（生物化学与分子生物学专业论文）基于dsaiff方法的玉米mio16∷mu基因的克隆.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 再 如需保密，解密时间年 月 日 是否保密忆 独创性声明 本人声臻所呈交的论文是我个人在导绛指导下递行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名： 柏 时润： 沁f p年，月多 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学 校要求提交学位论文的印劂本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 。部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 煳黼鼢绎嫡摊名力仉l 签名日期加p 年i 月岁日 签名日期抄( 。年6 月彳日 基于d s a i f f 方法的玉米m i o l 6 ：m u 基因的克隆 目录 摘要i a b s t r a c t i i 缩略词表 1 前言1 1 1 玉米转座子的发现1 1 2m u 因子2 1 2 1m u 因子的发现2 1 2 2m u 因子家族2 1 2 3m u 因子的转座活性4 1 2 4m u 因子的插入位点5 1 3m u 因子的遗传应用4 锄标签法( m u - t a g g i n g ) 6 1 4 分离胁侧翼序n ( u uf l a n k i n gf r a g m e n t ：m f f ) 8 1 5o p a q u e 突变研究9 1 6 本研究的目的和意义1 1 2 材料和方法1 2 2 1 突变体家系的选育1 2 2 2d n a 的制备13 2 3d s a i f f 分离朋h 侧翼序列( m f f ) 1 3 2 4m f f s 富集、回收和测序1 4 2 5 共分离分析15 2 6 生物信息学分析。1 6 2 7 总r n a 的提取16 2 8 反转录聚合酶链式反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ： r t - p c r ) 17 2 9 全长c d n a 的分离l7 2 1 0 引物设计、测序和试剂1 7 3 结果18 3 1d s a i f f 方法的探索1 8 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 2 用限制性内切酶m s p i ，m s e l 分离得到m f f s 1 8 3 3 共分离分析2 0 3 4m i o l 6 的电子定位2 1 3 5m i o l 6m r n a 表j 态2 l 3 6 基因结构与m u 因子插入位点。2 3 4 讨论2 5 4 1 关二于二d s a i f f 2 5 4 2 不同的9 b pt s d s 2 5 4 3m f f s 与表型的关系2 6 4 4m i o l 6 转录水平的异常表达2 6 4 5 下步工作计划。2 8 参考文献2 9 附录3 6 附录1 玉米叶片小量d n a 提取3 6 附录2q i a q u i c kp c rp u r i f i c a t i o nk i tp r o t o c o l 3 7 附录3d s a i f fp c r 反应体系和扩增条件3 8 附录4p a g e 电泳分子试剂及其步骤4 0 附录5t o t a lr n ai s o l a t i o n ( i n v i t r o g e n ) 。4 3 附录6r e v e r t r aa c e a 合成c d n a 第一链( t o y o b o ) 4 4 致谢。4 6 基于d s a i f f 方法的玉米m i o l 6 ：m u 基因的克隆 基于d s a i f f 方法的玉米m i 0 1 6 ：m u 基因的克隆 摘要 玉米基因组中存在大量的转座子、反转座子序列。利用各种活化的玉米转座子 可以有效地构建插入突变体库。玉米中m u t a t o r ( m u ) 转座子具有诱导高频率正向插 入突变的特点，已成为构建玉米突变体并开展分子生物学研究的有效工具。 本研究以杨文鹏博士提供的m u 插入突变体库中筛选到的不透b ) j ( o p a q u e ) 胚乳 突变体 命名为m u i n s e r t e do p a q u e l 6 ( m i o l 6 ) 为试材，以籽粒不透明胚乳为选择表 型，通过回交转育将突变基因m i o l 6 导入到野生型透明胚乳自交系q c l 2 1 7 9 背景 中，以q c l 2 1 7 9 为轮回亲本构建b c s f 2 ：3 家系；采用插入位点侧翼序列的双向选择 性扩增( d s a i f f ) 方法获得m u 插入侧翼序y l j ( m uf l a n k i n gf r a g m e n t ：m f f ) ；对 b c 3 f 2 ：3 家系进行靶基因序列和表型的共分离验证；基于公布的玉米基因组序列信 息，利用生物信息学研究方法完成m i o l 6 的电子定位；根据基因序列设计引物， 检测m i o l 6 的r n a 表达水平；使用反转录聚合酶链式反应引物扫描技术扩增 m i 0 1 6 全长e d n a ，分析m u 插入位点。获得如下研究结果： 1 采用d s a i f f 方法得到插入位点的两侧翼序列：m s e i - m f f 和m s p i - m f f 。 2 序列分析表明：m s e i - m f f 和m s p i - m f f 具有相同的9 - b p 靶位点正向重 复，证明了m s e i - m f f 和m s p i - m f f 为同一靶基因的两侧边序。 3 共分离检测研究结果表明：靶基因m i o l 6 与不透明胚乳籽粒表型相关。 4 电子定位结果表明：m i o l 6 位于玉米4 0 9b i n 。 5 r t - p c r 引物扫描的技术扩增得到的m i 0 1 6 的全长c d n a 约3 3k b ，预测其 编码的蛋白长为8 5 0a a 。m i o l 6 由1 1 个外显子和1 0 个内含子组成，m u 因子插入 距转录起始位点下游3 5b p 处的5 非转录区域( u t r ) 中。 6 r t - p c r 检测m i o l 6 的r n a 表达水平结果显示：m u 因子的插入改变了靶基 因的表达方式，并且m i 0 1 6 可能是多拷贝。 关键词：玉米；m u t a t o r 彻) 转座子；m u 插入侧翼序列；d s a i f f ；m i o l 6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 c l o n i n g t h em ue l e m e n ti n s e r t i o n a lm u t a n tg e n em i o l6o f m a i z eu s i n gd o u b l es e l e c t e da m p l i f i c a t i o no fi n s e r t i o n f l a n k i n gf r a g m e n t s ( d s a i f f ) a b s t r a c t m a i z eg e n o m ec o n t a i n sal a r g en u m b e ro ft r a n s p o s o na n dr e t r o t r a n s p o s o ns e q u e n c e s a l lv a r i o u sa c t i v e dm a i z et r a n s p o s o na r eu s e f u lt oc o n s t r u c ti n s e r t e dm u t a n tp 0 0 1 m a i z e m u t a t o r 似“) t r a n s p o s o nh a sb e c o m ea ne f f e c t i v et o o lf o rc r e a t i n gm a i z em u t a n ta n d c o n d u c t i n gm o l e c u l a rb i o l o g ys t u d yi n v i r t u eo fi t sc h a r a c t e r i s t i ct h a ti n d u c e d 1 1 i 曲- f r e q u e n c yf o r w a r di n s e r t i o nm u t a t i o n i nt h i ss t u d y , a no p a q u ee n d o s p e r m n a m e dm u i n s e r t e do p a q u e l 6 ( m i o l 6 ) w a s c h o s e na st e s tm a t e r i a lf r o mt h em u i n s e r t e dm u t a n tp o o lp r o v i d e db yd r y a n gw e n p e n g t h eo p a q u ee n d o s p e r mw a su s e da sap h e n o t y p i cm a r k e rt os c r e e nt h em i 0 16m u t a t i o n ， t h em i o l6w a sb a c k c r o s s e dw i t ht h er e c u r r e n tp a r e n tq c l 217 9 ，aw i l d t y p eb a c k g r o u n d w i t hv i t r e o u se n d o s p e r m ，t op r o d u c eab c a f 2 ：3f a m i l y ；am o d i f i e dm e t h o dn a m e l yd o u b l e s e l e c t e da m p l i f i c a t i o no fi n s e r t i o nf l a n k i n gf r a g m e n t s ( d s a i f f ) w a se m p l o y e dt o i d e n t i f yt h em uf l a n k i n gf r a g m e n t ( m f f ) o fm i 0 16 ；t h ec o - s e g r e g a t i o na n a l y s i sw a s e m p l o y e dt ov e n f yl i n k a g eb e t w e e nt h et a r g e tg e n ea n dp h e n o t y p ei nb c 3 f 2 ：3f a m i l y , b a s i n go np u b l i s h e dg e n o m i cs e q u e n c e so fm a i z e ，t h es i l i c om a p p i n go fm i o l 6w a sd o n e w i t hb i o i n f o r m a t i c ss t u d ym e t h o d s ；m e a n w h i l e ，a c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c e ，t h e p r i m e r sw e r ed e s i g n e dt od e t e c tt h er n ae x p r e s s i o no fm i o l6 ；t h ef u l l - l e n g t hc d n ao f t h ew i l d t y p ew a so b t a i n e db yr t - p c rp r i m e r - s c a n n i n gt e c h n i q u ea n da n a l y z i n gt h em u i n s e r t i o ns i t e t h i ss t u d yg a i n e dt h e s ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： 1 d s a i f fw a se f f e c t i v e l ya p p l i e dt oi s o l a t ea m b i m f f so fm i o l6 ：m s e l - m f fa n d m s p i - m f e 2 t h es a m e9 - b pt s d sw e r ef o u n dt oe x i s ti nt h em s p ia n dm s e id i g e s t e dm f f s ， t h e s em f f sw e r ev e r i f i e dt ob et h et w of l a n k i n gs e q u e n c e so fa ni d e n t i c a l l yi n s e r t e dg e n e 3 c o - s e g r e g a t i o na n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h e s et w om f f sw e r ea s s o c i a t e dw i t ht h e m u t a n to p a q u ee n d o s p e r m 基于d s a i f f 方法的玉米m i o l 6 ：m u 基因的克隆 4 t h er e s u l to fs i l i c om a p p i n gs u g g e s t e dt h a tm i o l 6w a sm a p p e di n t ot h em a i z e c h r o m o s o m e4 0 9b i n 5 m i 0 1 6g e n ec o n t a i n sa2 5 5 0 b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) e n c o d i n gap u t a t i v e 8 5 0 a ap r o t e i na n di sc o m p o s e do f11e x o n sa n d10i n t r o n s m ui n s e r t i o ns i t ei st h e + 35 d o w n s t r e a mo f t h et s si nt h e5 - u n t r a n s c r i p t i o nr e g i o n ( u t r ) 6 t h er t - p c rr e s u l to fm i 0 1 6r n ae x p r e s s i o ns h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f m i o l6h a sb e e nc h a n g e db e c a u s eo fm ue l e m e n ti n s e r t i o n ,a n dm i o l6m a yb e m u l t i - c o p i e s k e yw o r d s ：z e am a y s ；m u 幻w r ( m u ) t r a n s p o s a b l ee l e m e n t ；m uf l a n k i n gf r a g m e n t ( m f f ) ；d o u b l es e l e c t e da m p l i f i c a t i o no fi n s e r t i o nf l a n k i n gf r a g m e n t s ( d s a i f f ) ； m 0 1 6 i i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 缩略词表 i v 基于d s a i f f 方法的玉米m i o l 6 ：m u 基因的克隆 1 前言 玉米作为三大粮食作物之一，它除了是重要的粮食作物、动物的饲料和工业原 料外，也是很好的遗传研究材料。玉米遗传学研究方向之一是利用转座子系统发 现、克隆重要农艺性状基因，在这方面取得了重大的成就。自从1 9 4 7 年 b m e c l i m o e k 等提出了玉米籽粒中的某些性状的不稳定遗传与染色体的断裂融合 桥循环、基因转座有关的理论之后，加快了玉米遗传学理论发展的步伐，对玉米遗 传学理论的发展做出了重大贡献( 郑用琏，2 0 0 2 ) 。随着大量科学工作者致力于这 方面的研究使得我们对玉米转座子的理论的了解越来越深入，研究结果表明在玉米 转座子系统中m u t a t o r 转座子( 以下简称m u 因子) 的转座频率最高，活性最强， 并且是多拷i j l ( b e n n e t z e n ，1 9 9 6 ) 。m u 因子插入突变是诱导玉米产生突变基因、分 离、克隆玉米重要农艺性状基因的主要方法( m a e se ta 1 ，1 9 9 4 ；r a m a c h a n d r a na n d s u n d a r e s a n ，2 0 01 ) 。 1 1 玉米转座子的发现 转座子是一类在基因组中能进行自我复制并且能跳跃的遗传因子。现有的研究 结果表明在所有已经被关注的生物中都存在转座子( d i a oa n dl i s c h , 2 0 0 6 ) 。大量的 d n a 测序结果表明转座子在大多数真核生物的基因组中占了很大的比例：人类基 因组中大约是4 5 ( l a n d e re ta 1 ，2 0 0 1 ) ，而一些草本植物的基因组中可以达 5 0 0 0 , - - 8 0 之多( s a n m i g u e le ta 1 ，1 9 9 8 ；v i c i e n te ta 1 ，1 9 9 9 ；m e y e r se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。最早 有关转座子的研究始于1 9 1 4 年，e m e r s o n 报道了p w 基因引起玉米红，白条纹相 间的花果皮的突变遗传；1 9 3 8 年，r h o a d e s 在研究玉米糊粉层色素遗传中发现了 遗传基因( 0 0 控制另外1 个位点a 的突变和恢复突变( 郑用链，2 0 0 2 ) 。 1 9 4 8 年， b m c c l i n t o c k 首次在玉米中报道了能导致玉米基因组的重排转座子，提出了a c d s 转座子系统控制着玉米籽粒若干性状的不稳定遗传( m c c l i n t o c k , 1 9 4 8 ) 。1 9 6 0 年， p e t e r s o n ( 1 9 6 0 ) 证明在玉米中存在一个比a c d s 转座子系统更复杂的s p m d s p m 转座 系统。1 9 7 8 年，i o w a 州立大学的r o b e r s o n ( 1 9 7 8 ) 博士在玉米中发现了比a c d s ， 勋 由 拷 具 1 1 2 1m u 因子的发现 1 9 5 2 年，w i s c o n s i n 大学的b r i n k 博士发现了m u 因子的种质：在研究玉米穗 轴和果皮鞣红色基因内的a c 因子种质时发现1 个回复突变体。他试图通过7 次回 交将其导入到自交系w 2 3 的背景中，但是在第6 次回交后代中发现了存在没有彳c 因子的a c 活性：在没有检测到a c 因子存在的情况下发现其中1 个紫胶果穗上有 异常籽粒突变体的分离。k e r m i c l e 博士对该果穗做了进一步的研究：在其自交的子 代中出现了淡黄色胚乳突变体，他将这个突变体交给正在研究类胡萝卜素的突变体 的r o b e r t s o n 博士。r o b e r t s o n 博士将其命名y 9 ，他所做的遗传研究不仅发现y 9 的可遗传突变频率很高，而且还观察到不能稳定遗传的体细胞回复突变：在鉴定籽 粒和幼苗突变体时发现大约有1 3 突变体表现出体细胞回复突变的不稳定性。更进 一步的研究表明这些突变不是由先前已经报道过的a c d s ，s p m d s p m 转座子系统 引起的：因为在这两个转座子系统中自主性因子很少并且它们的分离符合孟德尔分 离规律，而与此相反的是) ，9 种质的9 0 杂交后代都含有自主性因子并且表现出很 高的突变频率，矽的诱变能力比a c d s ，s p m d s p m 转座系统的诱变能力至少高出 2 0 倍( c h a n d l e r , 1 9 9 2 ) 。因此，r o b e r t s o n 确定j ，9 是一类新型转座子系统引起的突 变，将在其后代中观察到的诱发突变的可遗传的性状定义为m u t a t o r ( m u ) 因子 ( b e n n e t z e ne t 口正19 9 3 ) 。 1 2 2m u 因子家族 在1 9 世纪8 0 年代，由于m u 因子的转座活性及诱变能力使它在研究基因和基 因分离上成为一种有效的工具。b e n n e t z e n 等( 1 9 8 4 ) 在对a d h l 的研究过程中发现 2 基于d s a i f f 方法的玉米m i o l 6 ： m u 基因的克隆 了m u l 。对胁j 克隆测序后发现其含有约2 0 0b p 的末端反向重复序列( t e r m i n a l i n v e r s er e p e a t ：t m ) 。在随后的研究中用m u l 作探针不仅检测出与其t i r 同源的 新的m u 因子类型，同时也开辟了玉米功能基因组研究的新领域。b e n n e t z e n 等 ( 1 9 9 3 ) 根据m u 因子家族各成员内部序列的特异性将它们分为6 个亚族：m u l m u 2 , m u 3 ，m u 4 , 胁鲥讹乃m u 8 , m u d r m u 5 。此6 个亚族m u 因子的测序工作已经完成， 并且详尽地了解了它们的特征和功能。随着科学研究的不断深入，其它的m u 因子 家族成员也陆续被发现：完成部分测序的m u l o ，胁j j ，m u l 2 等( d i e t r i c he ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。所有的m u 因子都有1 7 0 2 2 0b p t i r ，但是不同m u 因子的t i r 在识别和反 转录复制玉米基因组序列方面是存在很大的差异( l i s c h ，2 0 0 2 ) ；m u 因子的插入都会 在靶基因的两侧产生9 - b p 的靶位点正向重复序y u ( t a r g e ts i t ed u p l i c a t i o n ：t s d ) 。将 各亚族成员的内部序列比较后发现：在亚族中的各个成员间有同源的内部序列，例 如m u l 和m u 2 相比只有一段序列的缺失，但是在各亚族之间的成员没有全部内部 序列都有相似性的证据( b e n n e t z e n , 1 9 9 6 ) 。 根据各自的转座是否能独立发生将m u 因子分为两大类( l i s c ha n dj i a n g , 2 0 0 6 ) ： ( 1 ) 自主因子( a u t o n o m o u sd e m e n t s ) ：一类自身能编码转座发生所需要的蛋白 的转座子。m u 因子系统的转座是由自主因子m u d r 亚族调控( c h o m e t , 1 9 9 1 ； h e r s h b e r g e r1 9 9 1 ；j a m e s ，1 9 9 3 ) 。m u d r 包含2 个编码基因：m u d r a 编码启动转座发 生的转座酶m u r a 1 2 0k d ，与m u d r a 同源的基因普遍存在于各种植物( l i s c h ， 2 0 0 2 ) 、动物( m a k a r o v a l ，2 0 0 2 ) 、真菌( c h a l v e t ，2 0 0 3 ) 和细菌( e i s e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) ，表 明转座酶的基因的起源很早；m u d r b 编码的m u r b 蛋白辅助转座子插入新的位点 ( h e r s h b e r g e re ta 1 ，19 9 5 ；l i s c he ta l ，19 9 9 ；r a i z a d aa n dw a l b o t , 2 0 0 0 ；w o o d h o u s ee ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。m u d r b 至今只在玉米中被报道过( l i s c he ta 1 2 0 0 1 ) ，尽管不能详尽地阐述 m u r b 蛋白的真正功能，但是缺失衍生实验和转基因实验结果都表明m u r b 是 m u 因子插入靶基因必需的，特别是生殖细胞的转座插入( l i s c he ta 1 ，1 9 9 9 ) 。至今 为止只有两种玉米自交系含有活性的m u d r 因子，但是在其他的自交系中存在与 m u d r 的编码序列有8 0 9 9 相似性的m u d r 同源因子( h o m o l o g o u sm u d r s e q u e n c e s ：h m u d r s ) ( j i a n ge ta l ，2 0 0 4 ) 。 ( 2 ) 非自主因子( n o n a u t o n o m o u se l e m e n t s ) ：这一类因子发生转座插入事件需 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 要m u d r 的存在，不具有自发性转座的能力。只要有自主因子的存在，无论非自 主因子位于基因组的什么位置都会受到调控变得不稳定。m u d r 编码的转座酶所识 别的t i r 序列在不同的非自主因子间存在着显著的差异( c h a n d l e re ta 1 ，1 9 8 6 ；l i s c h ， 2 0 0 2 ) 。 1 2 3m u 因子的转座活性 玉米中m u 因子发生转座的方式主要有两种( n o r d b o r ga n dw a l b o t , 1 9 9 5 ；b r i t t a n dw a l b o t , 1 9 9 1 ) ：一种是体细胞切除。切除和插入发生在体细胞或组织的发育晚 期，这种转座方式的回复突变频率较高但不可遗传。m u 因子有两种已被证实的体 细胞切除类型：剪切和剪切粘贴。只发生剪切的转座子切除方式不能在基因组中 其他的位点产生插入事件；剪切粘贴是d n a 转座子典型的转座模式且与基因组中 发生再插入事件有关；另一种是发生在生殖细胞中的插入转座。这是在m u 自交系 中产生稳定的可遗传的新突变的主要来源，但是这种方式引发的回复突变频率与体 细胞切除方式相比要低很多。无论是哪种转座方式都会使被插入的基因产生突变。 有关m u 因子的切除的研究大多数都是以与花青素合成相关的基因为报告基因，例 如a l - m u m 2 ( c h o m e te t 以，1 9 9 1 ；p o o m ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，因为这类基因中有颜色的斑点 表型很容易被观察。对大量的广泛分散的基因位点的研究表明m u 因子能插入到绝 大多数基因中，插入频率在1 0 弓1 0 弓之间。而真实的插入频率要比大多数研究所 观察得到的数据要高：因为很大比例的m u 因子引发的突变在m u 诱导后表型受到 了抑制( m a r t i e n s s e ne ta l ，1 9 8 9 ；b e r m e t z e ne ta 1 ，1 9 9 3 ；m a r f i e n s s e na n db a r o n ，1 9 9 4 ) ； 另外，包括短的相邻缺失和复制在内的基因组重组类型也和m u 因子相关( t a y l o r a n dw a l b o t ，1 9 8 5 ；l e v ya n dw a l b o t , 1 9 9 1 ；s t i n a r de ta 1 ，1 9 9 3 ) ，这两种情况就可能导 致对插入突变事件的观察误差，降低真实突变频率。因为大多数自然发生的插入是 没有活性的，所以m u 因子插入诱发的突变绝大多数是隐性的，但是比例较少的显 性突变也存在，在m u 因子的种质中也发现了k n l ，a e l 和l e s 的显性突变体 ( b e n n e t z e ne ta 1 ，19 9 3 ；s t i n a r de ta 1 ，19 9 3 ；g r e e n ee ta l ，19 9 4 ；m a r t i e n s s e na n db a r o n , 1 9 9 4 ) 。 m u 因子的转座发生后会影响被插入基因或邻近位点基因的表达( m c c l i n t o c k , 1 9 5 6 ) 。最主要的是两种影响方式：一是改变转录水平的表达或者组织特异性表 4 基于d s a i f f 方法的玉米m i o l 6 ：m u 基因的克隆 达。在研究a d h l ：m u 3 的组织特异性时观察到在根和盾片中它的表达只有野生型的 1 0 ，而在花粉中的表达却没有任何变化。原因在于m u 3 因子插入到a d h l 基因启 动子区使得基因预定转录起始位点( t r a n s l a t e ds t a r ts i t e ：t s s ) 的t a t a 盒的相邻侧翼 序列发生复制加倍。m u 因子的插入与m r n a 量的积累改变，根部m r n a 的起始 位点的改变有直接的关系( c h e r te ta 1 ，1 9 8 7 ；k l o e c k e n e r - g r u i s s e me ta 1 ，1 9 9 2 ) 。针对 s h l 非组织特异性的转录水平的改变的研究结果表明：m u l 插入到s h lt s s 上游2 b p 时s h l 的m r n a 的表达量降低到正常水平的4 ，没有组织特异性。这是由于 m u l 的插入引起了转录起始位点移至m u 因子5 - t i r 中，改变了m r n a 的转录和 转录后力l l - v ( o r t i ze ta 1 ，1 9 8 8 ；s t r o m m e ra n do r t i z ，1 9 8 9 ) ；与上面的例子相反的另外 一种方式是抑制基因。抑制是m u 因子诱发的突变的特征之一。转座子的活性状态 决定抑制基因的现象。m u 因子抑制基因的例子包括l e s 2 8 ( m a r t i e n s s e na n db a r o n ， 1 9 9 4 ) ，h c f l 0 6 ：m u l ( m a r t i e n s s e n , 1 9 9 0 ) ，a l - m u m 2 ( c h o m e te ta 1 ，1 9 9 1 ；p o o m ae ta 1 ， 2 0 0 2 ) ，够( g i r a r da n df r e e l i n g ，2 0 0 0 ) ，k n l ( l o w ee ta 1 ，19 9 2 ；g r e e n ee ta l ，19 9 4 ) 和 卯口( g i r a r da n df r e e l i n g ，2 0 0 0 ) 的突变基因。它们表现出的普遍现象是在m u 因子活 性不存在时突变基因的表型和突变之前基因的表型一样。现在对于m u 因子抑制的 机制还不是十分清楚( l i s c h ，2 0 0 2 ) 。 通常有四种检验方式用来说明m u 因子的活性( w a l b o ta n dr u d e n k o ，2 0 0 2 ) ： 1 ，考察突变体报告基因的体细胞的稳定性，如扇形叶，籽粒和花药； 2 ，用特异的识别t i r 区域甲基化位点的酶( 如h f u i 识别m u l ，勋c ，识别 m u d r ) 检测m u 因子的序列是否存在甲基化； 3 ，检测后代植株中是否有新的插入突变； 4 ，是否存在新的生殖细胞的插入事件使得正向突变频率提高。 1 2 4m u 因子的插入位点 最初通过探针杂交实验对m u l 片段的研究表明这个亚族的因子偏好插入到非 甲基化的d n a 区域( b e n n e t z e n ，1 9 8 5 ；b e n n e t z e ne t a l ，1 9 8 8 ，1 9 9 4 ) 。这是因为非甲基 化区域在玉米基因组中是基因的标志( a n t e q u e r aa n db i r d ，1 9 8 8 ；w a l b o ta n dw a r r e n ， 1 9 9 0 ；b e n n e t z e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。c a p e l 和他的同事( 1 9 9 3 ) 研究发现m u i 因子和其他的 m u 因子的转座都和低g c 含量d n a 区域有关联。并且还发现了m u 因子插入到启 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 动子、5 非转录区域( 5 u n t r a n s c r i p t i o nr e g i o n ：5 - u t r ) 、外显子和内含子中。但是 对于m u 因子怎么样插入到它们所偏好的基因区域的机制知道的很少。在m u 因子 插入到靶基因的过程中发生作用的区域与染色质构造、d n a 甲基化、重组活性等 有不同程度的关联。对3 3 9 个m u 因子的9 - b pt s d 的分析结果与 c t c ( t c g ) ( g c ) ( a c ) ( g a ) ( a g ) c 的一致性很差( c r e s s ee ta 1 ，1 9 9 5 ；h a n l e ye ta 1 ， 2 0 0 0 ；d i e t r i c he ta 1 ，2 0 0 2 ；f e m a n d e se ta 1 ，2 0 0 4 ) ；但是在与9 - b p 紧密相联的侧翼序 列中发现c c t - t s d a g g 的保守序列。m u 因子对于某一基因存在插入热点：在位 点选择突变基因的实验中，h c f l 0 6 基因中m u l 的3 个独立插入的位点一样( d a s a n dm a r t i e n s s e n ，1 9 9 5 ) ；在另外的研究中也发现了与此相似的结果( d i e t r i c he ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。由此可见不同的m u 因子偏爱的序列有差异。有一个很好的实验证明是： 在b z l 基因中m u l 因子的插入是唯一的，但是与它紧密连锁的s h l 基因却是 m u d r 的靶基因( h a r d e m a na n dc h a n d l e r , 1 9 8 9 ，1 9 9 3 ) 。由于m u l 和m u d r 的转座是 由同样的转座酶调控的，可以推断插入的偏爱性可能由转座元件和转座酶共同决定 ( l i s c ha n dj i a n g ，2 0 0 6 ) 。 1 3m u 因子的遗传应用- m u 标签法( m u - t a g g i n g ) 转座子标签法是玉米功能基因组学研究的主要的方法之一。m u 因子标签法的 优点在于它能够插入到玉米的任意染色体中；与a c d s ，s p m d s p m 相比具有较高 的诱发突变的频率；转座偏爱插入到基因中和基因附近区域。在玉米中用m u 标签 法已经成功地克隆和鉴定了与玉米籽粒发育，叶鞘发育，小穗发育，醇溶蛋白( z e i n ) 合成等相关的基因( d i a oa n dl i s c h ，2 0 0 6 ) 。 m u 标签法在玉米中主要用于两个方面( 高友军等，2 0 0 2 ) ：( 1 ) 正向遗传学研 究( f o r w a r dg e n e t i c s ) 。在非定向插入的突变体表型观察中，发现感兴趣的突变表 型，通过各种分子技术找到与表型共分离的基因，确定突变表型与m u 因子的插入 相关。从而克隆到与此表型相关联的目的基因；( 2 ) 反向遗传学研究( r e v e r s e g e n e t i c s ) 。利用m u 因子的插入突变功能，对目的基因进行定向插入，该位点诱变 会产生异常的表型，进而阐述目的基因的功能。反向遗传学的研究需要近饱和突变 的群体，这是为了保证m u 因子插入到目的基因的最大可能性。 将m u 标签法用于遗传学研究的策略有定向标签法( d i r e c t e dt a g g i n g ) 和随机标 6 基于d s a i f f 方法的玉米m i o l 6 ：m u 基因的克隆 签法( n o n - d i r e c t e dt a g g i n g ) ( s e t t l e s ，2 0 0 9 ) 。 ( 1 ) 定向标签法( d i r e c t e dt a g g i n g ) ：将m u 活性品系与没有被m u 因子标记基 因的纯合的突变体材料杂交。在f 1 代中观察突变表型，选出那些与对照表型有差 异的非致死单株。将其自交或者与测交品系杂交，使突变位点与对照非目的突变基 因分离。根据表型选择目的单株，再将其自交产生分离群体。这种方法能得到特异 位点的插入突变体。 ( 2 ) 随机标签法( n o n d i r e c t e dt a g g i n g ) ：纯合自交系与m u 活性品系杂交，在基 因的全基因组都能产生插入突变位点，得到m l 代，m 1 自交后产生m 2 家系，在 m 2 家系中会出现插入突变基因的表型分离：幼苗的突变表型( 白化苗，矮生苗 等) ，果穗上的种子突变表型( 胎生，皱缩，不透明等) 。进一步用遗传实验方法 对感兴趣的表型进行共分离分析并克隆该基因。 定向标签法只适合于玉米生长周期中非必需的基因：如果必需基因被诱发突变 产生致死或不育表型，则会将突变频率降低，影响工作效率。可以采用随机标签法 克服这方面的不足。很多致死或不育的目的基因都是随机标签法克隆得到的。对于 如何选择何种方法根据研究者的实验需要，综合考虑各方面的因素，选取最实际可 行的策略。在美国现有3 个比较大的项目利用m u 标签法对玉米的功能基因组进行 研究( d i a oa n dl i s c h ，2 0 0 6 ) ：先锋种子公司的玉米性状利用系统，该系统基于大约 4 5 ，0