（林木遗传育种专业论文）薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究.pdf

摘要 通过r t - p c r 方法用兼并引物从薰衣草中克隆了一个6 0 0 b p 的序列在 g e n e b a n k 里进行序列比对后与芳樟醇合成酶具有最大的相似性，为7 6 。通过3 r a c e 和5 r a c e 技术克隆到了基因的全长e d n a 序列，为1 8 0 9 b p ，其蛋白序列 为6 0 3 个氨基酸。蛋白序列与单萜类合酶基因的蛋白序列进行比对，此序列具有单 萜类合酶的所有保守氨基酸功能序列d d x x d 以及5 端的r r 功能基团。核酸及蛋 白序列功能分析表明所克隆的基因属于芳樟醇合酶基因家族，命名为l l i s 。设计全 长引物，得到了l l i s 的全长e d n a 。用全长引物从薰衣草中克隆到了基因组全长序 列，为2 3 2 0 b p 。对其进行分析表明，基因组序列含有6 个内含子，7 个外显子。s o u t h e r n b l o t t i n g 结果表明在薰衣草中l l i s 可能存在2 个拷贝数。构建了l l i s 的原核表达载 体、植物转基因表达正义及反义载体。原核表达结果表明表达出来的蛋白与所预期 的蛋白大小是一致的，约为6 0 k d 。用植物表达载体经烟草叶盘转化法侵染了野生型 烟草。通过p p t 的筛选以及提取烟草基因组，用p c r 的方法得到了转基因烟草的阳 性植株。n o r t h e r nb l o t t i n g 结果分析表明转基因烟草的正义和反义植株都有了表达， 有些没有表达可能是发生了基因沉默。 以百合为材料，摸索了百合的生长愈伤以及分化的条件，为下一步的百合转基 因做好了基础。 关键词：薰衣草：单萜；芳樟醇合成酶；s o u t h e r nb l o t t i n g ；n o r t h e r nb l o t t i n g s t u d i e so ng e n ec l o n ea n df u n c t i o n a li d e n t i f ya sw e l la s g e n e t r a n s f e ro fl i n a l o o ls y n t h a s eo fl a v a n d u l ao f f i c i n a l i s b s t r a c t a 6 0 0 b ps e q u e n c ew a sc l o n e df r o ml a v a n d u l ao f f i c i n a l i st h r o u g hr t - p c rb yu s i n g d e g e n e r a t ep r i m e r s a f t e rc o m p a r i n gw i t ht h es e q u e n c e si ng e n e b a n k ，t h es e q u e n c ew a s f o u n dt os h a r et h eh i 【g h e s ts i m i l a r i t y ( 7 6 ) w i t ht h es e q u e n c eo fl i n a l o o ls y n t h a s e t h e w h o l ee d n as e q u e n c ew a sc l o n e dt h r o u g h3 r a c ea n d5 r a c e a n dt h es i z ei s 1 8 0 9 b p t h ep r o t e i ns e q u e n c ec o n t a i n s6 0 3r e s i d u e s c o m p a r i n gt h ep r o t e i ns e q u e n c e w i t ht h em e m b e r so fm o n o t e r p e n es y n t h a s ef a m i l y , a n dt h er e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h e s e q u e n c ec o n t a i n sa l lo ft h ec o n s e r v e df u n c t i o n a la m i n oa c i ds e q u e n c e s ( d d x x d ) w h i c ha r es h a r e db ym o n o t e r p e n es y n t h a s e sa n d5 r rf u n c t i o n a lg r o u p s t h ea n a l y s i s r e s u l t so fn u c l e i ca c i da n dp r o t e i ns e q u e n c e ss u g g e s t e dt h a tt h eg e n ec l o n e di so n e m e m b e ro fl i n a l o o ls y n t h a s ef a m i l y , a n dw en a m ei tl l i s g e t t i n gt h ef u l l - l e n g t he d n ao f l l i sb yu s i n gf u l l - l e n g t hp r i m e r s t h eg e n o m es e q u e n c eo fl a v a n d u l ao f f i c i n a l i sw a s c l o n e db yu s i n gf u l l - l e n g t hp r i m e r s a n dt h es i z eo ft h es e q u e n c ej s2 3 2 0 b p t h e s e q u e n c ew a sf o u n dt oc o n t a i n6e x o n sa n d7i n t r o n s 1 1 1 er e s u l to fs o u t h e r nb l o t t i n g s u g g e s t e dt h a t i nl a v a n d u l ao f f i c i n a l i st h e r em a yb et w oc o p i e so fl l i s i tw a s c o n s t r u c t e dt h a tt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r , s e n s ea n da n t i s e n s ee x p r e s s i o n v e c t o r sf o rl l i s t h es i z eo ft h ep r o t e i np r o d u c e dt h r o u 9 1 lp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ni sn e a r y 6 0 k d ，w h i c hi se q u a lt ot h ee x p e r i m e n th a v ee x p e c t e d t h ee x p r e s s i o nv e c t o r sw e r e t r a n s f e r r e di n t ot h ew 3 8t o b a c c o ，a n dt h r o u g hp p ts e l e c t i o n ，e x t r a c t e dg e n o m ed n a a l s o p e ra m p l i f i e d f i n a l l y , t h ep o s i t i v et r a n s g e n i ct o b a c c o sw e r eg o t t h er e s u l to f n o r t h e r nb l o t t i n gs u g g e s t e dt h a tb o t hs e n s ea n da n t i s e n s et r a n s g e n i ct o b a c c o sc a n e x p r e s st h er e l e v a n tp r o t e i n s ，a n ds o m ef a i l e dm i g h tb e c a u s eo f t h eg e n es i l e n c e i no r d e rt o r e s e a r c h i n go nu a n s g e n i cli l i u ms p p ，i tw a sa l s ou s e dt h a tl i l i u m s p p a sm a t e r i a l st of i n do u tt h ep r o p e rc o n d i t i o n sf o rc a l l u si n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n o f li l i u ms p p k e yw o r d s ：l a v a n d u l ao f f l c i n a l i s ；m o n o t e r p e n e ；l i n a l o o ls y n t h a s e ；s o u t h e r nb l o t t i n g ； n o r t h e r nb l o t t i n g d ir e c t e db y ：p r o f c iz h o n gl i n g a p p li c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：z h a n gx u er o n g ( t r e e o g e n e t i c sa n db r e e d i n g ) ( f o r e s t r yc o l l e g e - i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： i 医翌霉- 4 尹日期：与l ： g 一、- 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名：墨叁重盛， 指导教师签名：乏隧 日期：兰泄 内蒙古农业大学硕士学位论文 l 1 引言 随着生物技术的发展，越来越多的技术与生产实践相结合，为人们的生产、生 活提供了便利条件。生物技术与农业结合可在较短的时间内获得理想的农作物。作 为观赏植物而不是食物，不存在转基因食品的安全性问题，将生物技术与传统的植 物育种手段相结合，能在较短时问内繁育出具有较强观赏性及特殊环境要求的观赏 植物，为增加园林植物品种，扩大某些观赏植物的栽培范围具有重要的应用意义。 薰衣草( a v a n d u l ao f f i c i n a l i s ) ，唇形科，多年生草本，茎四棱、叶对生、 唇形花冠，果实为四个小坚果。属天然香料植物，原产地中海一带，因其拥有浓烈 的香气，纵使没有开花，其枝叶所含的香油亦会徐徐散发，当植株受到碰触或摩擦 时，香味愈加浓烈，枯而犹存，故有“芳香之王”的美誉。薰衣草的叶可以泡茶、 熏衣、做香枕等，有提神、健脑、助眠、防蛀、熏香等功能。它还有灭菌、净化空 气、绿化、香化环境、驱蚊蝇、提取香精油的功能，广泛用于食品、化工、化妆品 等行业。 1 1 研究的目的和意义 随着人们生活水平的提高和对环境质量的重视，人作为生产者对居住环境的要 求越来越高。园林植物作为人居环境不可缺少的成分越来越受到人们的重视。香味 植物美化环境、香化居室、净化空气，从而提高人们生活质量的功能必会逐渐被认 知，香味产品的生产和开发将日益显示出诱人的市场前景。 植物精油对植物自身有保护作用，在人类生活中有消毒、杀菌、防腐和防虫的 功效，对人体具有提神、醒脑、通经活络、抗皱、护肤之功效“”，因此，植物精油 自古以来便在中医上得到应用。最近的研究表明，植物精油还是一种很好的除草剂、 杀虫剂、抗菌剂和可食用的抗癌物质植物，精油对动物的相对毒性较小，而且在环 境中极易被微生物催化分解而在环境中残留很小，在害虫防治方面有广阔的应用前 景”。 芳樟醇作为种重要的抗癌药物，在医药上也有重要的价值“”。它作为精油 的主要成分之一，可以改善精油的质量，具有重要的经济价值。 希望能够从香味植物里克隆出关键酶基因，再转入其他不能散发香味或香味较 淡的植物里，从而能够使目的植物产生香味。 1 2 植物香昧基因工程的研究进展 由于控制花卉香味的代谢物很多，对这一性状的研究较为缓慢。长期以来人们 把研究重点放在改良花色、花形及抗性等方面，花香作为花卉的一个重要品质，一 直被忽视。现在对花香的遗传改良开始受到重视，但还处于起步阶段，成果较少。 对于芳香物质的生物合成途径、生理代谢途径及遗传背景还不清楚，因而进行这方 2 薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究 面的深入研究，克隆相关基因，应是当前的工作重点。近期人们正在合成单萜，它 是一类重要的花香物质，已克隆出来的l i s 基因可编码s - l i n a l o o l 合成酶，这种 酶可将栊牛儿焦磷酸( g p p ) 一步转化成s 一萜烯醇。这一成果有望实现花香的改良。 有人利用野生型发根农杆菌转化柠檬天竺葵，使其芳香物质大大增加”1 。 i 2 1 香味植物 香味植物大都属于唇形科( l a b i a t a e ) ，草本或灌木，稀为乔木和藤本，茎四 棱、叶对生、唇形花冠，果实为四个小坚果常含芳香油。约2 2 0 属，3 5 0 0 种，分 布热带及温带；我国约9 8 属，8 0 0 种。著名的唇形科香料植物有薰衣草、天竺葵、 迷迭香、留兰香、百里香、七里香、丁香罗勒、香紫苏、广藿香、薄荷等。香味 植物有广泛的应用价值，其中对人体有保健作用，如调节人的神经系统，促进人体 血液循环，使人产生旺盛的精力。 1 2 ，2 植物香味物质的表达部位 植物的表面结构是植物与环境相关关系中最直接和最重要的结构。植物演化过 程中在根、茎、叶、花、果、籽的表面形成了具多样性特征的结构。其中毛状体 ( t r i c h o m e ) 由表皮细胞特化形成的毛状结构最具普遍特征。它扩大了植物与外界 的交流，包括营养的吸收和向环境释放特殊的成分。它们在植物发育的不同阶段起 着不同的作用。t r i c h o m e 的毛状结构包含一个或多个腺体细胞，这些细胞是具有不 同的形状和功能。包括腺体分泌组织和储藏组织，它们是非常活跃的化学制造场所 “”。它们在常温常压下生产出对植物有益的化学成分( 强化植物的防御系统，有 助于构成特定的植物群落，乃至招引昆虫传粉等) ，也由此制造了多种多样人类需 要的药物和香料，包括天然精油( e s s e n t i a lo i l ) 。 毛状体( t r i c h o m e ) 是叶的表皮细胞的外层衍生物。在叶原基生长阶段，表皮 细胞为单一的一层细胞，再分化成各种形状的细胞类型，包括扁平细胞，气孔和毛 状体。最早发现毛状体前体细胞的发育过程是细胞分化的终止同时侧面延伸，在细 胞核内可见基因组d n a 经过三轮的复制，然后在叶的表面垂直生长，在分枝形成的 时候细胞核内再次复制。成熟的毛状体在3 0 0 - 5 0 0 u m 之间。 1 2 3 植物毛状体基因调控 在拟南芥毛状体缺失突变体中，能形成正常的根毛，说明毛状体与根毛是由不 同的基因控制的“”。调控毛状体起始和发育的基因有g l a b r a l ( g l i ) ，t r a n s p a r e n t t e s t a g l a b r a l ( t t g i ) ，g l a b r a 3 ( g l 3 ) 以及t r i p p t y c h o n ( t r y ) 。a t m y b 2 3 啪“刊。 g l i 和t t g l 的缺失导致毛状体的丢失，说明他们是毛状体起始形成的正调控因子。 t t g i 同时抑制侧生，t t g 等位基因产生毛状体簇团，g l i 的突变导致毛状体的消失 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 w 。g l i 基因在有叶的叶原基的表皮层表达，转录产物在正在发育过程中的毛状体 中积累。在3 5 s 启动子的驱动下，g l i 基因可以导致在子叶中异常毛状体的形成 汹m 。g l 2 编码一个同源盒的转录因子来调控毛状体的分化与发育”，g l 3 作为正 调控因子同时调控毛状体的起始和生长。在g l 3 突变体中毛状体起始频率减少同时 d n a 复制水平降低，g l l 、g l 3 和t t g i 编码的都是缺乏转录激活域的蛋白。”，这 三个蛋白形成一个复合物。共同调节于g l 2 作为毛状体下游的调控基因的特异表达 汹一。棉纤维脂转移蛋白l p 6 以及l p 3 的上游调控区在烟草中表达都表示了在毛状 体中特异表达的性质“”。棉花中r d 2 2 一l i k e l ( r o l l ) 的上游启动子在拟南芥中显示出 了毛状体中特别表达的特性，激活此启动子的转录因子c a m y b 2 作为棉纤维发育的 关键的调控因子。6 l i 和c a m y b 2 的第一个内含子在毛状体发育过程中作为一个增 强子，而在非毛状体细胞中作为一个抑制子”。 1 2 4 植物香味物质的组成成分 许多植物都挥发出香的气味。如许多植物的花就能挥发出特定的香味，以吸引 昆虫授粉。还有很多芳香植物其时和花都能挥发出香味。这些挥发性的物质就是糟 油中的主要组分。植物精油是植物体内一大类次生代谢产物的总称，由分子量相对 较小的挥发性的萜类化合物组成，具有一定的气味。 香精油的主要成分都是一些次生代谢产物一萜类包括单萜、倍半萜、二萜、三 萜、四萜等，不同香味植物产生的香精油每种成分的含量不一样。 1 2 4 1 影响植物香昧物质的因子 光并不能直接影响到单萜的挥发速率，在光照或黑暗条件下其挥发率是一样 的，与光的强度也没有关系。而温度则是影响单萜挥发的重要因素。单萜挥发速度 的增加与温度成指数关系。 1 2 5 植物香昧物质的合成途径 所有单萜前体物质都是牦牛儿基二磷酸( g p p ) ，丽g p p 生物合成的前体物质是 异戊二烯二磷酸( i p p ) 或二甲基烯丙基二磷酸( d m a p p ) 。d m a p p 是i p p 的异构体。 目前的研究表明，g p p 在植物体内的合成有两条途径，一条是在细胞质内，通 过乙酸甲羟戊酸途径合成另一条途径通过甘油醛磷酸丙酮酸在质体内合成。 i p p 在异戊烯转移酶的催化下可以生成g p p ，法昵基二磷酸( f p p ) ，牦牛儿牦牛儿基 二磷酸( g g p p ) 异戊烯转移酶和萜类合酶都是利用亲电子反应机制，有碳正离子 中间产物参与。 4 薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究 j ，t ，j n o p ， p pn 仙p p 更擘一= 二二。， 图1 番昧物质的生物合成途径 f i g ib i o s y n t h e t i cp a t h w a yo ff l a g r a n c e 1 2 5 1 植物香味物质合成的相关酶 萜类合酶的基因组结构可根据其特点分为三类，第一类是含1 2 - 1 4 个内含子， 第二类是含9 个内含予，第三类是含6 个内含子洲。而在某些植物里也有含5 个内含 子的，如草莓。最简单的单萜合成反应是由柠檬烯合酶催化合成的，这个酶是所 有萜类环化反应的很好模型。柠檬烯合酶的亲电作用机理可以看作是一个分子内等 价的异戊烯转移酶反应。在异戊烯转移酶的作用下，相应的中间产物通过c 5 单位头 对尾连续加成方式而形成。如图。 一人 ，p 7兰、7 ￥人 、兰6 7入 围2 牦牛儿基= 磷酸到柠檬烯的生物合成途径 f i g 2b i o s y n t h e t i cr o u t ef r o mg p p t ol i m o n e n e 内蒙古农业大学硕士学位论文5 萜类基本骨架由萜类合酶合成后就进行修饰，从而生成不同的物质。这些次级 转化通常包括氧化，还原、异构化和连接反应。 不是所有的单萜都是环化的，芳樟醇合酶所催化的反应就不是一个环化的，它 通过去磷酸化反应后一个羟基化反应而成。 1 巳枣o h g e r a n y id i p l l o s p h a t ef h 3 同u n a l o o l 固3 芳樟醇合酶催化作用 f i g 3c a t a l y s i so f l i n a l o o ls y n t h a s c 目前的研究表明，单萜合酶在催化反应过程中，需要二价金属离子m 9 2 + 或者m n ” 的存在。在没有m g ”或者m n ”的存在时，单萜合酶是没有催化活性的。”的浓度在 2 0 删，m n ”的浓度在0 2 蜘时酶的活性比较高。几乎所有单萜合成酶( 还包括其它 的萜类合酶) 的蛋白氨基酸序列都有一个保守富含天冬氨酸的区域，t l p d d x x d 。中 间的两个x x 可以是任何氨基酸。这个保守的区域是底物与二价阳离子( l i n = + ，m g ”) 复合物的结合部位。此外，在一些单萜合酶蛋白的n 端有个保守的r r ，这两个精 氨酸是酶的催化部位。而在一些单萜合酶蛋白中却是在其它部位的组氨酸和精氨酸 共同构成酶的催化部位洲。部分酶结构如下w ： 薅辐 巍 蒯 惫 6 薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究 c li m o n e n es y n t h a s e 的结构 图4 合成酶结构 f i g 4p r n e o f s y n t h a s c 1 2 6 植物香昧基因工程的研究 在精油植物中，薄荷作为模式植物是研究最清楚。在薄荷中，储存精油有特定 的细胞组织。在叶片的表面有腺体细胞，是精油产生储存及散发的组织。这些组织 由8 个帽状腺体细胞，一个基部腺体细胞和一个柱状腺体细胞组成忡”。 在过去酌几十年对于植物单萜烯生物合成途径的研究取得了突破性的进展，许 多重要的商用单萜烯的生物合成途径已经研究清楚，代谢途径的关键酶基因如s 一 芳樟醇合酶睢枷、r - 芳樟醇合酶1 、( 一) 一( 4 d 一柠檬烯合酶螂、香叶烯合酶、( 一) 一( 1 s5 s ) 一蒎烯合酶、( e ) 一b 一罗勒烯合酶等基因已经陆续被克隆到，并 进行了转基因研究： ( 1 ) k r a s n y a n s k i 等将柠檬烯合酶基因导入辣薄荷中，但没有发现明显的变化 ( 2 ) l u c k e r 等将5 l _ 芳樟醇合酶基因( l i s ) 转入矮牵牛中，发现转基因植物 表达该基因后合成了5 一芳樟醇“”； ( 3 ) l a v y 等将该基因转入康乃馨中，结果转基因植物合成并分泌了s 一芳樟醇 及其氧化物，但其产物水平很低侧： ( 4 ) l e w i n s o h n 等将该基因在果实成熟后期特异启动子e 8 的诱导下转入番茄 中，结果转基因植物的成熟果实中产生了9 一芳樟醇和8 一羟基芳樟醇，但对其它萜 烯类化合物的合成没有造成影响”1 ； ( 5 ) l c k e r 等将从柠檬中克隆得到的8 一蒎烯合酶、y 一松油烯合酶和柠檬烯 合酶三种单萜烯合酶基因分别转入烟草中，然后通过杂交的方法把三种基因结合到 一个植株上，结果转基因植株散发出b 一蒎烯、y 一松油烯、柠檬烯及多种萜烯合成 过程中的副产品“”。 ( 6 ) h o h n 和o h l r o g g e 将一个基因来自真菌的曲古二烯合酶( t r i c h o d i e n e s y n t h a s e ) 导入烟草，导致烟叶中本来含量很低的倍半萜类成分的增加，这种外 来基因导致倍半萜环化酶活性提高，终将提高植物对昆虫的抗性。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 以往关于植物次生代谢的分析往往限于根、茎、叶等器官，较少考虑特化的细 胞类型中基因调控的特点。近十多年来较多地从代谢途径的基因调控方面来研究 直 物中如此丰富、多样的终端产物是如何衍生出来的。以萜类家族为例，t u r n e re ta l 详细研究了薄荷中单萜生物合成关键酶柠檬烯合酶( 1 i m o n e n es y n t h a s e ) 在油腺 体分泌细胞中的分布和作用。s h a r m ae ta l 研究分泌型腺毛结构的发育过程，将 代谢与结构的形成紧密联系起来1 。w a g n e re ta l 对此类研究做了综述，十分详细 论述了分泌型腺体的代谢特征。指出t r i c h o m e 做为一种生物工厂在制造天然产 物和提高植物抗虫能力方面的重要作用。g o o s s e n se ta l 将功能基因组的研究方 法引入植物细胞次生代谢物的研究领域“”。f r i d m a ne ta l以一种野生番茄 ( l y c o p e r s i c o nh i r s u t u m ) 为材料鉴定了甲基酮生物合成的关键基因，甲基酮合 酶( m e t h y l k e t o n es y n t h a s e ) 基因“”，做了详细的相关的代谢过程的研究。2 0 0 5 年华盛顿州立大学c r o t e a u 领导的实验室发表了两篇关于单萜代谢的分子生物学 的文章啪叫。2 0 0 6 年这个实验室在分析了大量薄荷腺体表达标签序列的基础上，探 索精油生物合成和分泌的全过程“”。最近v a nm o n t a g u 领导的在g h e n t 大学的实验 室发表了以长春花为材料的，关于次生代谢基因组学的研究，认为萜类化合物吲 哚类生物碱从基因到代谢网路模式受控与发育和环境两个方面的因素。b r o u n 和 s o m m e r v i l l e 发现植物体内萜类化合物的合成可以走细胞质途径旧1 ，即倚赖于甲羟 戊酸( m e v a l o n a t e d e p e n d e n t ) 的途径也可走质体途径，即在质体中将丙酮酸和甘 油醛一3 - 磷酸转化成脱氧木酮糖- 5 - 磷酸( 1 - d e o x y x y u l o s e - 5 - p h o s p h a t e ，d x p ) ，d x p 经过一系列反应生成萜类代谢的前体物质异戊基二磷酸和二甲丙烯二磷酸( 图5 ) w a n ge ta l 研究了一种p 4 5 0 基因的腺体专一性表达1 ，以及h ue ta l 研究受r o l c 启动子调节的基因在植物腺毛中的表达对于腺体产物的基因工程是很有意义的 i 蛳o a 人一= + 且j 、。j a 炽。_ 人a 人一= 儿j 、。二a 双。二：- 人、 b 等坼一 k ，磊氧n 木热s 龋 甘油醛3 磷酸 2 甲篓l j 赤藓糖爵2 。4 坪化二磷酸 围5 植物腺体细胞中单萜的代谢途径 f i g 5 m e t a b o l i cp a t h w a yo f g l a n d u l a r t r i c h o m ci np l a n t s 碡螬 单稿 8 薰农草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究 最近关于萜类生物合成调控的工作有一些重要的进展。s c h n e ee ta l 的研究 指出在玉米幼苗在受到鳞翅目幼虫的攻击时会散放出一种信号分子吸引雌性的膜 翅目昆虫在鳞翅目幼虫上产卵。对玉米的一个自交系的倍半萜做了系统的分析， 发现5 组倍半萜的形成都与一种二磷酸法呢萜合酶有关。编码它的基因是t p s i o 。 使这个基因在拟南芥中过量表达后，利用转基因植物的生物试验，证明t p s i o 所产 生的萜类可以间接地用于植物防御害虫的攻击。s a u r e t - g u e t oe ta l 的研究表明 在拟南芥的质体中进行着对积累磷酸甲基赤藓糖醇起关键作用的酶有一种转录后 的调节彻。即磷酸甲基赤藓糖醇生成途径是受调节的。k o e d u k ae ta 1 分析了毛罗 勒( o c j m u mb a s j l i c u m ) 腺体中苯丙烯化舍物合成和积累过程。 目前一些研究十分关注在植物体内存在的含量甚高的萜烯合成的底物。通过基 因工程手段促使萜烯在异源体系中合成，探索提高植物精油合成量的新途径。柠檬 烯是自然界中存在最丰富的单萜烯，它是由所有植物中共同存在的底物栊牛儿焦磷 酸( g p p ) 环化而成的第一种香味化合物。研究表明，在辣薄荷和荷兰薄荷中，柠檬 烯是萜烯类精油合成的共有烯属前体，在经过一系列的次级转换( 主要是氧化还原 反应) 后，生成各种衍生物。从而使植物散发出各自特有的香味慨删。而柠檬烯合 酶是柠檬烯生物合成过程中的关键酶，该酶的过量表达有利于精油合成途径同其他 的代谢途径竞争底物g p p ，从而提高香味化合物的合成。植物精油主要在腺体细胞 中形成，柠檬烯合酶基因的表达又在转录水平上受到调控“”“。t u r n e r 和c r o t e 8 u 对薄荷单萜生物合成过程做了研究，依据腺体中免疫定位的资料认为有4 种酶参与 薄荷烷单萜生物合成”。它们是薄荷烷磷酸合酶( g e r a n y ld i p h o s p h a t es y n t h a s e ) ， 柠檬烯羟化酶( 1 i m o n e n e - 6 - h y d r o x y l a s e ) ，顺式异薄荷二烯醇脱氢酶 ( i s o p i p e r i t e n o ld e h y d r o g e n a s e ) 和长叶薄荷醇脱氢酶( p u l e g o n er e d u c t a s e ) 在这些酶的协同作用下变成向胞外分泌的精油成分。m a h m o u d 和c r o t e a u 是首次采用 遗传工程提高薄荷精油含量和品质t t l 。 1 3 原核蛋白表达 蛋白质表达是为获取大量目标蛋白而进行有目的性的蛋白质合成。早期的蛋白 表达是通过遗传学操作，筛选经体内重组而得到含插入目的基因的噬菌体。随着分 子生物学技术的不断成熟发展，d n a 重组技术被用于体外构建噬菌体和质粒。以进 行克隆基因产物的大量合成。目前对于外源基因的表达从生物分类上有两类：原核 表达系统和真核表达系统。真核表达系统又可分为酵母表达系统、昆虫表达系统和 哺乳动物细胞表达系统。该系统最大的优点是产出的目的蛋白具有生物活性，可用 于基因疫苗的研制、商业化生产基因治疗等。从寄主细胞上说有五套相当成熟的系 统，分别是大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、酿酒酵母表达系统、昆虫 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统。这些系统的宿主细胞相对应的是大肠杼菌、 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、培养昆虫细胞和培养哺乳动物细胞。 原核表达系统是以大肠杆菌作为克隆载体的宿主，让大肠杆菌生产出目的蛋 白。原核表达系统从开始使用以来一直得到人们的厚爱，主要是因为：所需技术相 对简单；获得一个超量表达的菌株所需时间很短；大肠杆菌的培养条件易于控制， 生产成本低；对大肠杆菌的遗传学和生物学特性了解比较透彻，易于对它进行改造 来满足人们的需要；在大肠杆菌中容易高表达，甚至可使目的蛋白达菌株总蛋白的 3 0 一4 0 。 但是原核表达也存在一些不利因素：由于原核细胞和真核细胞蛋白质合成利用 的转录和翻译机制存在较大差别，使得原核蛋白在大肠杆菌中表达后得不到正确的 修饰；在大肠杆菌中大量表达的蛋白常常形成不溶性的“包涵体”，需将它们在变 性剂中溶解后复性，这样才有可能得到有生物活性的蛋自。而交性和复性的过程是 十分繁锁的，且有时经变性复性后蛋白就失去活性。 尽管这样，人们还是优先试用大肠杆菌，不能达到预期耳标时才换用真核表达。 所以大肠杆菌一直成为人们表达多种蛋白的理想工具。从而为研究蛋白质的结构与 功能提供了便利。在该系统中获得成功表达的分泌蛋白，这些蛋白分泌到大肠杆菌 周质空间。该系统极大的优越性促使人们不断完善此系统。原核生物的m r n a 不需 进行修饰，在它的3 端尚未完成转录前，其5 端已与核糖体结合，开始蛋白质 的合成，即所谓的转录和韶译偶联。 1 3 1 蛋白质在大肠杆菌中表达的策略 在大肠杆菌中表达外源基因，首先要选择合适的表达载体。载体应具有的几种 元件即：可以调控的转录启动子，经诱导后可以从克隆化基因产生大量的信使r n a ； 转录调控序列，包括一个s d 序列( 核糖体结合位点) 和起始密码子a t g ；选择标 记的编码序列，以筛选载体是否进入菌体细胞；多克隆位点，便于基因操作，使外 源基因以正确的方向插入载体。 目前在原核表达系统中应用最广泛的启动子有三类：第一大类为i p t g 诱导的 启动子。具体有：大肠杆菌的t r p 启动子，来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子除去色 氨酸或加入3 - b 一吲哚丙氨酸提高转录活性：大肠杆菌的l a c 启动子，来源于大肠 杆菌的乳糖操纵子，在有乳糖或i p t g 存在时能够启动转录，可通过蓝自斑筛选重 组克隆的任何多用途载体均可用于表达外源蛋白；t r p - l a c ( t r c ) 启动子，它与 t a c 启动子的唯一区别是- 3 5 区和- 1 0 区之间的间隔序列不同，在t r c 启动子中。 两个元件之同间隔是1 7 b p ，而在t a c 启动子中是1 6 b p ，这一区别对外源蛋白的表 达影响不大；t a c 启动子，将l a c 的- 1 0 区和t r p 启动子的- 3 5 区融合起来的启动 子，是一种非常强的启动子，它比l a c 启动子和t r p 启动子都强得多。第二大类为 1 0 薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究 噬菌体p 。启动子，受温度敏感型阻抑物c i t s 8 5 7 调控，c i t s 8 5 7 在低温下能抑制 p l 驱动的转录，而高温时贝f j 不能。第三大类为t 7 噬菌体启动子，受t 7 噬菌体 l n a 聚合酶调控。 i 3 2 外源基因的表达 选择合适的表达系统是将外源基因表达为蛋白质的关键，一般地选择表达载体 从三方面考虑。第一，蛋白质的大小。小的胞质蛋白和多肷( 长度小于1 0 0 个氨基 酸残基) 最好能通过标准肽键与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表 达。运载序列通常能起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降解，并提供 用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白酶在融合蛋白的适当位点进行切割，可回收 到有活性的靶蛋白。表达长度大于1 0 0 个氨基酸残基的胞质蛋白，在任何表达系统 都比较困难。在大肠杆菌中常形成包涵体或产物不稳定，在哺乳动物中如何将外源 蛋白和它的内源同系物区分开来也是困难；第二，根据蛋白质的需要量。如果只需 少量的靶蛋白，就不必进行优化表达；如果酶的活性可用大肠杆菌粗提物进行分析， 则多数标准表达质粒都可以：如果活性蛋白需要纯化或蛋白质的需要量很大，就必 须试验不同的宿主载体系统和纯化方法：第三，根据蛋白质是否需要保留活性。 如果表达靶蛋白的目的只是用于产生抗体，就不一定需活性蛋白，而可选择便于纯 化的表达系统：如果靶蛋白是用于生物化学或细胞生物学研究。则保持或恢复蛋白 质的功能就非常重要，而是否易于纯化就显得比较次要了；如果靶蛋白用于结构研 究，最好以可溶性状态表达。如果选定在大肠杆菌中表达外源基因，那么又必须注 意以下三个方面，即翻译效率的优化，密码子的使用和培养条件的优化。 外源基因在原核系统中表达有两种形式，一种是融合蛋白的形式；另一种是非 融合蛋白的形式。通过d n a 重组技术，将外源基因与宿主基因片段融合在一起进行 表达即可形成融合蛋白；非融合蛋白是指所表达的外源基因n 端不含有其它氨基 酸翻译起始位点a t g 必须位于外源基因片段的5 端。 i 4 观赏植物育种的研究进展 自1 9 8 7 年m e y e r e t a l 获得转基因矮牵牛以来，花卉基因工程迅速发展，并已 成为花卉育种的新趋势。花卉基因工程通过抑制内源基因或导入外源基因而定向改 造特定性状且不丧失原有性状，大大缩短了新品种选育的时间；而且可以突破种问 不亲和的限制，将目的基因引入原来没有这种基因的物种，从而极大地改良花卉品 质。甚至创造新品种。 1 4 1 我国园林花卉业发展现状 我国园林花卉业在过去一段较长的时问内受“极左”的思潮的干扰，使我国园 内蒙古农业大学硕士学位论文 卫 林花卉业曾一度处于奄奄一息的境地。目前园林花卉业的状况：一方面是原有的传 统园林花卉优势已不复存在；据不完全统计，在“八五”、“九五”期间，我国花卉 的种植面积达7 0 5 万h 舻，产值达4 0 亿元，出口创汇6 7 0 0 万美元9 。另一方面又 没有新的花种提供选用，特别是制种技术落后不能满足现代花坛的要求。因此， 许多城市的花坛等绿地用花，不得不进口种子种苗。耗费大量费用，买来年年面目 依1 日的花坛。另外，除了绿化用花外，随着城市的国内外交往增多，各种庆典、节 日等活动频繁，这些活动都需要大量花饰，有的活动用花量相当巨大。此外，随着 市民生活水平的提高，室内装饰用花已成为时尚。而这些用花，目前大都靠进口花 种。因此，目前最急迫的工作是加强园林花卉的引种育种工作。 1 4 2 花卉传统育种的现状 新中国建立以来，我国花卉育种工作取得了很大的发展，特别在许多传统的花 卉育种技术水平如梅、牡丹、菊花、荷花、杜鹃和月季等优良品种的繁育研究方面， 居世界领先地位近5 年来，我国花卉产业迅速发展，育种工作的广度和深度大大 加强。特别是随着人们生活需求发生变化，花卉产业随之进行结构调整，花卉的育 种目标也随之进行了调整，使我国花卉、育种近几年来在诸多方面都取得了显著成 绩。然而，花卉常规育种技术仍然是花卉育种的主要手段，包括引种、选择育种、 杂交育种、花卉辐射诱变育种、花卉化学诱变育种及航天诱交育种。世界各国通过 常规技术育成的花卉新品种仍占主导地位。 1 4 3 与园林植物相关的基因克隆与转化的研究进展 1 4 3 1 开花相关基因 植物开花是由开花基因所调控，当这些基因突变失活后，植物就不能开花，不 断地产生叶芽。花卉形态包括花器官形态、花技着生状态、花序类型及植株形态等， 花器官的大小、重瓣性、花枝多少、花序类型、植株形态是否优美都直接影响到花 秀的观赏价值和商业价值。花卉形态的代谢途径非常复杂，人们对其发育及调控机 理知之甚少，但已从几种植物的花原基中分离出一些对花器官的分化起关键作用的 基因“h o m e o t i cg e n e s ”，这些基因的表达会影响花朵的大小，形状和花期。k e l l y 等从烟草中克隆了n f l l 和n f l 2 基因，它们可以特异地决定花和叶的前体细胞。在 对拟南芥和金鱼草的研究中发现了4 对对花发育后期作用的基因，它们决定着所形 成的花的形态和特征。科研人员从矮牵牛、拟南芥和金鱼草的突变体中鉴定出几个 控制花朵形态的基因如控制花瓣数、花瓣形状、花瓣对称性的基因，控制花器官原 基数目和位置的基因，花发育抑制基因等，将这些基因导入某些花卉内，有望培育 出特异花形的新品种。通过转基因手段改变这些基因的结构，从而使其不能正常表 达，来达到控制开花和花形的目的 1 2 薰农草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究 1 4 3 2 花色相关基因 花色是一种复杂性状，主要由类黄酮、类胡萝卜素、甜菜素三类色素决定。类 黄酮控制花的粉红色、红色、紫色、红紫色及蓝色，是花的主要色素。类胡萝卜素 主要控制花的黄色和橙色。现已知道的控制花色基因主要有：控制黄酮类生物合 成单个步骤的基因，与黄酮类修饰有关的基因：开关全部或部分合成途径的调节基 因；影响黄酮类浓度的基因；与花朵结构有关的基因；影响花色的其它基因。目前 克隆的控制花色的基因主要是一些从矮牵牛、玉米和金鱼草等植物中分离并克隆出 来，影响花色素苷代谢的结构基因和调节基因。另外以已有的基因为探针，用转座 子标签技术分离一些植物花色素苷调节基因，如金鱼草的p r ，矮牵牛的d e l i l a 、 s o s e a 等。 利用基因工程改良花色的主要方法是反义r n a 抑制法、共抑制法和常规外源基 因导入法。利用反义r n a 抑制法和共抑制法的原理都是让转化的新基因抑制内源基 因的表达，导致无色中间产物的积累，培育出浅色花或无色花。这两种方法均成功 转化了矮牵牛、菊花。有报道红玫瑰经共抑制法转化得到粉红色玫瑰，粉红色香石 竹变成浅粉色。外源常规基因导入法也成功转化了矮牵牛。蓝色是月季、香石竹、 郁金香等花卉所缺乏的颜色，育成蓝色月季、蓝色郁金香、蓝色香石竹一直是人们 的梦想，要实现这一梦想最重要的条件是增加液泡液的p h 值。现已清楚p h 值是由 p h i p h 6 共6 个基因决定的，其中p h l 已被克隆出来了，如果其它5 个基因全部被 克隆出来，育成蓝色月季、香石竹等花卉将指日可待。 1