（生物化学与分子生物学专业论文）resistin对炎症信号途径的调控研究.pdf

r 一 国家科技重大专项 国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 计划) 国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划) 国家自然科学基金 国家博士点基金项目 资助 1一 _ 王s3il 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：张庭帆少睥伊月8 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可p j , 用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数 据股份有1 2 - 司将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信 息服务( 包括但不限于汇编、复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在 其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密 的论文) 在解密后适用于本授权书 猢黼鲐张使锄鼢形勿丝 签名日期：劫p 年争月8 日签名日期拗年尸月日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 l 巨噬细胞中炎症信号途径的分子机制 目录 摘要1 a b s t r a c t 3 缩略语表5 第一章文献综述7 l 肥胖和炎症7 1 1 概述7 1 2 脂肪细胞与巨噬细胞7 1 3 炎症相关因子9 1 3 1 肿瘤坏死因子( t n f t x ) 和白介素6 ( i l 6 ) 9 1 4n f r , b 信号通路1 0 2r e s i s t i n 1 0 2 1r e s i s t i n 的结构与功能l o 2 1 1r e s i s t i n 的发现1 0 2 1 2r e s i s t i n 基因和蛋白的结构特点1 l 2 1 3r e s i s t i n 样家族分子13 2 1 4r e s i s t i n 的组织分布1 4 2 1 5r e s i s t i n 与肥胖相关的胰岛素抵抗15 2 1 6r e s i s t i n 在葡萄糖代谢中的作用1 7 2 1 7r e s i s t i n 与炎症18 3c o x 1 9 3 1 概述19 3 2 调节c o x 2 的细胞信号网络2 l 3 2 1 脂多糖信号途径2 1 3 2 2n o 信号途径2 l 3 2 3 细胞因子信号途径2 2 3 2 4 生长因子信号途径2 2 t 华中农业大学博士学位论文 4c h e m e r i n 和抗炎十五肽c h e m e r i n 15 2 3 4 1c h e m e r i n 的发现及其结构特点2 3 4 2c h e m e r i n 的免疫调节作用2 4 4 3c h e m r 2 3 、g p r l 、c c r l 2 的发现以及结构特征2 6 4 4c h e m e r i n 与抗炎作用2 7 4 4 1c h e m r 2 3 的脂质配体r e s o l v i ne 1 的抗炎活性作用。2 7 4 4 2c h e m r 2 3 的多肽配体c h e m e r i n 1 5 的抗炎活性作用2 8 第二章猪r e s i s t i n 基因多克隆抗体的制备2 9 1 前言2 9 2 实验材料与试剂2 9 2 1 实验材料2 9 2 1 1 实验动物2 9 2 1 2 质粒和菌株2 9 2 2 主要仪器、试剂及溶液配制2 9 2 2 1 主要仪器2 9 2 2 2 主要试剂3 0 2 2 3 主要溶液配制3 0 3 实验方法31 3 1 组织样品总r n a 提取31 3 2 总r n a 纯化3 2 3 3 总r n a 纯度鉴定3 3 3 4 目标片段的扩增与纯化3 3 3 4 1r e s i s t i n 扩增引物3 3 3 4 2c d n ao i 讧的扩增纯化和测序3 3 3 5p g e x k g r 载体的构建鉴定与诱导表达“3 4 3 6 包涵体的提取和目的蛋白纯化及浓度测定3 5 3 7 多克隆抗体制备3 5 3 8e l i s a 法测定效价3 5 3 9 抗体的保存3 6 u 巨噬细胞中炎症信号途径的分子机制 4 结果与分析3 6 4 1 猪r e s i s t i n 基因c d s 片段的克隆3 6 4 2p g e x - k g r 载体的构建与鉴定3 7 4 3g s t - r e s i s t i n 融合蛋白质的诱导表达与鉴定3 8 4 4g s t - r e s i s t i n 的纯化和定量。3 8 4 5 多克隆抗体的制备和效价检测3 8 第三章巨噬细胞中r e s i s t i n 对c o x 2 的调控4 0 l 前言4 0 2 实验材料与试剂4 0 2 1 实验细胞4 0 2 2 主要仪器、试剂及溶液配制4 1 2 2 1 主要仪器4 1 2 2 2 主要试剂4 l 2 2 3 溶液配制。4 1 3 实验方法4 2 ， 3 1 细胞培养4 2 3 2 转录因子真核表达载体的构建4 2 。一 3 3 质粒的大量提取4 2 3 4 质粒浓度和纯度检测4 3 3 5 细胞转染4 3 3 6 抗r e s i s t i n 抗血清的热灭活4 3 3 7 细胞r n a 提取和纯化4 4 3 8r e a l t i m ep c r 4 4 3 8 1 检测引物的设计4 4 3 8 2r e a l t i m ep c r 扩增条件4 4 。 3 9w e s t e r nb l o t t i n g 4 5 3 1o 数据统计分析4 5 4 结果与分析4 5 4 1r e s i s t i n 的表达情况的检测4 5 i i i 华中农业大学博士学位论文 4 2 超表达的r e s i s t i n 对c o x 2 表达的调控4 6 4 2 1 猪r e s i s t i n 对c o x 2 的m r n a 水平的调控4 6 4 2 2 巨噬细胞中小鼠r e s i s t i n 对c o x 2 的m r n a 水平的调控4 7 4 2 3r e s i s t i n 对c o x 2 蛋白质水平表达的调控4 8 4 3r e s i s t i n 的抗体对r e s i s t i n 的调控作用的影响4 9 5 讨论5 0 第四章r e s i s t i n 对炎症信号途径的调控作用5 2 1 前言5 2 2 实验材料与试剂5 2 2 1 实验细胞5 2 2 2 主要仪器、试剂及溶液配制5 2 3 实验方法5 3 3 1w e s t e r nb l o t t i n g 5 3 3 2 质粒的大量提取5 3 3 3 质粒浓度和纯度检测5 3 3 4 细胞培养5 3 3 5 细胞转染5 3 3 6 负显性i t , b e t 突变体载体的构建5 4 4 结果与分析5 4 4 1 超表达r e s i s t i n 对n f r , b 信号途径的影响5 4 4 1 1 超表达负显性1 1 ( ：b a 突变体对r e s i s t i n 调控作用的影响5 4 4 1 2 抑制剂p d t c 对r e s i s t i n 调控作用的影响5 5 4 1 3r e s i s t i n 刺激对n f r , b 转录表达的影响5 6 4 2r e s i s t i n 对激酶t a k l 表达及活性的影响5 7 4 2 1r e s i s t i n 对激酶t a k l 转录水平的情况5 7 4 2 2r e s i s t i n 对激酶t a k l 磷酸化水平的影响5 8 5 讨论5 9 第五章c h e m e r i n 15 对炎症反应的抑制作用及其机理6 2 l 前言6 2 i v 巨噬细胞中炎症信号途径的分子机制 2 实验材料与试剂6 3 2 1 实验细胞6 3 3 实验方法6 3 3 1r e a l t i m ep c r 6 3 3 2 细胞免疫荧光6 3 4 结果与分析6 4 4 1c h e m e r i n 15 的抗炎作用6 4 4 1 1c h e m e r i n 1 5 对l p s 所引起的炎症反应的抑制作用6 4 4 1 2c h e m e r i n 一1 5 对p a 引起的炎症反应的抑制作用6 5 4 1 3c h e m e r i n 1 5 对r e s i s t i n 所引起的炎症反应的抑制作用6 5 4 2 c h e m e r i n - 1 5 对p 6 5 基因表达以及入核的影响6 6 4 2 1 c h e m e r i n 1 5 对p 6 5 基因表达的影响6 6 4 2 2 c h e m e r i n 15 对p 6 5 的入核的影响6 7 5 讨论6 9 结论与创新点7 0 参考文献7 1 研究生期间论文发表情况8 4 致谢8 5 v 巨噬细胞中炎症信号途径的分子机制 摘要 r e s i s t i n 称抗素( 也称f i z z 3 ) ，是一种含有1 1 4 个氨基酸的细胞因子。近来发现 r e s i s t i n 具有一系列前炎症因子的特征，在炎症中能够诱导血管内皮细胞粘附分子的 表达，从而导致白细胞向各个炎症组织中的浸润。尽管r e s i s t i n 在炎症发生中已有不 少报道，但其与经典炎症信号途径的关系，在炎症中的作用及其调控机制尚未阐明。 环氧合酶2 ( c o x 2 ) 是前列腺素合成中的一个限速酶。在人体中存在两种不同的 c o x 异构体，分别称为c o x 1 和c o x 2 。其中c o x 一2 是一种经过诱导而产生的酶， 在正常生理条件下维持较低的表达水平，但在炎症部位表达上调，催化炎性p g s 的 合成并诱发炎症反应。此外，c o x - 2 的启动子上存在n f r d 3 的结合元件，可受转录 因子n f r d 3 调控。一些重要的炎症因子例如t n f c t 和i l 1 可通过激活n f r b 而上调 c o x 2 的表达。 本研究以r e s i s t i n 为研究对象，采用r e a l t i m ep c r 、w e s t e r nb l o t t i n g 和细胞转染 等技术，系统研究了r e s i s t i n 通过经典的炎症信号途径上调c o x 2 的基因表达及抗 炎肽c 1 5 对r e s i s t i n 等引起的炎症反应的抑制作用分子机制，结果如下： 1 在巨噬细胞内分别转染猪和小鼠r e s i s t i n 的超表达载体，采用r e a l t i m e p c r 和w e s t e r nb l o t t i n g 方法检测细胞内源的c o x 2 的m r n a 和蛋白质 水平的表达变化。结果表明，r e s i s t i n 在r a w 2 6 4 7 巨噬细胞系中可以显 著地上调c o x 2 的m r n a 和蛋白质的表达。更重要的是，通过原核表达 制备了抗r e s i s t i n 的抗体，用抗体处理可以抵消r e s i s t i n 的这种作用。 2 以巨噬细胞为模型，通过负显性i r , b a 突变体和p d t c 这两种抑制物质研 究了r e s i s t i n 对c o x 2 的信号转导途径的调控。结果表明，无论是超表达 负显性i r b c t 突变体载体，还是用抑制剂p d t c 刺激，都可以抑制r e s i s t i n 对c o x 2 的诱导作用。进一步的研究证实，r e s i s t i n 的超表达可以上调 n f r b 分子中的p 6 5 亚基的表达，进而诱导c o x 2 的表达水平的上升。 3 以r e s i s t i n 对小鼠巨噬细胞作不同时间梯度的处理，用w e s t e r n b l o t t i n g 方 法分析r e s i s t i n 对一种m a p k k k 激酶t a k l ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rp a c t i v a t e d k i n a s e1 ) 的磷酸化程度的影响。结果表明，r e s i s t i n 可以显著上调 t a k l 的磷酸化水平。 4 以促炎物质r e s i s t i n ，l p s ，p a 分别和c 1 5 共同处理小鼠巨噬细胞，检测 华中农业大学博十学位论文 炎症基因c o x 2 和i n o s ( i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e ) 的表达变化。结 果表明，炎症基因c o x 2 和i n o s 可以被三种促炎物质诱导表达，并且 这种诱导的情况可以显著被c 1 5 所抑制住。 5 在巨噬细胞中，以l p s 在不同时间梯度刺激细胞，用细胞免疫荧光的方 法检测n f k b 的p 6 5 亚基的入核情况。结果证实，c 1 5 可以明显抑制l p s 所导致的p 6 5 的入核情况，表明c 1 5 是通过阻止n f k b 的p 6 5 亚基入核， 从而抑制相关炎症因子的表达，进而表现出一定的抗炎活性。 关键词：抗素，环氧合酶2 ，核因子kb ，炎症信号途径，c 1 5 肽 2 巨噬细胞中炎症信号途径的分子机制 a b s t r a c t r e s i s t i ni sa114 - a m i n o - - a c i dp o l y p e p t i d ew h i c hb e l o n g st or e s i s t i n - l i k em o l e c u l e ( r e l m ) f a m i l yc h a r a c t e r i z e db yah i g h l yc o n s e r v e dc y s t e i n e r i c hct e r m i n u s r e c e n t l y ， r e s i s t i nh a se m e r g e da san o v e lp r o - i n f l a m m a t o r yf a c t o r t h ea s s o c i a t i o nb e t w e e nr e s i s t i n a n di n f l a m m a t i o nh a sa l s ob e e nd e m o n s t r a t e di nr h e u m a t o i da r t h r i t i sa n do t h e rd i s e a s e s ， w h e r er e s i s t i ni sc a p a b l eo fi n d u c i n gv a s c u l a ra d h e s i o nm o l e c u l ee x p r e s s i o na n dp r o m o t i n g l e u k o c y t ei n f i l t r a t i o ni n t ot i s s u e s ， t w oc y c l o o x y g e n e a s e ，c o x - 1a n dc o x 一2 ，h a v eb e e ni d e n t i f i e da st h ek e ye n z y m e s r e g u l a t i n gt h ep r o d u c t i o no fp r o s t a g l a n d i n s c o x 一2i sa ni n f l a m m a t i o n - i n d u c e de n z y m e t h a tr e m a i n su n d e t e c t a b l ei nm o s tm a m m a l i a nt i s s u e su n d e rb a s a lc o n d i t i o n sa n di sh i g h l y a c t i v a t e da tt h es i t e so fi n f l a m m a t i o n s o m ei m p o r t a n tp r o - i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e s ，s u c ha s t n f - a l p h a ，c a na l s ou p r e g u l a t ec o x 一2e x p r e s s i o nv i an f k a p p abp a t h w a y i nt h i ss t u d y , b yc h o o s i n gt h ei m p o r t a n tc y t o k i n er e s i s t i na n du s i n gr e a l - t i m ep c r , t r a n s f e c t i o na n dw e s t e r nb l o t t i n g ，w es t u d i e dt h er e g u l a t i o ne f f e c to fc o x - 2b yr e s i s t i n ， a n da l s or e s e a r c h e dt h ea n t i - i n f l a m m a t o r ye f f e c to fc h e m e r i n 一15a n dg o tt h ef o l l o w i n g r e s u l t s ： 1 c o m p a r e dw i t hc o n t r o l s ，r e s i s t i nr e m a r k a b l yu p r e g u l a t e dc o x - 2e x p r e s s i o n i n r a w 2 6 4 7m a c r o p h a g ec e l l s a d m i n i s t r a t i o no fa n t i r e s i s t i na n t i b o d yc o u l dr e v e r s e t h i se f f e c t 2 i n d u c t i o no fc o x - 2b yr e s i s t i nw a sm a r k e d l yr e d u c e di nt h ep r e s e n c eo fe i t h e rd o m i n a n t n e g a t i v e m u t a n ti r b ao rp d t c ，ap h a r m a c o l o g i c a li n h i b i t o ro fn f - r d 3 n f r d 3 s u b u n i tp 6 5w a sa l s ou p r e g u l a t e db yr e s i s t i n 3 m o r e o v e r ，w ef o u n dt h a tt r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r p - a c t i v a t e dk i n a s e1 ( t a k1 ) ，a m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s ek i n a s e ( m a p k k k ) ，c o u l db ea c t i v a t e di n r e s p o n s et or e s i s t i n 3 华中农业大学博士学位论文 4 s t i m u l a t e dr a wc e l l s 、v i t hl p s ，r e s i s t i na n dc 15 ，m e a s u r e dt h ee x p r e s s i o no fc o x - 2 a n di n o s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ei n d u c i n go f c o x - 2a n di n o sc o u l dm a r k e d l y r e d u c e db yc 1 5 5 w eu s e dm a c r o p h a g e sa sam o d e l ，u s i n gl p sa sap r o i n f l a m m a t o r y s u b s t a n c e r e p r e s e n t a t i o nm e a s u r e dt h et r a n s l o c a t i o no f n f r , bs u b u n i tp 6 5 t h e r e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h er a n s l o c a t i o no fp 6 5i n d u c e db yl p sc o u l db eo b v i o u s l yi n h i b i t e db yc 15 t h i s r e s u l ta l s op r o v e dt h ep e c i f i cm e c h a n i s mo fc 15g e n e r a t i n ga n t i i n f l a m m a t i o n k e y w o r d s ：r e s i s t i n ，c o x 一2 ，n f k b ，i n f l a m m a t o r ys i g n a lp a t h w a y , c 1 5 巨噬细胞中炎症信号途径的分子机制 缩略语表 5 华中农业大学博上学位论文 6 巨噬细胞中炎症信号途径的分予机制 第一章文献综述 1 肥胖和炎症 1 1 概述 肥胖是近年来新出现的健康危害，它导致的发病率和死亡率都逐年上升，尤其 是在西方国家。肥胖经常地与代谢综合症紧密联系地在一起，后者包括高血糖，胰 岛素抵抗，高血压，高血脂，高密度脂蛋白的胆固醇低和2 型糖尿病等等。多项研究 表明脂肪组织分泌的脂肪因子在这些疾病的发生中起着关键的作用，而且不仅是脂 肪因子，脂肪细胞同时也能分泌炎症细胞因子，而其典型来源就是巨噬细胞，这些 炎症因子包括t n f 0 【，白介素和趋化因子家族成员m c p 1 ( m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n 1 ) ，它们都与许多代谢疾病相关( g u z i ke ta 1 ，2 0 0 6 ) 。最近发现，一些抗炎的 药物同样具有治疗2 型糖尿病的作用( e g ：p p a r y 的激动齐u t z d ，水杨酸衍生物) ，为人 们开发一些治疗由肥胖引起的疾病的策略提供了诱人的前景( t a k a h a s h ie ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 现在研究者们普遍认为白色脂肪组织( w a t ) 不仅仅是一种能量储存的场所，而 把它当做一种更重要的内分泌器官，它能分泌大量的脂肪细胞因子( a d i p o k i n e s ) 。这 其中有许多脂肪细胞因子的功能都能与炎症以及炎症反应联系在一起，例如r e s i s t i n ， a d i p o n e c t i n ，t n f 0 【，l e p t i n ，i l 6 ，i l 8 等。而近来的研究发现了这样的一个事实，即 肥胖本身就是一种慢性低水平的炎症( f e s t a e t a l ，2 0 0 1 ；y u d k i n e t a l ，1 9 9 9 ) ，现在这个 概念已经逐渐被人们所接受。证明这个概念现在至少有了两个方面的科学证据：一 是在肥胖症患者体内的炎症因子的循环水平有所增加。白色脂肪组织是产生炎症相 关蛋白的重要器官，而在肥胖的人群中这类脂肪组织的数量通常升高t ( r a j a l aa n d s c h e r e r , 2 0 0 3 ；t r a y h u ma n dw o o d ，2 0 0 4 ) 。另一个就是巨噬细胞向脂肪组织的浸润。 w e i s b e r g 等人以及x uh 等人的研究证实了肥胖患者体内巨噬细胞能够渗入到脂肪 组织中( s o u k a se ta 1 ，2 0 0 0 ；w e i s b e r ge ta 1 ，2 0 0 3 ；x ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这些研究结果共同说 明了脂肪沉积、脂肪的过度沉积和脂肪的异位沉积及其调控的分子机理是与炎症以 及炎症反应紧密联系在一起的。 1 2 脂肪细胞与巨噬细胞 脂肪组织已经被定义为一个重要的内分泌器官，它不仅仅只储存能量而且调节 能量平衡和代谢。通过分泌的脂肪因子，与肝脏，骨骼肌和脑进行交流( 图1 ) 。最近 发现肥胖的发生与肥胖诱导的脂肪组织的炎症相关联。这个过程以脂肪组织的促炎 华中农业大学博上学位论文 症细胞因子的表达升高为特征，随后激活的巨噬细胞募集。这些巨噬细胞分泌其他 促炎症细胞因子例如t n f a ，i l 6 ，它们影响脂肪细胞和远侧组织的胰岛素敏感性。 在生物学功能上巨噬细胞和脂肪细胞存在着很大一部分的重合，因此表现出代 谢调控和免疫调控的高度相关性。在基因表达上，巨噬细胞和脂肪细胞具有极高的 相似性：例如某些时期脂肪细胞可以表达巨噬细胞里的部分重要基因i l 6 与 t n f 仪；而巨噬细胞也能表达许多脂肪细胞的基因p p a r y 与a p 2 ( h o t a m i s l i g i le t a 1 1 9 9 3 ；t o n t o n o ze ta 1 1 9 9 8 ；b o u l o u m i ee ta 1 2 0 0 1 ：m a k o w s k ie ta 1 2 0 0 1 ) 。从细胞 功能上来说，巨噬细胞和脂肪细胞也有很多相似之处。在一定程度上巨噬细胞也可 以吸收并存储部分脂肪，然后转化成泡沫细胞。这点与脂肪细胞是相同的。同时， 前脂肪细胞不仅能分化成脂肪细胞，在某些特殊的情况下，它也可以表现出类似于 巨噬细胞的抗菌吞噬功能。如果环境适合，它还能继续分化，最终成为巨噬细胞。 这也就从另一个角度说明前脂肪细胞是一种有着潜在性的免疫功能的细胞( c o u s i n e t a 1 1 9 9 9 ；c h a r r i e r ee ta 1 2 0 0 3 ) 。研究表明在肥胖个体的脂肪组织里大量的巨噬细胞往 往和脂肪细胞同时存在。因此，肥胖的重要原因之一也许就是在脂肪组织中大量积 累的巨噬细胞( w e i s b e r ge ta 1 2 0 0 3 ；x ue ta 1 2 0 0 3 ) 。同时巨噬细胞具有启动胰岛素抗 性的功能，因为它能在某些脂肪组织中单独或者与脂肪细胞共同分泌大量炎症因子。 这无疑是给我们提供了一个新的方向去更准确地对肥胖个体进行脂肪组织炎症反应 的研究。 s k e l e t a im u s c l e g l u c o s eu n t i 髓u e l i p d s ( f f a ，) 9 i u 当强d i 拍+ ( g l u c o n e o g e n e s l s j i c a r 嘻i o 懈c u l a fd i = , e a j 噼， 图1 脂肪组织与代谢紊乱相关( m o r r i s o na n df a r m e r2 0 0 0 ) f i g 1a d i p o s et i s s u e i sr e l a t i v ew i t hm e t a b o l i cd y s f u n c t i o n ( m o r r i s o na n df a r m e r 2 0 0 0 ) flliiillli g 憎铒龇| 皇r t 巨噬细胞中炎症信号途径的分子机制 尽管脂肪细胞和巨噬细胞在起源和功能存在和明显的差别，但研究发现在某些 肥胖个体的脂肪组织中出现了巨噬细胞的浸润( n e d ar a s o u l ia n dp h i l i pa k e r n 2 0 0 8 ) 。但是，目前引发肥胖症的白色脂肪组织中导致巨噬细胞募集的分子机理还不 清楚。目前研究认为一些脂肪组织巨噬细胞( a d i p o s et i s s u em a c r o p h a g e s ，a t m s ) 是导 致肥胖相关的慢性低水平炎症的关键的因素( w e l l e na n dh o t a m i s l i g i l ，2 0 0 3 ，2 0 0 5 ) ，而 s u g a n a m i 在体外共培养已经分化了的3 t 3 l 1 前脂肪细胞和r a w 2 6 4 7 巨噬细胞系时， 可以导致明显促炎症细胞因子的上调和抗炎症因子的下调( s u g a n a m ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。脂 肪内的巨噬细胞通过分泌多种炎症细胞分子从而引起脂肪组织发生炎症( k e r s h a w a n df l i e r , 2 0 0 4 ) ，这些炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子0 【( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a ， t n f - 0 【) ( h o t a m i s l i g i le ta 1 ，19 9 3 ) ，白介素6 ( i n t e r l e u k i n 一6i l 一6 ) ( f e m a n d e z r e a la n d r i c a r t ，2 0 0 3 ) ，单核细胞趋化蛋白m c p 1 ( c h r i a i a n s e ne ta 1 ，2 0 0 5 ；t a k a h a s h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 和血纤维蛋白溶酶原激活抑制剂- 1 ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r - 1 ) ( s h i m o m u r a e ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。 | ； * 。 1 3 炎症相关因子 1 3 1 肿瘤坏死因子( r n - f a ) 禾o 白介素6 ( i l 6 ) 肿瘤坏死因子( t n f a ) 年f i 白介素6 ( i l 6 ) 是被研究的最多的两种可以调节胰岛素 抗性的脂肪细胞因子。一些研究结果证实t n f a 在肥胖相关的胰岛素抵抗中发挥着重 要作用，在饮食诱导的肥胖小鼠和瘦素缺失的肥胖小鼠模型中缺失t n f a 或者缺失 t n f 仅受体都可以明显改善胰岛素的敏感l 生( m o l l e r 2 0 0 0 ) 。对人的研究发现，脂肪组 织的t n f 仪的表达量与体重指数，身体肥胖率，高胰岛素血症都显著相关，而当体重 减轻后t n f 0 c 的表达量随之下降( s t e p h e n se ta 1 1 9 9 7 ) 。禁食后的t n f 血浆水平与胰 岛素抵抗显著相关( l a n ge ta 1 1 9 9 2 ) 。在肥胖的大鼠模型中中和t n f 0 c 可以显著改善 胰岛素抵抗的状态( u y s a le ta 1 1 9 9 7 ) 。但是用抗t n f a 的抗体注射到肥胖，胰岛素抵 抗或者二型糖尿病个体的体内却不能改善胰岛素的敏感。l 生( s c h r e y e re ta 1 1 9 9 8 ) 。 白介素6 在胰岛素抵抗中所起的作用依然存在着很多的争论。白介素6 被报道在 脂肪细胞中可以降低胰岛素依赖的肝脏糖原合成和葡萄糖的吸收，然而在肌细胞中 却可以增强胰岛素依赖的肝脏糖原合成和葡萄糖的吸收( m o h a m e d a l ie ta 1 1 9 9 9 ) 。 将白介素注射到小鼠体内可以钝化胰岛素的活性，抑制肝脏葡萄糖的产物。相反， 也有报道认为在心室内注射胰岛素可以导致白介素6 介导的肝脏糖异生的抑制。 9 华中农业大学博上学位论文 肿瘤坏死因子( t n f 0 0 和白介素6 ( i l 6 ) 可能通过一系列直接机制调节胰岛素抵 抗。这包括c - j u r an 末端激酶1 调节的i r s 1 ( i n s u l i nr e c e p t o rs u b s t e a t e ) 丝氨酸磷酸化， i k k 调节的n f - 1 ( b 的激活，和诱导s o c s 3 ( s u p p r e s s o ro f c y t o k i n es i g n a l i n g3 ) 的表达。 总之，血液循环中的白介素6 的水平在肥胖和胰岛素抵抗个体中上升。白介素6 在慢性炎症者例如肥胖症和二型糖尿病个体中的上升可以引发胰岛素抵抗，然而瞬 时地提高白介素的水平可能可以导致正常的葡萄糖代谢平衡( b a s t a r de ta 1 2 0 0 0 ) 。 1 4n f v , j 3 信号通路 核转录因子n f 1 c b ( n u c l e a r f a c t o r k b ) 是1 9 8 6 年由s e n 和b a l t i m o r e 共同在淋巴 细胞中发现的一种能够和免疫球蛋白1 ( 链的轻链基因的增强子序列特异性结合的转 录因子( s e n e t a l 1 9 8 6 ) 。n f k b 广泛存在于真核细胞中，是一个由复杂的多肽亚单位 组成的异源二聚体的关键转录因子，它作为炎症信号转导途径中的枢纽，与炎症、 肿瘤的发生与发展、细胞凋亡的调控以及胚胎的发育等有密切关系。 n f r d 3 因子同时也是r e l 家族的蛋白质，分别称为r e la ( 也称p 6 5 ) 、r e l b 、r e l c 、 p s 0 ( 也称n f - r b 1 ) 和p 5 2 ( 也叫n f - k b 2 ) 。最常见的也是最重要的n f - r d 3 复合体是由 两个亚基