（分析化学专业论文）核酸与维生素金属络合物相互作用及其分析应用的研究.pdf

山东大学磺士学位论文 中文摘要 核酸和蛋白质是生命现象的物质基础，对于它们的研究已经成为生命科学的 重要内容。核酸是生物的基本遗传物质，是一种非常重要的生物大分子，与生物 的生长。发育以及癌变，突变等异常活动相关核酸的定量测定是生物化学和其 它生物学科中经常涉及的分析任务，也是许多生化药物分离提纯中质量检验及食 品检验中常见的分析项目，而测定的结果为临床检验中疾病诊断及治疗提供了科 学依据。 探针技术是研究核酸和蛋白质结构、功能、定性、定量的重要手段，对核酸 探针的研究已成为生命科学领域的前沿课题。本论文主要研究了新的核酸探针及 维生素的灵敏的分析方法，并探讨了维生素与核酸之间相互作用的机理和发光机 理。 在论文的第一部分中，介绍了研究核酸与药物分子之间相互作用的主要手 段，综述了荧光和共振光散射技术在核酸测定中的分析应用和维生素类药物的荧 光分析进展 在论文的第二部分中，研究了核酸对r u t i 铲- i ，a 3 + 体系的荧光增强效应，并 将其应用于核酸的定量测定。研究发现，在t r i 卜_ h c l 缓冲溶液中，核酸能明显 增强r u t i n _ i a 3 + 的荧光强度，其增强程度与核酸的浓度在一定范围内呈良好的 线性关系。在最佳条件下，f s d n a 和y r n a 的线性范围分别为8 1 0 - 8 1 x l o - 5g m l 和l 1 0 7 9 x 1 0 巧g m l ，检出限为8 1 0 和5 4 x 1 0 8 咖l 。该方法已用于合成样品 的测定，其结果令人满意。机理研究表明，r u t j 舻- i a 如通过静电引力和核酸发生 反应，从而形成一个大的r l n i n i a t _ 核酸络合物。同时，核酸为r u t i n _ - ia p 体系提供良好的疏水环境，降低了r i n i n _ - i a ”和水分子之间的碰撞，减少了因 碰撞而导致的能量损失，提高了荧光量子效率，使体系的荧光强度大大增强。 论文的第三部分，研究了烟酸e u q 酸体系的散射光增强效应，并建立 了测定核酸的新方法。研究发现，在t r j 卜h c l 缓冲溶液中，核酸能明显增强烟 酸e u 3 + 体系的散射光强度。在最佳实验条件下，散射光增强的程度在一定范围 内与核酸的浓度成线性关系。f s d n a 的线性范围为7 1 0 - s 1 1 0 巧g ，n l l ，检出限 山东大学硕士学位论文 为2 1 0 g m l 该方法已用于合成样品的测定，结果令人满意。机理研究表明。 核酸与烟酸e u 弘之间是通过静电作用结合的。 论文的第四部分主要研究了叶酸e u 斗体系的荧光特性，并用于叶酸的定量 测定机理研究表明，叶酸经氧化后，生成了喋岭6 羧酸，它能与e u ，+ 生成 络合物。当用光照射时，叶酸的氧化产物将吸收的能量通过分子内能量转移传递 给e i ，从而发射e u 3 + 的特征荧光，由此建立了叶酸的灵敏测定方法增强的 荧光强度在一定范围内与叶酸的浓度成线性关系。在最佳实验条件下，叶酸的线 性范围分别为4 x 1 0 4 - 4 1 0 - 5m o l l ，检出限分别为1 2 1 0 4 m o l l 。该法已用于实 际样品中叶酸含量的测定，结果令人满意。 本论文的主要特点： 1 研究表明，核酸对稀土金属离子配合物r u 血卜_ i a ”的荧光具有明显的增 强效应，由此建立了测定核酸的荧光光度法，并已用于合成样品的测定机理研 究认为核酸通过静电引力与r l 出n _ - i a 3 + 形成了三元络合物。而核酸为 r u f i n l a 3 + 体系提供了一个疏水环境，减少了与水分子碰撞而造成的能量损失， 从而提高了体系的荧光强度。 2 研究指出，核酸通过静电引力作用与烟霞受_ - e u 3 + 体系结合成络合物，从而 增强了烟酸e u 3 + 体系的散射光强度。由此建立了测定核酸的光散射技术，并用 于合成样品中核酸的测定。该方法具有简便快速、稳定性好的特点。 3 研究发现，叶酸被氧化后能与e u 3 + 生成络合物，并发射e u 3 + 的特征荧光 机理研究认为，叶酸氧化产物通过分子内能量转移将吸收的能量传递给e u 3 ，从 而发射e u 3 + 的特征荧光。据此建立了灵敏的测定叶酸的荧光方法，并用于实际样 品中叶酸的测定 关键词：荧光；散射光；核酸；芦丁；烟酸：叶酸；稀土离子 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t n u c l e i c a c i d s a n d p r o t e i n a l e t h e m a t e r i a l b a s e o f l i f e ，t h er e s e a r c h o n w h i c h p l a y 强i m p o r t a n tr o l e i nt h ea r e ao fl i f es c i e n c e s n u c l e i ca c i di sa l li m p o r t a n t b i o - m a c r o m o l e c u l ea n dt h ec a r r i e ro f g e n e t i ci n f o r m a t i o n t h eq u a n f i t a l i v ea n a l y s i so f n u c l e i ca c i d si so f t i n v o l v e di nt h ea n a l y s i so fb i o c h e m i s t r ya n do t h e rb i o l o g i c a l s u b j e c t s i ti st h ec o m m o na n a l y t i c a li t e mi nt h ef o o de x a m i n a t i o na n di nt h et e s to f m a n yb i o c h e m i c a lm e d i c i n e s s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n t h ea n a l y s i sr e s u l t sp r o v i d e s c i e n t i f i cb a s i sf o rt h ed i s e a s ed i a g n o s i sa n dt h et h e r a p y p r o b et e c h n i q u ei st h ei m p o r t a n tm e a n sf o rt h er e s e a r c ho fn u c l e i ca c i d s 咖l c t l 】f u n c t i o n , q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s e s t h i st h e s i sm a i n l ys t u d i e d t h en e wn u c l e i ca c i dp r o b ea n dt h ei n t e l l i g e n ta n a l y t i c a lm e t h o do f t h ev i t a m i n a tt h e s a m et i m e ，t h i st h e s i sd i s c u s s e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ev i t a m i na n dn u c l e i c a c i d , a n dg a v e o u tt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e nn u c l e i ca c i d sa n d v i t a m i n - m e t a lc o m p l e x e s i nt h ef i r s ts e c t i o n , w es u n u i l a r i z e dt h er e c e n td e v e l o p m e n t so ft h ef l u o r e s c e n c e a n dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gp r o b e so f n u c l e i ca c i da n dt h ea n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s ， a n do v e r v i e w e d ，t h ef l u o r e s c e n c ep r o b e so ft h ev i t a m i nm e d i c i n ea n dt h em a i n m e a n so f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e l ln u c l e i ca c i da n dt h em e d i c i n e ht h es e c o n ds e c t i o n , w es t u d i e df l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n to f 口+ 巾n i n - n u c l e i ca c i ds y s t e m , w h i c hw a su s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h en u c l e i ca c i d i n t r i s - h c lb u f f e r , t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fn 坩n - ia ”s y s t e mc a n b eg r e a t l y e n h a n c e db yn u c l e i ca c i d sa n dt h ee n h a n c e di n t c m i t yi si np r o p o r t i o nt ot h e c o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d si nt h er a n g e8 x 1 0 s i x l 0 5 咖lf o rf s d n aa n d i x l 0 7 9 x 1 0 6 9 m l f o r y r n a , t h e i r d e t e c t i o nl i m i t sa r e 8 x l o s g m l a n d 5 4 x 1 0 4 e m l ，r e s p e c t i v e l y t h es y n t h e t i cs a m p l e sw e r es a t i s f a c t o r i l yd e t e r m i n e d t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mi sa l s os t u d i e d i ti sc o n s i d e r e dt h a tn u c l e i ca c i dc a nb i n d w i t ht h ec o m p l e xo fr u t i n _ l a 射 t h r o u g he l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o na n df o r mal a r g e r u t i n - l a 也n u c l e i ca c i d sc o m p l e x a tt h es a m et i m e n u c l e i ca c i d sp r o v i d ea l l o p t i m u mh y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t f o r r u t i n l a r c o m p l e x ，r e s u l t i n g i nt h e 溢 山东大学硕士学位论文 f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e mo ft h ei a t t e r i na d d i t i o n , t h eh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n to f n u c l e i ca c i d sc a na l s op v e n tt h ec o l l i s i o nb e t w e e nc o m p l e xa n dw a t e r m o l e c u l e sa n d d e c r e a s et h ee n e r g yl o s so f t h er u t i n - l a 3 + - n u c l e i ca c i d ss y s t e m t h u s ，t h ef l u o r e s c e n c e q u a n t u my i e l di si m p r o v e da n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fr u t i n - l a 3 + s y s t e mi s s i g n i f i c a n t l ye n h a n c e d i nt h et h i r ds e c t i o n , w ef o u n dt h a tn u c l e i ca c i dc o u l de n h a n c et h es c a t t e r i n gl i g h t i n t e n s i t yo fe u 3 + - v p p b a s e do nt h i s an e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i c a c i di sw o p o s e d i nt r i s - h c lb u f f e r , t h es c a t t e r i n gi n t e n s i t yo f v p p e u 3 + s y s t e mc a n b eg r e a t l ye n h a n c e db yn u c l e i ca c i d sa n dt h ee n h a n c e di n t e n s i t yi si np r o p o r t i o nt ot h e c o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d s i nt h er a n g e7 x 1 0 l l x l 0 。5 9 m lf o r6 d n a ，a n di t s d e t e c t i o nl i m i ti s2 x1 0 s g m l t h es y n t h e t i cs a m p l e sa r es a t i s f a c t o r i l yd e t e r m i n e d t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mi sa l s os t u d i e d i ti sc o n s i d e r e dt h a tn u c l e i ca c i dc a nb i n d w i t ht h ec o m p l e xo fv p p - e u 弘t h r o u g he l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o na n df o r mal a r g e v p p - e u ”- n u c l e i ca c i d sc o m p l e x ht h ef o u r t hs e c t i o n , i ti si n d i c a t e dt h a tt h ef o l i ca c i d e u 3 + s y s t e mc a ne m i tt h e c h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c eo fe u 3 + b a s e do nt h i s ，af l u o r i m e t r i cm e t h o df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ff o l i oa c i di sp r o p o s e d t h es y n t h e t i cs a m p l e sa r cs a t i s f a c t o r i l y d e t e r m i n e d t h et e s ti n d i c a t e st h a tt h ef o l i ca c i dc a nko x i d i z e db yk m n 0 4a n d p r o d u c et h ep u r i n eo fb u t t e r f l y 6 c a r b o x y la c i d w h i c hc a nb i n dw i t ht h ee u 3 + a n d f o r mac o m p l e x i ti sc o n s i d e r e dt h a tw h e nt h ec o m p l e xi se x c i t e d ，t h ep i l r i n eo f b u t t e r f l y 6 - c a r b o x y la c i da b s o r b st h el i g h te n e r g ya n dt h e nt r a n s f e r si tt oe u 3 + t h r o u g hi n t r a m o l e c u l a re n e r g yt r a n s f e r t h ee x p e r i m e n t si n d i c a t et h a tu n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi s i np r o p o r t i o nt ot h e c o n c e n t r a t i o no f f o l i ca c i di nt h er a n g eo f 4 x 1 0 s - 4 x 1 0 5g m l ，a n di t sd e t c c d o nl i m i t i s1 2 x 1 0 4g m l t h em e t h o dh a sb e e nu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f f o l i ca c i di nt h e a c t u a ls a m p l e s 1 1 c h i e f c h a r a c t e r i s t i c so f t h i st h e s i s 黜a sf o l l o w s ： 1 i ti si n d i t e dt h a tn u c l e i ca c i d sc 跹e n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei nt h er u t i n l a s y s t e ma n da p p l yi tt ot h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i di nt h es y n t h e t i cs a m p l e i ti s c o n s i d e r e dt h a tn u c l e i ca c i dc a l lb i n dw i t ht h ec o m p l e xo fr u t i n - l a 羚t h r o u g h “ 山东大学硕士学位论文 e l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o na n df o r mal a r g em t i n - l a 也n u c l e i ca c i d sc o m p l e x , a n dn u c l e i c a c i d sp r o v i d e s 趾o p t i m u mh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n tf o r m t i n - l a 3 + c o m p l e x , r e s u l t i n gi nt h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n to ft h el a t t e r i na d d i t i o n , t h eh y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n to fn u c l e i ca c i d s 锄a l s op r e v e n tt h ec o l l i s i o nb e t w e e nc o m p l e xa n d w a t e rm o l e c u l e s s ot h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft u r i n l 矿+ s y s t e mi ss i g n i f i c a n t l y e n h 枷e d 2 t e s ti n d i c a t e dt h a tn u c l e i ca c i dc a nb i n dw i t hv p p - e u 3 + c o m p l e xa n df o r ma l a r g ec o m p l e x , r e s u l t 吨i nt h e e n h a n c e m e n to fs c a t t e r i n gl i g h to ft h es y s t e m b a s e d o nt h i s ，an e wm e t h o do fn u c l e i ca c i di sp r o p o s e da n di sa p p l i e dt ot h ed c t c r m i n r t i o n o f n u c l e i ca c i di nt h es y n t h e t i cs a m p l e t h em e t h o d sa s i m p l ea n ds t a b i l i t y 3 t h ei n v e s t i g a t i o ni n d i c a t e st h a tt h eo x i d i cp r o d u c to ff o l i ca c i dc a l lb i n d 、i 血 e 矿a n df o r mac o m p l e x 。w h i c hc a ne m i tt h ec h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c eo fe u 3 + t h r o u g ht h ei n w a m o l e c u l a re n e r g yt r a n s f e r b a s e do nt h i s ，t h en e wm e t h o do fh i l g h s e m i t i v ed e t e r m i n a t i o no f f o l i ca c i di se s t a b l i s h e da n di su s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f f o l i ca c i di n t h ea c t u a ls a m p l e s t h em e t h o di sr a p i da n ds e n s i t i v e k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c e ，s c a t t e r i n gt i g h t , n u c l e i ca c i d ，r u t i n ，n i c o t i n i ca c i d ，f o r t e a c i d r a r ee a r t hi o n s v 山东大学硕士学位论文 符号与缩写 r u t i n ：芦丁 v p p ：烟酸 l i ea c i d ：盱酸 r s ：瑞利光散射( r e i l e n t hs c a t t e r i n g ) f s d n a ：鲱鱼精子脱氧核糖核酸 y r n a ：酵母核糖核酸 b s a ：牛血清白蛋白 h s a ：人血清白蛋白 c y s h 半胱氨酸 p h e ：苯丙氨酸 g l u 谷氨酸 h i s ：组氨酸 i r i s ；三羟甲基氨基甲烷 k 体系的荧光强度 k 荧光强度的增强值 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 筚 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：导师签名：二魄日 期：譬丛矿 山东丈学硬圭学位论文 第一章绪论 生命过程实质上是一系列生物分子间发生的各种化学反应以及所引起的物质和能 量的转抉过程，在生命活动中，蛋白质和核酸是生命现象的物质基础，是体内主要的生 物大分子，各自有其独特的结构特征，并分别行使不同的生理功能，在生物体内起着最 基本、最重要的作用。核酸是生物的基本遗传物质，其构成单位为核昔酸。它分为脱氧 核稽核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) , d n a 是遗传信息的重要载体，r n a 则在蛋白 质生物合成中起着重要的作用，核酸中储存着生命体的全部遗传信息，与生物的生长、 发育以及癌变、突变等异常活动密切相关。因此，核酸在生命过程中具有十分重要的功 能和作用，对它进行检测，将成为生命科学研究中非常重要的内容，可为生命科学的研 究提供重要的科学依据，具有重要的研究价值【1 4 j 。 药物是对疾病具有预防、治疗和诊断作用或用以调节机体生理功能的物质药物与 人类生活密切相关，药物自给药部位吸收进入血循环后，通过各种生理膜从血液转移蓟 各组织器官。药物的吸收、分布、代谢及排泄等直接影响到药物在其作用部位的浓度和 有效浓度的持续时间，从而决定着药物作用( 药理作用和毒性作用) 的发生、发展和消除。 药物分子与核酸等生物大分子的作用是一项重要的药物动力学研究工作，当药物进 入体内后，主要是通过血液的储存和运输达到受体部位，进而发生药理作用。研究药物 与核酸的作用机理，建立核酸、药物灵敏的测定方法，对于阐明药物的作用机制、药代 动力学、药物的毒性、研制新型药物以及攻克疑难病症具有非常重要的意义。 第一节核酸与药物分子的作用模式及研究方法进展 1 1 前言 研究药物小分子与核酸( 主要是d n a ) 之间的相互作用，不仅有利于探索和开发 新的核酸探针，而且有助于在分子水平上阐述抗癌、抗病毒药物的作用机制，阐明有毒 物的致癌、致畸的分子生物学机理，实现药物的体外筛选，因此具有潜在的应用价值t 以d n a 作为药物作用靶是有效的新型的新药设计和药物筛选手段。药物与d n a 相互作 用的研究是认识某些疾病的致病机制和药物的治病机制的基础，在阐明d n a 结构和功能 方面具有重要意义。核酸由平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链 形成的大沟、小沟组成了小分子的识别位点，小分子与核酸的结合区位于核酸的藏基、 l 山东大学硕士学位论文 磷酸骨架以及戊糖环部分。 1 2 核酸与其靶向分子相互作用的模式 药物小分子与d n a 的相互作用模式归纳起来大致可分为非共价结合、共价结合和剪 切作用三种类型【8 1 2 1 1 2 1 非共价作用 通常认为，小分子与d n a 的非共价作用主要有三种方式：外源分子或离子插入到 d n a 分子双螺旋碱基之间的嵌入作用；外源分子或离子与d n a 分子的带负电荷的核 糖磷酸基骨架之间的静电作用；通过非特异性的静电作用结合到荷负电的d n a 双螺 旋外部的沟槽作用。 1 2 1 1 嵌入作用( i n t e r c a l a t i o nb i n d i n g ) 嵌入作用，即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系统，嵌入结合的作用 力来自芳环的离域兀体系与碱基的兀体系间的g - g 相互作用及疏水相互作用。这是 药物分子与d n a 发生作用的最重要的形式之一 早在1 9 6 0 年，l e r m a n 对于d n a 与平面芳香化合物的作用进行了大量的研究，提出了 一个平面芳香稠环结构的分子能以嵌入方式与d n a 相结合的模式，这个模式已经被大量 的多环芳香族分子所证实，如：溴化乙锭、阿霉素等。这些经典的嵌入剂主要是一些平 面的带正电荷的芳香族小分子，由于其分子体积小，具有一定的平面性，可以嵌入到d n a 双螺旋结构的临近的碱基对之间。碱基堆积是维持d n a 结构稳定的主要作用力之一，嵌 入剂的嵌入在几何形状上使双螺旋结构畸变( 即变长) ，一般可通过嵌入剂存在下溶液 粘度的增大而证明，对照沟区结合分子的a ：t 碱基对的倾向性，d n a 嵌入剂有轻度的g ： c 碱基对的倾向往。非经典的嵌入剂主要有两类：一类是双嵌插剂，双嵌插荆是两个嵌 插环被不同长度的链共价连接起来，相对于一元嵌插剂来说，作为药物的生物活性往往 由于与d n a 的强结合而加强，分解速率也低。另一类是带有多个大取代基的嵌插剂，如 果嵌插荆带的取代基太大，或有极性，或带电荷，则对嵌插剂结合及分解的动力学都会 有影响，如诺加霉素就属于这一类 1 2 1 2 静电作用( e i e c t r o s t a t i ei n t e r a c t i o n ) 静电作用，即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的d 1 叮a 双螺旋外部。核 酸是高度电荷化的聚合电解质，其带负电荷的磷酸骨架可以同阳离子发生静电作用。一 般认为，静电结合没有选择性，它作用于磷酸骨架，文献认为核酸分子表面由静电力形 2 山东丈学硕士学位论文 成的水化层中水分子的排列与碱基有关通常认为这种作用模式在作为药物的应用上价 值不大，但也并非完全如此。例如，t m p y p 金属卟啉带正电的侧链与d n a 磷酸酯骨架间 的静电作用对它能嵌入结合在g c 碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 1 2 1 3 沟槽作用( g r o o v eb i n d i n g ) 沟槽作用，即d n a 靶向分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作用。 很多蛋白分子与d n a 特异性的结合是通过d n a 大沟区作用，而药物小分子因其分子体 积小多数在小沟区作用，大、小沟区在电势能、氢键特征、立体效应及水合作用上都存 在很大的不同，典型的小沟区结合的药物分子多由几种简单的芳香杂环结构单元组成， 如呋喃、吡咯、苯环等，这些芳环由扭转自由的键来连接，由此产生合适的扭转力来配 合小沟区内的螺旋曲线，取代沟区的水分子，并与d 】她双螺旋中沟区的碱基对边缘通过 范德华力相互作用。分子上的- n h 基团可以同碱基对形成氢键，小沟区是a ：t 富集区， 它与g ：c 富集区相比更窄一些，更有利于形成范德华力，小分子主要在t 的c - 2 位的0 或a 的n - 3 形成氢键，同时a ：t 富集区的负电荷大于g ：c 富集区，有利于带正电荷的小 分子进入沟区。p u l l m a n 等已经说明了d n a 的a ：t i , 沟区的负的静电势大于g ；c 富集区， 是形成d n a 沟区特异性作用的一个静电因素。药物小分子能够选择性地与d n a 中a ：t 富集区，通过氢键、范德华力等作用，非嵌入性地缚住d n a ，从而阻止d n a 模板复制， 起到了抗病毒的作用。 通常稠合芳环体系都倾向于结合在g - c 富集区【1 3 j ，而对于一些含有庞大取代基的分 子，如毗啶环取代的卟啉分子在与d n a 作用时，吡啶环取代基会尽量旋转，以保持与 母环的共平面，从而形成良好的堆积形状与d n a 碱基嵌合。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基对之间后，有的可以直接抑制d n a 复制与转录的功能；有的则在经过进一步活化 后，使d n a 断裂受损而影响其功能。 通常非稠合的芳环体系能通过一定的旋转后结合在小沟中a 1 富集区【1 1 ，并且在靶 向分子的供体基团与小沟中a 的n 3 或t 韵0 2 这些受体问常常有氢键形成。纺锤菌素 和h o e c h s 0 3 2 5 8 两种经典的小沟结合分子与d n a 切割剂( 如阳离子卧啉) 连接后，可以 得到亲和性及对a t 序列选择性都明显增强的人工核酸酶【1 5 。近年来发展起来的反义 寡聚核菅酸，因其能按照严格的碱基对互补原则，通过h o o g s t e e n 氢键结合在双螺旋 d n a 的大沟中而形成局部的三螺旋结构，因而可精确识别核酸所携带信息的特异性序 列。因此一方面可通过将一些具有特定功能的活性基团缀接于寡聚核苷酸末端，从而得 山东丈学颈士学位论文 到高度选择性的人工核酸酶或药物分子原型；另一方面如已知靶分子的核苷酸序列，有 可能根据反义寡聚核苷酸的碱基序列直接写下抑制物的化学结构，这点十分有利于药物 分子的合成。 1 2 2 共价结合 共价结合包括与亲核试剂的作用及与亲电试剂的反应，与d n a 交联作用等。与非 共价结合作用相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结合的序列特异性识别能力要强得多。 例如d u o c a r m y c i n 及其衍生物，只能在d n a 小沟中对a t 富集区识别，分子中活泼的环 丙烷与小沟内特定碱基序列中a 的n 3 共价结合后导致在该位点脱去嘌岭m 姗。晶体衍 射及其它一些方法也都证实了顺铂中的p t 原子能够与d n a 小沟中同一条链上相邻鸟嘌 呤 d ( g p g ) 】的n 7 共价结合形成链内加成物，并使d n a 双链解旋及产生弯曲，以便于含 有高淌度基因结构的蛋白质的结合。 1 2 3 剪切作用 具有剪切作用的分子不但特异选择结合位点，而且最终能使d n a 断裂。b l m 是 一种典型的d n a 切割化合物，分子结构的特殊性使其能够识别并结合在d n a 中5 g c 3 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致d n a 断链，这种双功能性对于设计 人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物都具有非常重要的指导意义。事实上，已有大量研 究根据这一原理把对d n a 具有剪切功能的分子与能对d n a 序列进行特异性识别的分 子连接起来，以合成序列特异性更高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。 1 3 核酸与其靶向分子相互作用的研究方法 1 3 1 紫外吸收光谱法 核酸分子中的碱基具有光学活性，在2 6 0 n m 处有吸收药物小分子与d n a 碱基 对相互作用后，如果引起吸收强度减小，波长红移，则可认为二者之间为嵌入作用【1 9 】。 因为药物分子与d n a 碱基对可发生兀电子堆积，药物分子的兀空轨道与碱基的氕电 子轨道发生偶合，使能级下降，导致嚣一嚣跃迁能量减少，从而产生红移现象。红 移程度反映出药物嵌入能力的大小。同时，耦合后的1 ct 轨道因部分填充电子，使任一 【跃迁几率减少，产生减色效应，吸收强度降低。减色效应的强弱，也能反映出嵌入 能力的大小，嵌入能力越强，减色效应越大。 山东大擘硕士学位论文 1 3 2 荧光光谱法 荧光光谱法是研究药物分子与核酸相互作用的重要手段，溴化乙锭是常用的探针， 并广泛用于抗癌药物的筛选及小分子与d n a 作用的研究。和k 4 f e ( c n ) 6 为典型荧光 猝灭剂，通过考察其对小分子荧光的猝灭作用可以判断小分子与d n a 之间的作用方 式。与纯水介质相比，当小分子与d n a 属于嵌入作用时，i - 或 f e ( c n ) 6 的猝灭作用 减弱( 2 0 1 ；而当小分子与d n a 属于沟槽作用时，猝灭作用增强【2 这是因为游离的或水 合状态的正电荷配离子很容易被高负电荷的阴离子i - 或【f c n ) 6 】 猝灭，但由于d n a 磷酸骨架带有负电荷而成为多聚阴离子，对i 。或 f e ( c n ) 6 小有强烈的排斥作用，药物 分子嵌入越深，受保护程度越大。 小分子与d n a 作用后荧光偏振的变化情况也是判断小分子是否与d n a 发生嵌入作 用的标准。在偏振光激发下，荧光体所发射的荧光亦是偏振光。小分子在溶剂中旋转速 度较快，故其偏振度较小：当嵌入到核酸中时，转动速度变慢，荧光偏振度就相应增大。 据此可推断药物分子与d n a 的作用模式 2 2 t2 3 1 。文献洲利用荧光偏振方法研究了小分 子与d n a 之间的相互作用，小分子的荧光偏振随着d n a 浓度的增加而增大，由此推断 小分子与d n a 发生了嵌入作用 此外，盐效应、磷酸根效应、d n a 热变性试验等也可以初步判断药物分子与d n a 之间的作用模式 2 s - 2 7 1 1 3 3 圆二色( c d ) 光谱法 圆二色光谱法是利用不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同而进行结构分析的方 法。一般情况下药物分子嵌入到d l q a 上，由于它们的不对称性而导致被诱导的圆二色光 谱出现。l i u 等【2 8 1 通过圆二色光谱发研究多巴胺与d n a 作用时，发现多巴胺仅对d n a 有轻微影响。 1 3 4 黏度法 黏度测定是检测药物分子与d n a 是否以嵌入方式结合的有效方法。小分子与配体 形成的配合物通过嵌入方式与d n a 作用时，d n a 相邻碱基对的距离会变大，以容纳 嵌入配体，导致双螺旋伸长，黏度增加；而以静电作用、沟槽作用结合时，d n a 溶液 的黏度无明显变化。 王桂芬等用黏度法研究了嗪草酮与脱氧核糖核酸的相互作用，结果表明d n a 黏 度随嗪草酮浓度的增大而增大，认为嗪草酮是通过嵌入作用与d n a 结合的。邓洪等 山东大学硕士学位论文 也用黏度测定法研究了钉多吡啶配合物与小牛胸腺d n a 的相互作用。 1 3 5 电化学法 电化学检测法是通过电极表面杂交反应，选择性识别d n a 片段。电化学法研究核 酸与其它分子的相互作用是基于核酸分子存在与否对体系伏安特性的差别，包括由于嵌 入反应引起的体系式量电位的变化和当小分子与核酸分子结合后其扩散系数值大幅度 的下降，从而导致扩散电流的减小等电化学行为的差别。 刘军【3 1 】等采用交流阻抗技术和循环伏安法研究了硫堇在金电极及玻碳电极上与 d n a 分子的相互作用，表明硫堇与d n a 分子之间存在嵌入、静电作用。李启隆等【3 2 l 也采用伏安法、极谱法等探讨了抗癌药物博来霉素与d n a 的反应机制。 1 。3 6 微量热法 微量热法在测定过程中不会干扰生物体系的正常代谢活动，对反应体系的光谱性 质、电学性质、溶剂性质等无任何限制条件，已先后用于一些抗肿瘤药物、生物染料及 金属配合物与d n a 的研究，包括热力学性质、结合位点、键合模式等f 3 3 3 4 1 。 易平贵等【3 习用微量热法研究了【c u ( p h e n ) 2 】2 + 、【c u ( h p y ) 2 】2 + 与小牛胸腺d n a 作 用的热力学性质及结合位点，并分析了键合模型。结果表明，小牛胸腺d n a 是b 型右 手螺旋分子，每隔1 0 个核苷酸形成1 个螺旋结构，其中有两条沟槽一大沟和小沟。而 大沟、小沟对于在遗传上有重要功能的蛋白质识别d n a 双螺旋结构中的特定信息是非 常重要的。以微量热法对二甲亚砜诱导的大鼠肝细胞瘤代谢的体内研究表明，低浓度的 二甲亚砜不会影响细胞周期和凋亡d 叼。 1 3 。7 其它方法 药物分子和d n a 相互作用的研究还可采用：色谱法( i - i p l c 、c e ) ，核磁共振分析 法，质谱法，拉曼光谱法，红外光谱法，x 射线晶体衍射法等。 一般情况下，药物分子与d n a 相互作用的研究需同时采用多种方法，各种方法相 互补充，相互印证，而不是单靠某一种方法。g o o s s e n s 等网采用紫外吸收、荧光、圆二 色、凝胶c e 等方法发现抗肿瘤药溴化苯胺基喹啉衍生物以嵌入方式与d n a 发生作用。 y a n g 等 3 8 】通过黏度法、紫外吸收、c d 谱等阐明了卟啉类衍生物与d n a 的结合方式，通 过光谱法及微量热法测定了与d n a 的结合强度。 总之。如果要确定药物分子与d n a 相互