（分析化学专业论文）化学发光微流动注射芯片在食品安全中的应用研究.pdf

化学发光微流动注射芯片在食品安全中的应用研究 裴翠锦 摘要本论文由综述和研究报告两部分组成。 第一部分为综述部分，介绍了微流动注射芯片的原理、分类、制作过程、主 要技术、检测手段，简要概括和总结了近年来微流动注射芯片的研究进展，重点 对微流动注射芯片化学发光检测作了综述，并展望了这种芯片未来的发展趋势。 第二部分为研究报告，包括四部分： ( 一) 在微流动注射芯片上设计了螺旋形流通池，采用精确时问控制进样方 式，结合四环素( t c ) 对l u m i n o l h 2 0 2 化学发光体系的抑制作用，建立了化学发光 微流动注射：卷片测定鱼虾中四环素的新方法。该系统中螺旋形反应池由激光雕刻 机在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ，5 0 m m 4 0 m m x3 r a m ) 上雕刻而成。在实验所建立 的最佳条件下，该方法在2 0 1 0 - 71 0 1 0 。5 9 m e 范围内具有好的线性关系，检 出限为1 7 1 0 - s g m e ，相对标准偏差r s d 为1 7 ( n = 1 1 ，c = 5 0 1 0 - 7 9 m l ) ，已应 用于食品安全检测中鱼虾肉内四环素的残留测定。 ( 二) 利用激光雕刻机在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ，5 0 m m 4 0 m m 3 m m ) 上 雕刻微流动注射通道，采用精确时间控制进样模式，基于氯霉素在碱性介质中对 l u m i n o l k 1 0 4 化学发光体系的增敏作用，建立了化学发光微流动注射芯片测定氯 霉素的新方法。在实验所建立的最佳条件下，该方法在8 0 1 0 - s m 0 1 0 - 4 9 , m l 范围内具有很好的线性关系，检出限为6 0 x l o - s g m l ，相对标准偏差r s d 为1 5 f n = 1 1 , c = 1 0 1 0 - 5 9 m l ) 。与常规的流动注射化学发光分析法相比，该：艺= 片具有简 单、快速、灵敏度高、耗样量少等特点，己应用于食品安全检测中氯霉素的残留 测定。 ( 三) 在微流动注射芯片上设计了蜿蜒形的流通池，结合氢化可的松 ( h y d r o c o r t i s o n e ) 对l u m i n 0 1 k 3 f e ( c n ) 6 化学发光体系的增敏作用，建立了化学发 光微流动注射芯片测定注射液中氢化可的松含量的新方法。该系统中所用的反应 池由激光雕刻机在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ，5 0 m m 4 0 m m 3 n m a ) 上雕刻而成。 在实验所建立的最佳条件下，该方法在8 0 x1 0 8 8 0 x1 0 4 9 m l 范围内具有较好 的线性关系，检出限为4 1 0 一g m e ，相对标准偏差r s d 为1 3 ( n = 1 1 ，c = 8 0 1 0 一g m l ) ，与常规的流动注射化学发光分析法相比，该芯片具有制作简单、操作 方便、灵敏度高、分析速度快、尤其是耗样量少等特点，已应用于注射液中氢化可 的松含量的测定和食品安全中氢化可的松残留的测定。 ( 四) 基于在酸性介质下，磺胺嘧啶与碱性l u m i n o l 能产生化学发光，建立 了化学发光徽滚动注射芯片溺定鸡肉中磺胺嚏睫熬方法。该芯片上徽逯遂由激光 蘼袤l 执在聚甲基嚣爝酸攀鹣( p i v i m a ，5 0 t u r n x 4 0 r a m x 3 n - a n ) 土壤瓣 掰或，采矮糖礁 时间羧制迸样的方式检测，测定磺胺嘧啶线能范围为4 0 x1 0 4 5 0 1 0 。g m l ， 检出限1 0 1 0 一g m l ；对2 0 1 0 。7 9 m l 磺胺嘧啶连续1 1 次测定的相对标准偏差 r s d 为1 4 ，已用于食晶中磺胺嘧啶残留的测定。 哭键诵激流动注麓蕊片嶷二学发光食赫安全 l l t h ei n v e s t i g a t i o na n da n a l y t i c a la p p l i c a t i o no fm i c r o - f l o wi n j e c t i o n c h i p sb a s e do nc h e m i l u m i n e s c e n c ei nf o o ds a f e t y c u i j i np e i a b s t r a c ti h i st h e s i si n c l u d e sar e v i e wa n dar e s e a r c hs e c t i o n i nt h er e v i e w , t h ep r i n c i p l e ，f a b r i c a t i o n ，t e c h n i q u e s ，c h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o f l o w i n j e c t i o nc h i p a r e p r e s e n t e d ，r e s p e c t i v e l y t h em e t h o d so fc h e m i l u m i n e s c e n c e d e t e r m i n a t i o nf o rt h em i c r o - f l o wi n j e c t i o nc h i pa r er e v i e w e dm a i n l y , a n dt h ep r o s p e c t o ft h i sc h i pi sv i e w e d t h er e s e a r c hs e c t i o nc o n t a i n sf o u rs u b u n i t s i nt h ef i r s ts u b s e c t i o n ，am i c r o f l o wi n j e c t i o ns y s t e mo nac h i pw a sp r e p a r e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft e t r a c y c l i n ei n f i s ha n ds h r i m p ，b a s e do nl u m i n o l h 2 0 2 c h e m i l u m i n e s c e n c e s p i r a l f l o wc e l lc h a n n e l sw e r ef a b r i c a t e d u s i n gl a s e r o n p o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) w ec o n t r o l l e dt h es a m p l i n gt i m ep r e c i s e l yb ya t i m e r t h e l i n e a rr a n g e w a s2 0 x 1 0 1 1 0 1 0 5 9 m l w i t h t h ed e t e c t i o n l i m i to f l 7 1 0 一g m l ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sr s d 2 1 ，7 ( n 2 1 1 , c 2 5 0 1 0 g m l ) ， t t i ec h i pi ss i m p l e ，r a p i da n dh i g hs e n s i t i v ew i t hl e s sr e a g e n tc o n s u m p t i o n t h e p r o p o s e dm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft e t r a c y c l i n ei n f i s ha n ds h r i m p i nt h es e c o n ds u b s e c t i o n ，i tw a sf o u n dt h a tt h ew e a kc ls i g n a lo fl u m i n o l k 1 0 4 w a sg r e a t l ye n h a n c e db yt h ec h l o r a m p h e n i c o li na l k a l i n em e d i a ，an o v e lm i c r o - f l o w i n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc h l o r a m p h e n i c o lw a s d e s c r i b e di nt h i sp a p e r t h ef l o wc h a n n e l sw e r ef a b r i c a t e du s i n gl a s e ro np o l y ( m e t h y l m e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) w ec o n t r o l l e dt h es a m p l i n gt i m ep r e c i s e l yb yat i m e r u n d e r t h es e l e c t i n ge x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h el i n e a rr a n g ew a s8 , 0x10 - 8 _ 1 o 10 。4 9 m l w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f6 1 0 一g m l ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s r s d 2 1 5 ( r f l l , c 2 1 0 x1 0 g m l ) ，t h ep r o p o s e dm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l y a p p l i e dt ot h er u d i m e n t a ld e t e r m i n a t i o no fc h l o r u m p h e n i c o li nf o o ds a f e t y i nt h et h i r ds u b s e c t i o n ，am i c r o f l o wi n j e c t i o ns y s t e mo nac h i pw a sp r e p a r e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fh y d r o c o r t i s o n ei n i n j e c t i o n b a s e do nl u m i n o l - k 3 f e ( c n ) 6 c h e m i l u m i n e s c e n c e s i n u o u sf l o wc e l lc h a n n e l sw e r ef a b r i c a t e du s i n gl a s e ro n p o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) w ec o n t r o l l e dt h es a m p l i n gt i m ep r e c i s e l yb ya t i m e r t h el i n e a rr a n g ew a s8 0 1 0 一8 0 1 0 5 9 m lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f4 1 0 一g m l ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sr s d = i 3 ( n = 1 1 , c = 8 0 1 0 。6 9 m l ) ， t h ec h i pi ss i m p l e ，r a p i da n dh i g hs e n s i t i v ew i t hl e s sr e a g e n tc o n s u m p t i o n t h e p r o p o s e dm e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fh y d r o c o r t i s o n e i ni n j e c t i o n i nl a s t s u b s e c t i o n ，am i c r o f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m f o r d e t e r m i n a t i o no fs u l f a d i a z i n ew a sd e s c r i b e d ，b a s e do nl u m i n o l s u l f a d i a z i n es y s t e m t h ef l o wc h a n n e l sw e r ef a b r i c a t e du s i n gl a s e ro np o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) w ec o n t r o l l e dt h es a m p l i n gt i m ep r e c i s e l yb yat i m e r u n d e rt h es e l e c t i n ge x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s ，t h ec h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw a s l i n e a rw i t hs u l f a d i a z i n e c o n c e n t r a t i o n so f4 0 x1 0 。8 5 0 1 0 g m l ，t h ed e t e c t i o nl i m i tb e i n g1 o x1 0 一g m l ， a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sr s d 2 1 4 ( n 2 1 1 ，c = 2 0 1 0 g m l ) k e y w o r d s m i c r o f l o wi n j e c t i o nc h i pc h e m i l u m i n e s c e n c ef o o ds a f e t y 学位论文独创性声明 v 9 0 0 d l 二 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文 中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕 西师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢 意。 作者签名：日期：v j 啪 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕 西师范大学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时 署名单位仍为陕西师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部 门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于 非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论 文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：筵霪童星日期：里! 型：业 第一部分综述 微流动注射系统研究进展 1 1 引言 自1 9 7 5 年引入流动注射分析技术以来川，该领域中出版的有关专著已达2 0 余部，发表的研究论文已超过1 3 8 0 0 篇1 2 j 。从如此大量的文献中可以清楚地看出 流动注射分析技术发展的脉络。但是，面临着2 1 世纪科技发展中提出的众多挑战， 分析科学也正经历着深刻的变革，其中一个日益明显的发展趋势就是化学分析设 备的微型化、集成化、便携化。流动注射分析技术只有向这个方向靠拢才能更具 生命力，才能发挥更大的作用。当前分析科学与仪器的发展前沿微全分析系统 ( 一t a s ) ，其最终目的是通过分析化学设备的微型化与集成化，晟大限度地把分析 实验室的功能转移到便携的分析设备中( 如各类芯片) ，实现分析实验室的“个人 化”、“家用化”，由此可见，发展微流动注射无疑是对g - t a s 有关技术平台的重 要补充。 1 2 原理及加工技术 微流动注射系统的构建有两种主要的方法：一种是芯片实验室，这种方法是 把整个分析系统微型化【3 。l ，其优点是实现了化学分析系统从试样处理到检测的整 体微型化、自动化、集成化与便携化。另一种方法是混合型，就是把流动注射系 统中的某一个核心部件( 如采样部件、混合池、反应池等) 微型化【6 4 】，其它部件 是常规方法制作，其优点是制作成本低，适合普通实验室普遍使用，这种方法文 献中多以芯片形式报道。 用于制作微流动注射芯片的材料有单晶硅、无定形硅、玻璃、石英、金属和 有机聚合物如环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲j 目( p m m a ) ，聚碳酸脂( p c l 和聚二甲基 硅氧烷( p d m s ) 等。硅与二氧化硅具有良好的化学隋性和热稳定性，但其绝缘性和 透光性较差，在硅片上可用光刻技术高精度的进行刻制，因而被首先用于制作芯 片。玻璃与石英有很好的电渗性质和优良的光学性质，而且其表面性质如湿润能 力、吸附、表面反应性等都有利于利用不同的化学方法对其进行表面改性。使用 光刻和蚀刻技术可以将微通道网络刻在玻璃石英上，因此玻璃和石英材料已被广 泛地应用于制作芯片。高分子聚合物材料多样，可供选择余地大，成型容易，批 量生产成本低，易获得高深宽比的微结构，具有能可逆和重复变形而不发生永久 性破坏，能透过3 0 0 n m 以上的紫外和可见光，具有一定的化学惰性、无毒、价廉， 但其对短波长可见光有一定的吸收。目前p d m s 已被广泛地用于制备微芯片。 微流动注射通道的制作起源于微机械单片集成电路装置的制作，采用标准集 成电路照相平版印届o ( s t a n d a r di cp h o t o l i t h o g r a p h i c ) 技术、蚀亥o ( e t h c h i n g ) 技术、键 合( b o n d i n g ) 技术等制成平面结构【9 j 。前些年用于制作微流动注射系统的材料主要 集中在硅材料及玻璃上，采用光刻和蚀刻技术雕刻微通道网络，主要加工步骤如 图l 所示1 1 0 】。在加工微流动注射芯片时，需要在基片上沉积各种材料的薄膜后再 进行光刻。制造加工薄膜的主要方法有氧化、化学气相沉积】、蒸发、溅射【l 2 】 等。在光刻过的基片上通过湿法刻蚀( w e te t c h i n g ) ”驯或干法刻蚀( d r ye t c h i n g ) 1 4 1 的 方法将光胶层上的平面二维图形加工成具有一定深度的立体结构。湿法刻蚀的刻 蚀剂是水溶液，干法刻蚀的刻蚀剂则是等离子体【l ”。还有其它一些玻璃、石英芯 片的加工方法i ” i7 1 。 弋圣m a s k s t e p2 d 口v e k p “g s e p3 s l e p4 s b s t 协 班c h 虫婚s i r c m o - a lo l p h o t o 辨s 辖i a n d hr _ 口m j u n l a y e r l ； r 、“o f p h o t or t 5 i s l t r c m m io 0 5 口c h r o m i u m j b ”| d l z m j t 拍kb p ，。d l t d 地n n 蝴j f u n c t i o n o t j n 世j 话t e m p e r a _ ut o s u b s t a l em d yb r u r b * h i 7 o f 图1 各向异性蚀刻制作微流动注射装置 f i g 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h es t e p si n v o l v e di n h ea n i s o i r o p i c e t c h i n gf o r t h ef a b r i c a t i o no f g - f i ad e v i c e s t h ea r r o wi ns t e p1 r e p r e s e n t sr a d i a t i o n 高分子聚合物基片上制作微通道的技术有膜塑法【1 8 】、热压法( h o t e m b o s s i n g ) 1 9 - 2 1 1 、l i g a 技术口2 1 、激光烧蚀法( 1 a s e ra b l a t i o n ) 2 3 - 2 5 】和软光刻( s o f c l i t h o g r a p h y ) 1 2 6 , 2 7 】等。使用模塑法的分辨率高，相邻通道距离为0 3 9 m 微结构也能 用模塑法复制，模塑法即用光刻与蚀刻的方法先制出通道部分突起的阳模，然后 在阳模上浇注液态的高分子材料，将固化后的高分子材料与阳模剥离后就得到具 有微通道的芯片，与盖片封接后，制得高分子芯片。激光烧蚀法是一种新的微细 加工技术，它可直接根据计算机c a d 数据进行复杂的微加工，它是一种非接触 的加工工具，在加工微模和微通道中己得到应用，由于光刻需要昂贵的设备和超 净实验室，也不能在曲面上加工微结构，近来哈佛大学w h i t e s i d e s 教授研究组为 主的多个研究集体，发展了一种新的低成本的微细加工新技术“软光刻”，它不仅 可在高聚物等材料上制造复杂的三维微通道，而且可以改变材料表面的化学性质， 有可能成为生产低成本的微流动注射分析芯片的新方法。还有其它一些聚合物芯 片加工方法耻“j 。 刻有微通道的基片上面必须要封合。基本的方法有热键合( f u s i o nb o n d i n g ) 和 阳极键合( a n o d i cb o n d i n g ) 两种。玻璃和石英材料的微流控芯片一般用热键合的方 法封合。高温炉升温速度为1 0 v m i n ，在6 2 0 时保温3 5 h 再以1 0 。c m i n 的速率降 温【3 0 。热键合能否成功的关键是待键合的硅片玻璃和石英的洁净度和平整度，所 以严格清洗或在超纯水环境中进行可大大提高芯片键合质量和成品率i j ”。为防止 热键合可能发生的通道变形甚至塌陷，阳极键合引起了人们的广泛关注。b e r t h o l d 等人通过在玻璃表面沉积上一层薄膜材料如多品硅、氮化硅为中问层，在约7 0 0 v 的电场下，升温到4 0 0 。c 时使两块玻璃片键合，完成了阳极健合口。b o l m 等还进 行了指定位点的阳极键合【3 3 1 。将基片和盖片表面用等离子体处理或紫外线照射的 封合技术也逐步成熟【3 4 , 3 5 】。还有黏合和低温键合等其它一些键合方法【3 6 1 。 1 3 微流体的驱动和控制 1 3 1 进样方式 微流动注射主要有基于时间和基于体积两类进样方式。基于时间的进样方式 中试样体积由注样流速和注样时间决定。这种方法流路简单，注样体积可调，但 存在歧视效应，且换样不方便。1 9 9 4 年，j a c o b s o n l 3 提出门式进样法( g a t e di n j e c t i o n ) 通过控制充样电压和时间可以控制进样量，该法便于换样，但歧视效应依然存在。 基于体积的进样方式，最常用的有使用包括采样环( 体积一定) 的旋转式阀或滑 剐3 8 i 、三通螺线管阀、采样环进样3 9 。4 ”、自动取样器进样1 4 2 1 、注射器进样1 4 3 ，删 等。这种方式可减少液体样品的扩散。电渗流驱动方式进样通常其通道为“十” 形 4 6 , 4 7 1 或“双t ”形 4 8 , 4 9 。这样可以消除注样过程的歧视效应，但进样体积固定， 且液流泄漏比时间进样更为严重。此外还有悬空液滴进样【5 0 , 5 1 】等。 1 3 2 微泵与微阀 微流动注射系统中的操作核心是对流体的控制，基本技术包括：微泵控制、 微阀控制、芯片微通道构型控制、通道表面性质控制。虽然电渗流是主要的控制 手段，但对于有机相反应、生成沉淀或气体的反应就受到了局限。目前对微泵主 要有体积、流速、泵压三方面的要求。体积方面尽可能小，流速要求重现性好， 泵压则依不同分析要求而不同。目前出现的微泵类型有压电微泵【5 2 1 、可加热气室 致动的热气动微泵【5 3 】、静电微泵【5 4 】、离心力驱动泵 5 5 l 、重力驱动泵【5 6 1 、热毛细作 用泵 5 7 】、直线型蠕动致动的气动微泵【3 ”、活塞型微泵【5 8 】、平面微离子拖拉泵【59 1 。 己报道的微阀有三通螺线管阀 4 5 】、旋转式阀( 滑阀) 3 9 】、硅树脂橡胶膜阀 6 0 , 6 1 1 等。 1 4 微型混合器和反应器 由于分析系统微型化后，出现了典型的低雷诺数的层流特征，流体不易达到 均匀混合，从而影响了检测的灵敏度和检出限。为克服这一障碍，人们开展了关 于混合器和反应器的一系列研究工作。v e e n s t r a 等【6 2 设计了基于扩散的混合器并 用于酚和水的混合。l i u 等【6 w 利用三维的逶迤形盘管来促进混合。b e s s o t h 等 删 制成了分流混合装置在1 5 m s 内可达到9 5 的混合，这一装置已经实现商业化。 j a c o b s o n 等【6 5 j 提出了平行和连续微混合器，电渗流作驱动力，实现了样品的混合。 s t r o o c k 等【6 6 j 还研究了微管道长度与混合程度之问的关系。还有人用超声振荡的方 法制成混合器【6 ”。j o h n s o n 等人1 6 研提出在管道底部刻蚀出一些倾斜的内壁达到快 速混合。总之，各种各样的混合器都是通过破坏系统固有的层流状态引入湍流、 对流或增加扩散从而实现快速混合。已报道的一些微型反应器有化学反应器【6 9 】、 酶反应器1 7 0 、免疫反应器1 7 l 】、以提高检测灵敏度为目的的柱后反应器【7 “、以为 检测需要而进行衍生反应或为分离需要而进行试样预处理为目的的柱前反应器【3 7 以及凝胶反应器等1 7 。 有些设计中的微型流通池反应器既起到混合器的作用，也起到反应器的作用。 典型的有蜿蜒形和螺旋形流通池，m u r a k a m i 掣”j 通过各向异性蚀刻法在n 型硅 晶体( 7 0 m m 7 0 m m 0 5 m m ) 表面蚀刻成蜿蜒形流通池，流通池的长2 6 3 6 c m ，宽 1 0 0 9 m ，深7 0 1 a m ，内表面固定葡萄糖氧化酶，通道区域面积2 8 5 m m 3 9 m m 。 z h a n g 等【75 】用聚四氟乙烯毛细管( 内径1 0 0 9 m ，长为7 5 c m ) 绕成螺旋形微流通池， 体积5 5 p l 。k i b a 等1 76 】通过各向异性蚀刻法在硅芯片( 2 5 m m 2 5 m m l m m ) 上制 成螺旋形微通道流通池，该微通道流通池长5 0 c m ，宽1 5 0 i _ t m ，深2 0 9 m ，共2 0 圈，体积1 4 9 l ，酶固定在微流通池通道内表面f 如图2 ) 。 1 5 分离与富集 微流动注射系统中分离方法有多种，t a n g 等【7 7 l 用玻璃管( 长2 0 0 c m ，内径 4 0 2 0 c m ) 制成微型聚酰胺树脂柱在线分离富 集矿物中的微量a u ”。s u 等【78 】设计了微型活 性碳柱来富集分离测定c d 、m n 、p b 。c h a r l e s 等【7 9 j 用微石英液相色谱柱在线分离葡萄球菌 肠毒素b ( s e b ) 。w e i 等1 5 副提出微流动注射与 三孔的膜池( 三乙醇胺( t e a ) 作为吸收剂) 结 合，在线富集并测定大气中的n 0 2 ，建立了 一种简单、快速、灵敏度高、费用低廉的在 线、短时间检测大气中的n 0 2 的方法。 a n d e r s e n 等唧1 用p h 梯度离子交换色谱法对脱 。警篡流翌挚雾意图， 脂牛奶中的蛋白质等电点分离，该方法是由 。t h e m i c r on o 、v 二 微型的流通p h 探针和阴离子交换毛细管柱组 成。毛细管电色谱分离以电渗流作为驱动力，在毛细管中填充体积约为3 u m 的小 粒子的介质，根据填充介质属性不同选择分离不同的物质，它以平头流型的电渗 流代替了普通色谱的抛物线型压力流，因此具有毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i sc z e ) 的高效柱特点，另外，它还使用固定相，故又具有h p l c 的高 选择性特点，所以既能用来分离带电物质也可分离中性物质，微型化加工简便【8 “。 场流动分馏法的物理效应作为分离过程也被合并在毛细管系统中【8 “，借助外力如 磁力、重力推动馏分到通道壁；停止外力，样品馏分通常以分子大小【8 3 , 8 4 j 逐渐扩 散到液流中。 此外，微流动注射系统中的分离方法还有固相萃取分离，液一液萃取分离， 过滤分离等。固相萃取分离是利用选择性吸附和选择性洗脱的分离原理，达到分 离富集的目的。t e m p e l s a 等i 鼬j 通过t 型裂口界面把固相萃取( s p e ) 柱和毛细管电泳 f c e ) 相联合起来，充分利用了固相萃取柱在线富集与毛细管电泳在线分离的优点， 此方法己应用于脑啡肽的混合物的测定。h a l v o r s e n 等 86 】用超临界液相萃取( s f e ) 和微液相色谱( g l c ，在毛细管中均匀填入粒径5 9 m 的k r o m a s i l1 0 0 c 1 8 ) 相结合的 方法，测定苹果中的杀螨王。z e n g x u a nc a i 等【87 1 建立了微流动注射芯片湿膜 ( w e t t i n gf i l m ) 液一液萃取方法，用于痕量分析和芯片检测。他们在聚碳酸脂片上制 作了疏水微通道，湿膜被覆于通道内壁，富集效果达到了2 4 倍，测定罗丹明b 的 检测限为6 0 1 0 9 m o l l 。过滤分离法主要用于将试样中的不溶性颗粒除去。h e 等【8 8 】制成了横向过滤器，它由通道内多个立方型微柱构成，流体流过时，直径大 于1 5 u m 的微粒被拦截在柱的上方，而滤液则横向流过滤床。k h a n d u r i n a 等【8 9 】贝0 通 过过滤膜实现了大分子的预富集。 1 6 各种检测方法及化学发光检测研究进展概述 微流动注射芯片极大地降低了样品与试剂的使用量及器件的尺寸，发展与之 相匹配的检测技术是微芯片技术发展的关键问题之一。基于不同检测原理的众多 检测方法已被运用于微芯片分析的研究中，常用的检测方法有激光诱导荧光法、 质谱法、电化学检测法、化学发光法等。 1 6 1 激光诱导荧光法( l i f ) 到目前为止，在微流动注射芯片分析系统中应用最广泛的检测器是激光诱导 荧光( l i f ) 检测器【9 。激光诱导荧光法用于微流动注射系统检测时，多用氩离子激 光器或氦氖激光器作激发光源【9 1 1 。h a r r i s o n 等【9 2 j 用6 3 5 n m 的红色激光二极管作为激 发光源，设计出一种用激光诱导荧光法检测的方法。二极管激光器体积小，更适 合于微型化。但是，这种半导体激光器仅适用于红外光和红区光做激发的荧光物 质，大大限制了激光诱导荧光的使用范围。新型的紫色激光二极管已经上市，并 已成功地用于传统的毛细管电泳，但其寿命短而价格高，从而限制了它的推广应 用【9 3 】。最近，w e b s t e r 掣9 4 搬道把检测器和干涉滤光片偶合在一起放在光刻硅片上， 减化了外光路和准光系统，向激光诱导荧光检测小型化集成化迈进了一步，但制 造技术要求更高。g o s c h 等【95 】研究了微通道中液体的流动模式，并成功地对一荧 光染料进行单分子检测。另外，z u g e l 等【96 j 论证了在芯片上用双光子激发荧光检测 的可能性，该方法可以改善检出限，但需要更精密的仪器。利用辅助通道在芯片 上进行柱后标记可以减少柱前衍生的麻烦，l i u 等人1 97 j 用此方法对蛋白质进行快速 灵敏地测定。基于同样地原理，l u 等【98 j 对无机物铀进行检测。目前，一些新的激 光诱导荧光检测技术也已用于微全分析系统的检测中。h u a n g 等 9 9 1 利用声光式偏 转器使激光在芯片上多条平行的通道中移动，从而进行多通道荧光检测，这种技 术的最大优点是不需要高频扫描装置。c h a b i n y c 等t 1 0 0 j 报道了一种集成化微流控芯 片荧光检测系统，把一个微型雪崩式光二极管阵列检测器固化在l c m 厚的p d m s 片上，并在光二极管阵列检测器前放置一厚8 0 i _ t m 的滤光片来消除激发光的干扰。 b r u n s 等1 1 0 ”直接在单晶硅片上制作了用于芯片检测的光电二极管并镀上所需的滤 光膜，带有通道的芯片直接复合在该硅片上。由于光信号几乎没有损失，用强度 较弱的蓝色发光二极管代替了激光器作为激发光源，仍得到了满意的实验结果。 k a m e i i 旧2 】等人采用了一种s i h ( 氢化非晶硅) 制作的更高灵敏的光电二极管的检 测器。在检测器件方面，q i n 等 ”3 】采用一种可调波长的染料激光器用于激发荧光， 并且用增强型c c d 器件作为荧光接受器件。n a m a s i v a y a m 等1 1 0 4 制作了一种集成在 芯片上的检测结构，它采用了p i n n + 的光电二极管，对d n a 的检测限达到了 6 0 9 n g g l 。 l i f 检测器具有极高的灵敏度，易与芯片耦合，有良好的选择性和较宽的线性 范围，因而较为流行并商品化。然而，由于大多数的分析物荧光效率不高或是不 能发出荧光，同时也受到激发光源波长及荧光试剂的限制，l i f 检测器的通用性较 差。此外，通常的l i f 检测器体积较大，结构较复杂，难以适应系统微型化的要求， 成本也较高。 1 6 2 质谱法( m s ) 质谱法具有高的灵敏度，能够进行定性、定量分析和结构分析，已成为化学 和药物研究不可缺少的工具。质谱法应用于微流动注射检测器已有报道，实现两 者联用的关键是芯片与质谱仪的接口问题。在分析芯片反应通道的末端开口可以 把试样流直接引出与质谱检测器联结。由于一般使用电喷雾电离的方法，而微流 动注射分析芯片上液体流速太慢，难以满足电喷雾的需要。x u e 等u o s 用注射泵产 生辅助流，使试样在芯片出口处与辅助流汇合，与电喷雾质谱联用。r a m s e y 等【1 0 6 1 仅在反应通道上加一条壁修饰的侧通道，即可在反应通道的出口处产生电喷雾与 质谱联用。f i g e y s 等i l0 7 1 用毛细管把微流控芯片出口液引出，通过接口与离子阱质 谱联用。l e b r i l l a 等1 1 0 8 报道了把微系统与基质辅助激光解吸离子化质谱( m a l d ! ) 偶合装置。h e n i o n 等把微流控芯片与质谱联用测定了一些小分子【l 叫和人尿中的肉 碱吼f i g e y 等i 谰质谱在芯片上分析了牛血清蛋白、马肌红蛋白。x i a n g 等 1 1 2 1 分析了g m o l l 级的牛血清蛋白、细胞色素c 、辅q 等。g u s t a f s s o n 掣“3 j 研制了一种 集成了基体辅助激光解析离子化( m a l d i ) 的微流控圆盘。这种圆盘的特点就在于 可以平行地对9 6 个样品进行同时处理。 质谱法虽然可提供大量分析物信息，检出限可达到微摩尔的浓度，但它价格 昂贵，仪器尺寸大，很难符合微系统中器件结构应利于集成耦合的要求。 1 6 3 电化学检测法 电化学检测是一大类常用的分析测试方法。不论何种电化学检测法都采用电 极作为传感器，直接将溶液中待测组分的化学信号转变为电信号。这一传感方式 非常符合微流动注射系统微型化、集成化的要求。根据检测原理不同，可分为安 培法、电导法、电位法等。 安培检测器主要通过检测试剂在电极上反应所产生的氧化电流或还原电流来 对待测物进行检测。为了减少分离电压对检测器的干扰，一种可行的办法就是在 检测器前采用去耦器。r o s s i e r l l l 4 1 和c h e n l l l5 1 等运用该去耦方法研制了集成在电泳 分离微流控芯片上的安培检测器，并且用模型物质对其性能进行了检验。w u 等1 1 1 6 1 制作了一种基于p d m s 电泳分离芯片的集成三电极的安培检测器，并且采用导电 铂层作为去耦器，对于多巴胺碱的检测限达到了0 1 2 5 i _ t m o l 。l i u 等在研究中在 金电极上检测出了多巴胺和对苯二酚k l e t t 和n y h o l m 1 1 8 1 利用芯片毛细管电泳电场 中两个微电极问的激发电位差来进行安培检测，并且他们使用的检测装置中没有 采用去耦器和稳压器。l u n t e 等1 1 1 9 , 1 2 0 】报道了几种集成了安培检测电极的检测器件， 而且完成了对几种不同生物化学物质的相应检测。与上述采用的直接把检测电极 集成在芯片毛细管电泳分离通道中的方法不同，w a n g 等 1 2 l 】、h i l m i 和l u o n g ”2 ，n 3 】 采用了其他的方式，他们把分离通道延伸到分离器件的边缘，末端的检测池用合 适的角度与通道末端相连，采用这种检测器件，w a n g 等对一系列的物质进行了检 测，其中包括生化和环境检测相关物质，还有化学武器试剂和爆炸物。w a n g 等【l 驯 还在此基础上对该系统进行了改进，制作了一个同时集成了安培检测器电极和非 接触式的电导检测器电极的芯片。 电导检测器是一个通用型的检测器，对于其他方法难于检测的小离子，电导 法具有独特的优势。g r a s s 等i l ”j ”j 已经把电导法和等速电泳相结合用于微分析系 统。p r e s t 1 2 7 , 1 2 8 采用一种类似的方法，把电位梯度技术用在等速电泳检测上。然而， 等速电泳的用途不很广泛，可能因为它的检出限差。g u i j t 等 1 2 9 把电导检测用在常 规区带毛细管电泳芯片上，测定了i t m o l l 数量级的富马酸、柠檬酸和苹果酸。 以微型化的离子选择电极为基础的电位法也已被用在微分析系统上。m a n z 等 1 3 0 最早采用电位法在芯片上测定t b a 2 + 。s u z u k i 等1 3 1 1 把微型化的c l a r k 氧电极用 于测定血液的p 0 2 。c h e n 等 1 3 2 1 采用微流控多相层流技术，并将钾离子选择电极集 成到芯片上，实现了血样中k + 的分离和检测，由于多相层流具有分离功能，在分 析生物样品时，能为离子选择电极提供相对“干净”的试样，有效地降低电极表 面的污染。目前这种方法还没有广泛使用于微分析系统。然而，对于那些其他方 法难以检测电导率又低的离子来说，电位法无疑是最好的选择。如果在：艺= 片检测 池中同时插入多种超微离子选择性电极，则可以完成多种离子的同时检测。 电化学( e c ) 检测方法由于其高灵敏度、装置简易、价格低廉、易微型化等优 点，也受到人们广泛关注，但e c 检测器易受高分离电场的影响，较大的背景电流 和转换还原电势对它都有干扰。 1 6 4 化学发光法( c u 化学发光( c l ) 【”3 】检测系统不需要光源，避免了背景光及瑞利散射等杂散光的 干扰，具有仪器结构简单、操作方便、灵敏度高、线性范围宽、分析速度快等优 点，有利于微流动注射分析系统的集成化，能实现真正意义上的微型化，因而成 为微流动注射芯片最具吸引力的检测方法之一。从以下例子可以说明化学发光微 流动注射芯片分析系统的巨大生命力。 1 6 4 1 微流动注射芯片化学发光检测在i | 缶床分析中的应用 m a n g r u 等 1 3 4 】将取样、电泳分离、化学发光检测池及样品试剂废液等缓冲 液集成于两块封接好的平板玻璃芯片上，无需复杂的接口。为了增大光收集效率， 芯片检测区域的背面镀上铝膜反射镜。采用辣根过氧化氢酶( h r p ) 催化鲁米诺和 过氧化氢的化学发光反应，通过检测免疫反应产物中的h r p 标记羊抗一鼠免疫蛋白 g ( i g g ) 问接测定了鼠l g g 。反应试剂鲁米诺加在分离缓冲液中，过氧化氢在反应通 道上游y 形口处与分离通道的溶液汇流，化学发光由光电倍增管检测。 n a k a m u r a 等 1 3 5 在单晶硅片上刻蚀了反应室、混