作 简单、毒性小、成本低。由于纳米粒子是直接在水相中合成的，这不仅解决了 纳米粒子的水溶性问题，而且大大提高了半导体纳米粒子的稳定性，可以在暗 处放置一年以上。 1 1 4 表面修饰的半导体纳米粒子与生物分子的结合方式 7 第一章前言 表面修饰的半导体纳米粒子与生物分子的结合方式主要有三种：( 一) 表面 配体通过共价键结合生物分子；( 二) 表面配体通过静电相互作用结合生物分子； ( 三) 表面配体与生物分子发生交换反应。 1 1 4 1 表面配体通过共价键结合生物分子 由于表面修饰后的半导体纳米粒子具有各种官能团，如羧基，羟基，氨基 和巯基，使得半导体纳米粒子可以通过各种交联反应与生物分子共价结合( 见 表1 2 ) 。 表1 2 表面配体与生物分子发生交联反应所需的交联剂 t a b l e1 2c o u p l i n gr e a g e n t su s e di nc o v a l e n ic o n j u g a t i o no f v a r i o u ss u r f a c e m o d i n e dq d sw i t h b i o m o l e c u l e s f u n c t i o n a lg r o u po ff u n c t i o n a lg r o u po f c o u p l i n gr e a g e n t m o d m e dq d sb i o m o l e c u l e s c o o h n h 2 e d co rs u l f o n h s - n h 2 c o o hs u l f o n h s - n h 2 一s hs u l f o s m c c s h n h 2 s u l f 0 一s m c c o h n h 2 c d i ( 1 ) 半导体纳米粒子表面配体的羧基可以与生物分子的氨基在交联剂e d c 或n 一羟基琥珀酰亚胺磺酸酯( s u l f o n h s ) 的作用下发生化学反应，生成肽键。 利用此反应，半导体纳米粒子可与多种生物分子结合，如转铁蛋白【l ”、天花粉 蛋白【4 8 】、免疫球蛋白( i g g ) 4 9 1 、链霉亲和素【4 9 】等。 ( 2 ) 半导体纳米粒子表面的氨基在不同交联剂的作用下能与生物分子的羧 基或巯基发生共价反应。如在s u l f j 州h s 的作用下与生物分子的羧基反应【”】：利 用s u l f 0 一s m c c ( s u l f o s u c c i n i m i d y l4 一( n m a l e i m i d o m e m y l ) c y c l o h e x a n e 一1 一c a r b o x y i a t e ) 一端的s u l f o - n h s 与半导体纳米粒子的氨基反应，另一端的马来酰亚胺基 团与生物分子的巯基反应，从而使半导体纳米粒子与生物分子结合p 。 1 1 4 2 表面配体通过静电相互作用结合生物分子 在一定的p h 条件下，半导体纳米粒子表面的配体发生电离而使粒子带有电 荷，因此可以与带有相反电荷的生物分子通过静电相互作用结合。如二氢硫辛 8 第一章前言 酸修饰的半导体纳米粒子，由于表面的羧基电离，使半导体纳米粒子带有负电 荷，因此通过静电相互作用，与带正电荷的蛋白结合【5 “5 4 1 。通过静电相互作用 结合生物分子的方法简便、快速。但与共价键结合的方法相比，这种静电结合 不够稳定，易受温度、溶液的p h 值和离子强度等条件的影响。 1 1 4 3 表面配体与生物分子发生交换反应 利用交换反应，可以使半导体纳米粒子表面的巯基羧酸被含有巯基的生物 分子取代，如带有巯基的d n a 【5 5 】、肽f 5 6 】、牛血清白蛋白【5 7 】等。由于交换反应达 到反应平衡的时间比较长( 1 2 小时以上) ，因此这种方法比较费时。 1 2 蛋白质分析方法的进展 在蛋白质定量分析方面，最初是应用蛋白质内源光谱性质的分析方法，只 有紫外光谱法和荧光光谱法。后来发现这两种方法常不能满足灵敏度方面的检 测要求，为此，人们发展了各种光谱探针分析法，并针对不同的探针进行相应 的检测，如紫外一可见光谱法、荧光光谱法、化学发光法和共振光散射法等。所 谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的化学试剂，如有机分子、 无机离子、络合物及纳米粒子等，这些试剂和蛋白质结合之后其光谱性质发生 变化，从而可以提供蛋白质的浓度或结构方面的信息。借助于蛋白质光谱探针， 可以测定微量的蛋白质，并研究蛋白质的结构与功能的关系、研究蛋白质与小 分子配体的作用机理等。 1 2 1 紫外一可见分光光度法 蛋白质能够吸收紫外光。由于色氨酸t r j 、酪氨酸t y r 残基对光的吸收，大 多数蛋白质在2 8 0n m 附近有一个吸收峰，而且，该吸收峰强度和蛋白质浓度成 正比，所以可用作定量分析口”。当蛋白质生色基团所处的环境发生变化时，其 紫外吸收光谱随之发生变化：吸收峰红移或蓝移，吸光度及谱带宽度变化。变 化前后的光谱之差称为差光谱。利用差光谱可以获得蛋白质的结构信息，如探 测蛋白质分子中生色基团的暴露程度，研究在变性因素作用下蛋白质的变性过 程【5 9 】。 9 第一章前言 内源光谱灵敏度不够高，所以人们尝试着改变这种状况。绝大部分蛋白质 在可见光区( 4 0 0 一7 5 0 眦) 无吸收，因而一般不能在可见光区测定蛋白质。但蛋 白质可以和许多探针试剂在一定条件下发生反应引起探针试剂颜色的变化，从 而使可见光区的蛋白质分析成为可能。这样，在一般实验室中应用普通的分光 光度计即可进行蛋白质分析。紫外一可见吸光光度法常用的探针大致分四类【6 0 】： 金属探针、染料探针、金属络合物探针和纳米粒子探针。 1 2 1 1 金属探针 在用金属作探针的蛋白质测定法中主要有双缩脲法( b i u r e t ) 、劳里( l o w r v ) 法及胶体金( c o l l o i d a l2 0 l d ) 、银染色法等。 双缩脲法是基于双缩脲反应的基础上的。蛋白质含有两个以上的肽键，可 以进行双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与c u ”形成蓝紫色络合物，其颜色的 深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量、氨基酸成分无关，故可用 该法进行蛋白质分析【6 “6 2 】。双缩脲反应是最常用的血清总蛋白的测定方法，它 操作简单，重复性好，反应使用单一、稳定的试剂，因而可以广泛地应用于各 种自动分析仪。该方法用于血清蛋白质的测定时，干扰少，并且大多数干扰可 以避免，所以准确度高。但是，由于双缩脲法的灵敏度低，因而在测定蛋白质 含量低的样品如尿蛋白时产生了一定的困难。虽然可以对微量蛋白进行浓缩后 再用双缩脲法测定，但由于操作麻烦，故实际应用很少。 l o w r y 法是l o w r y 等人1 6 3j 在1 9 5 1 年建立的。这种方法是将双缩脲试剂与 f o l i n c i o c a l t e a u 试剂一并加入到蛋白质溶液中，蛋白质发生双缩脲反应后，再和 f 0 1 i n c i o c a l t e a u 试剂反应，生成的产物颜色更深。实际上是蛋白质在此试剂中同 时进行两种颜色反应，而两种颜色反应的结果是使溶液呈深蓝色，在7 5 0r l n l 处 测量吸光度，颜色的深浅( 吸收值) 与蛋白质的浓度成正比，可根据7 5 0n m 的 吸收值大小计算蛋白质的含量。此法灵敏度高，比双缩脲法约高1 0 0 倍。但是， 用这种方法来进行蛋白质的定量时，f o l i n 试剂由于依赖酪氨酸和色氨酸等特定 的氨基酸残基，所以蛋白质种类间因氨基酸组成的不同而在显色中产生差异， 使得反应速度慢，并且由于有些试剂的不稳定，又可使蛋白质发生不可逆变性。 后来，有一些人对l o w r y 法加以改进和提高，使其不断趋于完善岬j 。劳里改良 法( b c a 法) 【6 5 】，又称二喹啉甲酸( b c a ) 检测法，是近几年来研制的一种改 进劳里法，其反应简单，几乎没有干扰物质的影响。这种方法的原理是在碱性 0 第一章前言 环境下蛋自质分子中的肽键结构能与c u 2 + 络合生成络合物，同时c u 2 + 将被还原 成c u + 。而b c a 试剂可敏感特异地与c u + 结合，形成稳定的有颜色的复合物， 在5 2 6 n m 处有高的吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的 大小来计算蛋白质的含量。此法的优点是试剂单一，终产物稳定，与劳里( l o 、v r v ) 法相比几乎没有干扰物质的影响【6 6 稍】。但是该方法的反应时间长，蛋白质也会 发生不可逆的变性。 银染色测定微量蛋白质法是在1 9 8 5 年才出现的【6 9 】，该法显色稳定，灵敏度 高，干扰因素小，在蛋白质测定方面得到了很好的应用。该测定法具体操作过 程是：蛋白质样品先用甘油醛处理，之后与银氨溶液混合，1 0 分钟后，加入硫 代硫酸钠终止反应，测定4 2 0 啪处的吸光度。该种方法中蛋白质一银复合物的形 成速度快，显色稳定，碳水化合物、非离子表面活性剂几乎不干扰测定。 1 2 1 2 染料探针 从上世纪5 0 年代开始，染料探针测定蛋白质引起了人们的注意，最早用于 测定血清白蛋白的染料是甲基橙【7 ，后来又出现了偶氮类试剂、三苯甲烷类试 剂、偶氮变色酸类试剂以及卟啉类试剂等。染料探针测定蛋白质的原理是基于 染料与蛋白质的结合，引起其最大吸收峰的移动和颜色的变化而进行的。 在蛋白质的测定中，各种染料试剂的应用都各有利弊，使用中应该根据实 际情况选择最合适的方法。偶氮类试剂在测定的灵敏度及颜色对比度方面都不 是很好。三苯甲烷类试剂是研究最多、应用最广的一类探针试剂。该类试剂总 的来说对比度比较大，灵敏度较高，线性关系好。考马斯亮蓝法又是三苯甲烷 类试剂法中研究最多应用最广的方法。该法是b r a d f o r d 于1 9 7 6 年提出的，故又 称为b r a d f o r d 法 “。这是种迅速可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质的方法， 其原理是基于考马斯亮蓝g 2 5 0 有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的 乙醇溶液中及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，生成深 蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应生成的化合物在5 9 5m 处有最大的光吸收 值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比的关系，因此可检测5 9 5 砌 的光吸收值的大小计算蛋白质的含量。由于反应时间只需2 分钟，颜色可稳定l 小时以上，所以该法省时稳定，可作其它蛋白测定的对照方法。 上述方法中仍然存在一定的缺点，因此，后人直在不懈的努力以研究出 更好的方法。如童沈阳【7 2 j 等对三苯甲烷类染料、偶氮类染料以及卟啉衍生物用 第一章前言 于蛋白质测定的分析化学性能作了较为系统的研究，发现水溶性卟啉t p p s 4 ( 四 磺基苯卟啉) 是一个较考马斯亮蓝更为理想的染料探针。与考马斯亮蓝相比具 有试剂空白低、不污染器皿、稳定等优点，且灵敏度高。 1 2 1 3 络合物探针 络合物探针和蛋白质形成络合物后，颜色加深，因而可以用作蛋白质光谱 探针m 7 6 1 。此类探针反应的灵敏度比较高。1 9 8 3 年，f u j i t ay 等7 3 】建立了邻苯三 酚红m o ( v i ) 络合物测定蛋白质的方法。随着该方面研究的发展，又有许多新的 络合物探针用于蛋白质的测定。i t s u om o r i 等1 7 5 】用5 b r _ p a p s m o ( v i ) 络合物 为探针对人血清蛋白进行测定，灵敏度比邻苯三酚红一m o ( v i ) 法提高了6 倍。 童沈阳等【7 6 】研究了碱性介质中，溴邻苯三酚红( b p r ) z n 2 + 作为光谱探针与b s a 的选择性反应，方法很灵敏，并提出反应机理：b p r z n 2 + 通过z n 2 + 与b s a 结合。 在最佳实验条件下，b p r 与z n “1 ：l 络合，一个蛋白质分子可以络合1 8 个该金 属络合物分子。 1 2 1 4 纳米粒子探针 胶体金属，如金【7 7 1 、银【7 8 也与蛋白质作用，己被用于测定微量蛋白质。李 正平等【7 9 】研究了氢氧化铁( f e ( o h ) 3 ) 纳米粒子与蛋白质之问的相互作用，并建 立了以f e ( o h ) 3 纳米粒子为探针的蛋白质吸光光度分析方法，该方法的灵敏度可 以与荧光法相媲美，应用于生化样品的分析，取得了满意的结果。 1 2 2 荧光分光光度法 蛋白质也可以发射荧光，因此可以利用它的内源荧光来测定。用荧光方法 检测蛋白质的天然荧光比紫外吸收法灵敏，且没有核酸干扰，所以常可以对蛋 白质进行分析检测。 但是，蛋白质自身的荧光强度较弱，仅利用蛋白质的天然荧光来研究蛋白 质是远远不够的。现在，常用荧光探针技术来进行蛋白质定量测定、反应机理 或构象分析研究。所谓荧光探针技术，就是利用荧光探测剂( 小分子荧光化合 物或无机离子) ，使其与蛋白质共价或非共价的结合，并且利用结合前后探测剂 的荧光信号发生的变化来测定蛋白质的含量和结构。蛋白质荧光探针大致可分 为荧光染料探针和稀土离子探针两大类。 2 第一章前言 1 2 2 1 荧光染料探针 荧光染料在与蛋白质结合之后，由于蛋白质微环境的影响，染料的荧光强 度或波长发生变化。最常用的荧光探针是l 。苯胺基8 萘磺酸( 1 ，8 a n s ) 【2 3 】等， 这些荧光探针在水溶液中量子产率很低，但在非极性溶剂中，其量子产率大增， 荧光峰蓝移。例如，a n s 在水溶液中的量子产率和荧光峰分别是0 0 0 4 和5 1 5 r 1 i n ， 但与去辅基肌红蛋白或去辅基血红蛋白结合后就分别变为o 9 8 和4 5 4 砌。由此 可推断与a n s 结合的部位是疏水性很强的区域【6 3 】。 另一种比较好的蛋白质荧光探针是荧光胺【8 08 1 】，该法测定蛋白质的灵敏度 高，测定快速、简单，干扰劳里法的物质在此都没有干扰。但是，这种方法也 有一定的局限性，如：( 1 ) 仍然存在不同的蛋白一荧光胺复合物因赖氨酸残基数 量的不同而有不同的量子产率，这给混合蛋白质样品测定时蛋白标准物的选择 带来了一定的困难。( 2 ) 荧光胺同时也与小分子胺以及氨基酸反应，因而不能 选用含有氨基的缓冲溶液。 除了上述荧光探针外，3 h 一吲哚季铵盐【8 2 】、丁基罗丹明b 表面活性剂体系【8 3 】 等也可以用作蛋白质荧光探针。 1 2 2 2 稀土离子探针 稀土金属离子具有未满f 层电子，属于非惰性结构，因而具有光、磁活性， 当其配位环境改变时，可以引起其光、磁性质的改变。因此稀土离子也是一类 很重要的荧光探针。稀土离子本身的荧光已被利用于时间分辨荧光免疫分析中 【8 4 1 。j s i e p a l ( 1 8 5 】以铽离子( t e 3 + ) 螯合物形成四元混螫合物来非常灵敏地测定蛋 白质( 1 0 。1 m o l l j ) 。吕雪飞等【8 6 以铽钛铁试剂络合物为荧光探针对几种脱氢酶 进行了测定。 1 2 2 3 半导体纳米粒子探针 纳米粒子具有很多优异的光学性质，半导体纳米粒子的激发波长范围很宽， 这使得单个波长可激发所有的半导体纳米粒子，这给生物学研究带来很大的方 便。半导体纳米晶体组成和粒径大小不同时可发出不同波长的光，发射峰半峰 宽比普通荧光染料窄，且峰形对称。纳米粒子比较稳定，荧光光谱几乎不受周 围环境( 如溶剂、p h 值、温度等) 的影响，它可以经受反复多次激发，而不像 有机荧光分子那样容易发生荧光漂白，同时具有很好的生物相容性。如王伦等【8 7 第一章前言 8 8 1 利用水相中合成的纳米粒子作为荧光探针分别测定了b s a 和y g 。 1 2 3 化学发光分析法 自1 9 8 3 年以来，h a r a 【8 9 ”】等建立了一系列利用化学发光检测蛋白质的方 法。应用比较广泛的是鲁米诺和邻菲咯啉体系。化学发光测定蛋白质的原理是： 金属离子可催化化学发光信号，当金属离子与蛋白质形成配合物时，这种催化 活性被改变，基于这种改变值来确定蛋白质的含量。h a r a 等【9 3 】基于蛋白质对鲁 米诺h 2 0 2 c u ( i i ) 体系化学发光的抑制作用建立了流动注射测定蛋白质的分析 方法，线性范围为o 7 7 0 o 肛g m l ，而且人血清蛋白、牛血清蛋白、牛血清a 球蛋白及牛血清y 一球蛋白等不同的蛋白质有基本相同的响应，所以适用于血清及 尿样中总蛋白的定量分析。 1 2 4 共振光散射分析法 近年来，共振光散射技术作为一种新的分析方法，具有灵敏度高、操作简 便、安全无毒、所用试剂便宜等优点，在蛋白质等生物大分子的测定中的应用 己受到了广泛关注。 当r e y l e i 曲的波长位于或接近分子的吸收带时，其散射程度将不再遵守 r e y i e i 曲散射定律并且某些波长的散射程度急剧增强，这种现象称共振光 r e y l e i 曲散射。共振光散射能够十分灵敏地测定生物大分子，测定的基础是有机 染料、金属络合物、有机酸或纳米粒子在蛋白质、核酸等生物大分子表面进行 堆积导致强烈的共振光散射增强，而共振光散射增强值与生物大分子的浓度具 有线性关系【4 。目前研究的共振光散射探针主要包括有机染料探针、金属络合 物探针、有机酸探针和纳米粒子探针。 有机染料探针是研究最多的一类蛋白质共振光散射探针。例如，利用阴离 子卟啉t p p s 4 分别可以测定纳克级的白蛋白和球蛋白【9 4 j ：三苯甲烷类染料如铝 试剂【9 5 】、茜素紫【9 5 】、溴酚蓝【9 6 】、苯甲天青【9 7 】等与蛋白质结合后，在染料的最大 波长的长波区产生共振光散射增强，可用于纳克级蛋白质含量的测定。 另外还有铬黑t 【9 8 】、酸性铬蓝k 【9 9 】、酸性绿2 5 【1 0 、绿色盐f cf 【l o ”、四碘 苯酚磺酞f 1 02 1 、铀试剂【m 3 1 等，都可用作蛋白质共振光散射探针，并且具有很好的 检测性能，在血清和尿样样品总蛋白的检测中，可得到比较满意的结果。 1 4 第一章前言 己报道的有机酸探针主要包括柠檬酸】、磺基水杨酸1 0 4 】、三氯乙酸1 1 0 5 】等， 其灵敏度稍低于染料探针。 纳米粒子作为探针，已有初步研究。许发功等【l “】用超声方法制备了较稳定 的无机纳米溶胶z n s z n 2 + ，该纳米粒子共振光散射峰强。研究中发现y g 球蛋 白与之结合后对共振光散射有很强的增敏作用，据此建立了以z n s z n ”纳米溶 胶为探针的共振光散射法检