（果树学专业论文）枳精氨酸脱羧酶基因ptadc转化烟草提高抗脱水研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发 丧或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均巴在论文中散了明确的说明。并表示了谢意 研究生签名：振彖栖 时间：州年月f 1 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交举位论文的印捌本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全 部或部分内容同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( u p 涉及技术秘密商生秘密或申请专硐等潜在鲁要提交保密的论 文) 在解毫后适用于本授权书 黼始旅京橘撇名：钟翌扛， 签名日期：扣年月| 1 日签名日期：w f 年月1 1 日 注。请将奉农直接装订在学位论文的麾页和目录之闻 d ：j # &。 枳精氨酸脱羧酶基因( p t a d c ) 转化基因烟草提高抗脱水研究- 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩略词表v 1 前言1 1 1 课题的提出1 1 2 基因工程技术改善柑橘的抗逆性。2 1 3 多胺在植物中的研究2 1 3 1 多胺的种类和分布。3 1 3 2 多胺的结构与功能3 1 3 3 多胺对氧自由基的清除4 1 3 4 多胺的合成4 1 3 5 多胺的分解代谢5 1 3 6 多胺与植物生长发育的关系。5 1 3 7 多胺和植物逆境的关系7 1 4 生理生化的影响1 0 1 4 1 活性氧造成的氧化损伤l o 1 4 2 逆境产物m d a 10 1 4 3 逆境产物活性氧1 1 1 4 4 活性氧的清除机制1 1 1 4 5 抗氧化酶1 2 1 4 6 抗氧化物质1 2 1 5 本课题的内容目的及意义1 3 2 材料与方法1 4 1 1 材料1 4 1 1 1 供试基因14 i 1 2 供试植物材料14 1 1 3 主要仪器与试剂1 4 1 1 4 激素和抗生素贮存液的配制1 4 1 1 5 主要试剂的配制。15 2 1 方法1 5 2 1 1 烟草无菌苗的培养1 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 1 2 烟草的遗传转化15 2 1 3 转基因烟草的鉴定1 7 2 1 4 引物设计l7 2 1 5 离体叶片相对失水率的测定1 8 2 1 6 相对电导率的测定1 8 2 1 7 叶片叶面温度的测定1 8 2 1 8 超氧阴离子氯化硝基四氮唑( n b t ) 染色1 8 2 1 93 3 二氨基联苯胺( d a n ) 染色19 2 1 1 0 多胺的高效液相色谱( h p l c ) 测定1 9 2 1 1 1 基因表达分析。2 0 3 结果与分析2 3 3 1 转基因烟草的鉴定2 3 3 2p t a d c 基因的超表达2 3 3 3 转基因烟草中腐胺的含量2 4 3 4 烟草叶片的相对失水率2 4 3 5 离体苗相对电导率2 5 3 6 离体苗叶片相对温度2 6 3 7 烟草离体苗的失水表型。2 6 3 8 转基因烟草离体苗n b t 和d a n 染色2 6 3 9 相关逆境基因的表达2 7 z i 讨论：1 9 4 1 转p t a d c 基因对烟草离体苗的电导率和失水率的影响2 9 4 2 转p t a d c 烟草对过氧化氢和超氧阴离子的影响3 0 4 3 转p t a d c 烟草中腐胺含量对逆境的作用3 0 5 结j 沦3 2 参考文献3 3 致谢。4 3 枳精氨酸脱羧酶基因( p l 4 d c ) 转化基因烟草提高抗脱水研究- 摘要 多胺是生物体在代谢过程中产生的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱，广 泛存在于植物体内，在逆境胁迫中对植物具有保护作用。多胺主要有腐胺、精胺和 亚精胺三种类型，其中精氨酸脱羧酶( a d c ) 是多胺合成中的关键酶之一，催化精 氨酸脱羧生成鲱精胺( a g m ) ，然后再由鲱精胺水解生成生成腐胺。本试验采用根癌 农杆菌介导的叶盘法将枳精氨酸脱羧酶基因( e t a d c ) 转化到烟草中，并对t 2 代转 基因材料的抗性进行分析，主要结果有： 1 p c r 检测及半定量分析：p t a d c 基因表达载体通过根癌农杆菌介导的叶盘法 转化烟草，共获得1 2 棵生根的抗性苗，以转基因烟草的基因组d n a 为模板，进行p c r 检测，以含目的基因的菌液质粒为阳性对照，以a d c r + 3 5 s f 和n p t i i 弓i 物均能扩增 出特异的d n a 片段，而野生型烟草植株未扩增出片段，说f i ) p b l l 2 1 - p t a d c 基因片段 已经转入烟草基因组中；取其中的2 株转基因株系进行半定量r t p c r 分析，结果表 明p t a d c 基因在烟草中表达。 2 转基因烟草中腐胺含量测定：取2 个超表达p t a d c 的t 2 株系进行脱水处理， 然后进行腐胺的测定，结果表明脱水处理前和处理后，转基因烟草中腐胺含量都比 对照的含量高。 3 转基因烟草离体苗的相对失水率：取播种6 0 d 的转基因和对照离体苗叶片， 在室温下进行脱水处理，然后测定相对失水率。结果表明：脱水处理之后对照的相 对失水率比转基因高，随着脱水时间的延长，对照叶片较转基因叶片严重萎蔫。 4 离体苗的相对电导率和叶片的相对温度：测定离体叶片在脱水处理前后的电 导率和叶片相对温度，结果显示，在未处理时转基因材料和对照之间相对电导率的 差异很小，而处理之后转基因材料的电导率低于对照，转基因叶片处理前后的相对 温度都比对照的高。 5 离体苗的染色：叶片在脱水处理时会产生超氧阴离子和过氧化氢，对转基因 材料叶片和对照叶片进行d a b 和n b t 染色观察。结果表明：脱水处理前，转基因叶 片和对照叶片之间差异很小；而处理之后，对照的颜色比转基因深，暗示了叶片中 产生的过氧化氢和超氧阴离子的含量比转基因中的多。 6 基因表达分析：提取转基因和野生型株系组织r n a ，反转录为e d n a ，进行 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 半定量r t - p c r 分析，结果表明，在处理前后，a p x , d r e b 、s a m d c = 个基因表达 量比对照增强。 关键词：p t a d c ；多胺；逆境；脱水；转基因；烟草；活性氧 枳精氨酸脱羧酶基因( p t a d c ) 转化基因烟草提高抗脱水研究- a b s t r a c t p o l y a m i n e sa r eu b i q u i t o u sp o l y c a t i o n i ca l i p h a t i cc o m p o u n d sw i t hb i o l o g i c a l a c t i v i t ya n d l o wm o l e c u l a rw e i g h tf o r m e di nt h em e t a b o l i cp r o c e s s ，w h i c hp l a ya p r o t e c t i v er o l ea g a i n s ts t r e s si np l a n t a r g i n i n ed e c a r b o x y l a s e ( a d c ) i so n eo ft h ek e y e n z y m e si nt h es y n t h e s i so fp o l y a m i n e s ，c a t a l y z i n ga r g i n i n ed e c a r b o x y l a t i o ni n t oa r g ， t h e na r g h y d r o l y z i n gi n t op u t r e s e i n e i nt h i se x p e r i m e n t ，a r g i n i n ed e c a r b o x y l a s eg e n ef r o mp o n c i t r u st r i f o l i a t a ( p t a d c ) w a s i n t r o d u c e di n t ot o b a c c ov i al e a fd i s kt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d t 2t r a n s g e n i cm a t e r i a l sw e r e t r e a t e df o rs t r e s sr e s i s t a n c ea n a l y s i s t h em a i nr e s u l t sa r e 髂f o l l o w s ： 1 p c rd e t e c t i o na n ds e m i - q u a n t i t a t i v ep c ra n a l y s i s ：12p u t a t i v et r a n s g e n i ct o b a c c o s e e d l i n g sw e r ei d e n t i f i e db yp c r 晰吐lb o t l lp r i m e r so fa d c r + 3 5 s fa n dn p t i i ， f o l l o w e db yt h eo b t a i n i n go ft 2t r a n s g e n i cm a t e r i a l s t w o1 2t r a n s g e n i cl i n e sw e r e u s e df o rr t - p c ra n a l y s i s ，a n dt h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h eg e n ew a se x p r e s s e di n t o b a c c o 2 p u t r e s c i n e 。sc o n t e n td e t e r m i n a t i o n ：t w ot 2t r a n s g e n i cl i n ew e r es e l e c t e df o r d e h y d r a t i o n , a n dt h es t r e s s e dl e a v e sw e r eu s e df o rp u t r e s c i n e sc o n t e n td e t e r m i n a t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a tb o t l lb e f o r ea n da f t e rd e h y d r a t i o n , p u t r e s c i n e sc o n t e n ti n t r a n s g e n i cl e a v e sw a sh i g h e rt h a nt h ec o n t r o l s ； 3 w a t e rl o s sa n a l y s i s ：d e t a c h e di nv i t r ol e a v e so f6 0d a y st r a n s g e n i cs e e d l i n g sa n d c o n t r o l sw e r ep l a c e di nt h er o o mt e m p e r a t u r ef o rd e h y d r a t i o n d u r i n gt h ec o u r s eo f e x p e r i m e n t , d e t a c h e dl e a v e sf r o mt h ec o n t r o l se n d u r e dm o r es e v e r ew i l t e dp h e n o t y p e t h a nt h et r a n s g e n i co n e s ，a n dm o r er e l a t i v ew a t e rl o s s 4 e l e c t r o l y t el e a k a g ea n dl e a fr e l a t i v et e m p e r a t u r ed e t e c t i o n ：d l e c t r o l y t cl e a k a g es h o w e d t h a tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e db e t w e e nc o n t r o la n dt r a n s g e n i cm a t e r i a l s b e f o r ed e h y d r a t i o n , b u ts i g n i f i c a n th i g h e ri nt h ef o r m e ra f t e rd e h y d r a t i o n r e l a t i v e t e m p e r a t u r ew a sh i g h e ri nt h et r a n s g e n i cp l a n t sb o mb e f o r ea n da f t e rd e h y d r a t i o n 5 n b ta n dd a bs t a i n i n g ：t w os t a i n i n ge x p e r i m e n tw e r ep e r f o r m e dt od e t e c tt h e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nt h es t r e s s e dl e a v e s 1 1 1 ec o l o ro ft r a n s g e n i cl e a v e sw e r e s i m i l a r 、i mt h ec o n t r o lo n e sb e f o r ed e h y d r a t i o nb u tl i g h t e ra r e r , s u g g e s t i n gt h a tt h e t r a n s g e n i cl e a v e sh a dl e s sh 2 0 2a n d0 2 。 6 g e n ee x p r e s s i o na n a l y s i s ：r t - p c rd o m e n s t r a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o n so fa p x , d r e b 彳朋d cw e r eh i g h e ri nt h et r a n s g e n i cm a t e r i a l sb o mb e f o r ea n da f t e rd e h y d r a t i o n i i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 k e yw o r d s ：p t a d c , p o l y a m i n e ，t r a n s g e n i ep l a n ld e l a y d r a t i o n , t o b a c c o ，r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s 烈 枳精氨酸脱羧酶基因( 尸纠d o 转化基因烟草提高抗脱水研究- 一 缩略词表 缩写符号 英文中文解释 a d c a r g i n i n ed e c a r b o x y l a s e 精氨酸脱羧酶 b a d h b e t a i n ea l d e h y d ed e h y d r o g e n a s甜菜碱醛脱氢酶 c a dc a d a v a r i n e尸胺 c a m v 3 5 sp r o m o t e ro f c a u l i f l o w e rm o s i cv i r u s烟草花叶病毒3 5 s 启动子 c t a b c e t y l t r i m e t h y l a m m o l f l o n i u mb r o m i d e 十六烷基三乙基溴化铵 d a b d i a m i n o b e n z i d i n e 3 , 3 二氨基联苯胺 d - a r gd a r g i n i n e d 精氨酸 d f m o d l a - d i f l u o r o m e h y l o f i n i t h i n e d l 吨二氟甲基鸟氨酸 d r e b d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gf a c t o r 脱水应答元件结合因子 g a g i b b e ：r e l l i n赤霉素 h p l c h i 【g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 k a n k a n a m y c i n 卡那霉素 m d a m a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 m s m u r a s h i g ea n ds k o o g m s 基本培养基 n a a n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d a 萘乙酸 n b tn i t r ob l u et e t r a z o l i u m 氯化硝基四氮唑 m 叮i i n e o m y c i np h o s p h 砷彻s f e m 新霉素磷酸转移酶i i 6 b a 6 - b e n z y ia m i n o p u r i n e 6 苄氨基嘌呤 o d c o m i t h i n ed e c a r b o x y l a s e鸟氨酸脱羧酶 p a o p o l y a m i n eo x i d a s c 多胺氧化酶 p a s p o l y a m i n e s 多胺 p r op r o l i n e 脯氨酸 r t - p c r r e v e r s et r a n s c r i p t a t i v ep c r反转录p c r s a m s - a d e n o s y l m e t h i n e s 腺苷甲硫氨酸 s p ds p e r m i d i n e 亚精胺 s p d s s p e r m i d i n es y n t h a s e 亚精胺合成酶 s p ms p e r m i n e 精胺 s o d s u p e ro x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 v 枳精氨酸脱羧酶基因( e t a d c ) 转化基因烟草提高抗脱水研究 1 前言 1 1 课题的提出 柑橘是世界上重要的农产品之一，也是世界第一大水果，在世界范围内广泛 分布，全球有1 3 5 个国家和地区生产柑橘，并且在全球农产品贸易中占有十分重要 的地位。其贸易量达到6 5 亿美元，仅次于玉米和小麦，成为世界第3 大贸易农产 品，近年来产量增长迅速，有望超过巴西成为世界柑橘第一大生产国( 邓秀新， 2 0 0 5 ，章胜勇等，2 0 0 9 ) 。柑橘在我国分布广泛，栽培柑橘的省( 区、市) 有2 0 多个，但主要集中在湖南、湖北、江西、福建、重庆、广西、广东、浙江和四川这 9 个省市，约占全国产量的9 5 ，并且柑橘的总产量占各种水果总产量的一半，是 有些地区经济的支柱产业之一。 水对农业生产具有重要的意义，许多环境胁迫如干旱、盐分、高温、低温和酸 胁迫等也都会破坏植物的水分代谢，使细胞脱水从而造成缺水。目前我国干旱、半 干旱地区约占国土面积的三分之一。柑橘是一种对水分需求比较多的亚热带果树， 当柑橘长期处于缺水状态下，表现的特征有：叶片萎蔫卷缩、落叶枯枝、果小和果 实失水变软，轻度的干旱可引起树势衰退，产量下降，品质变劣；重度干旱则导致 绝收甚至柑橘树的死亡，因而水分对于柑橘品质和产量具有重要的影响。不同时期 的干旱对柑橘产生不同的影响，按照干旱出现的时期可分为春旱、夏旱、秋旱和冬 旱；其中春早和冬旱对柑橘树体状态及产量有很大的影响，其中春旱发生时正是柑 橘开花着果期，如果此时出现缺水会严重危害开花着果，从而影响整年的柑橘产量； 冬旱则可使柑橘冻害加重，导致第二年结果数量显著减少。且在柑橘不同生育期， 产生的影响也不同。在柑橘幼果期遭遇干旱，此时幼果的需水量很大，但是叶片蒸 腾失水增强，其竞争能力大于幼果，这样会促进离层的形成而发生大量落果；若在 果实膨大期发生干旱，会阻碍果实增长，严重时甚至造成果实停止生长、发生萎蔫 或落果，小果显著增多，影响产量和品质；果实成熟期需水量比较大，此时若发生 干旱，影响叶片光合作用和正常代谢，光合产物的不足会抑制果实膨大而导致减产， 影响产量和品质。 解决水分胁迫对柑橘的危害从而减少损失，常规的方法是利用栽培技术对柑橘 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 缺水进行防护、选择合适砧木和研究失水的一些生理特征。随着分子生物学的发展， 利用基因工程的方法提高柑橘的抗性目前已有成功报道：如将p 5 田基因转化枳橙以 提高其抗旱能力，转基因的枳橙在水分逆境下合成大量的脯氨酸，从而表现出更高 的渗透调节能力和光合效率( m o l i n a r ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ；将h l 4 2 基因转入枳橙用于提高 其耐盐性。 1 2 基因工程技术改善柑橘的抗逆性 随着分子生物学的发展，利用基因工程技术进行育种已成为一个趋势。它可以 根据生产的需求，选择性地向植物中导入特定的外源基因片段。这种技术具有可控 性强、针对性强、所需时间短和成效快等特点。对于多年生果树来说，能提高其抗 逆性和改善品质。转基因技术对于果树来说具有一定的优势：第一，可以定向改良 遗传性状，有目的的插入一个或者多个外源基因( 抗病性，改善品质基因) ；第二， 从分子水平上的基因重组来打破物种之间的杂交障碍，可以实现各个物种之间的优 势基因的利用；第三，果树一般都是多年生的植物，随着生物技术的发展，利用基 因工程技术可以大大地缩短育种年限。自从世界第一例转基因植物一转基因烟草问 世以来( h e r r a e r ，1 9 8 3 ) ，转基因技术就得到了广泛应用。人们利用转基因技术已获 得许多新品种，在生产中广泛应用，带来了巨大的经济效益。迄今为止已报道有2 0 0 多种转基因植物，这些转基因植株有的提高了抗性、改善了营养品质，有的提高了 产量，有的甚至改变了植物的代谢途径( 生产特定的油和药物成分) 。涉及到的植 物种类之多，粮食作物( t g 稻、小麦等) 、经济作物( 棉花、大豆、油菜、亚麻和向 日葵等) 、蔬菜( 番茄、黄瓜、生菜和芹菜等) 、瓜果( 苹果、核桃、和香蕉等) 、花 卉( 矮牵牛、菊花、香石竹和伽兰等) 及泡桐、杨树等造林树种( 王关林等，2 0 0 3 ) 。 1 3 多胺在植物中的研究 植物生长发育中遭受生物胁迫和非生物胁迫，其中生物逆境如烟草的花叶病毒 入侵和柑橘的溃疡病等，非生物胁迫主要有：高温胁迫、低温胁迫、干旱胁迫、水 分胁迫、酸胁迫、渗透胁迫和重金属胁迫等。多胺是生物体代谢过程中产生的具有 生物活性的脂肪族含氮碱，众多研究表明，多胺参与生物胁迫和非生物胁迫的防御， 并且发现生物胁迫和非生物胁迫影响到细胞内多胺的含量( m a l m b e r ge ta 1 ，1 9 9 8 ； s e r a f i n ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 2 枳精氨酸脱羧酶摹因( p t a d c ) 转化基因烟草提高抗脱水研究 1 3 1 多胺的种类和分布 多胺是生物体代谢过程中产生的具有生物活性的带正电荷的脂肪族含氮碱，普 遍存在于动物、植物、微生物及真菌体内，是一种重要的次生代谢产物。常见的胺 类根据氨基酸的数目分为：二胺、三胺和四胺，其中二胺类物质主要有：腐胺 ( p u t r e s c i n e 简称p u t ) 、尸胺( c a d a v a r i n e 简称c a d ) ；三胺类有亚精胺( s p e r m i d i n e 简 称s p d ) ；四胺类有，精胺( s p e r m i n e 简称s p m ) 。广义上的多胺是指腐胺、尸胺、 亚精胺和精胺。在高等植物中按多胺的结合形式分为三种：游离态多胺、束缚态多 胺及结合态多胺( w a i t e r s ，2 0 0 3 ) 。结合态的腐胺和其他多胺占总多胺含量的9 0 ， 但是不同的物种多胺的种类也有所不同： 表1 - 1 植物中多胺的种类 t a b l e1 - 1t h ep o l y a m i n e si np l a n t s 1 3 2 多胺的结构与功能 多胺在生理p h 条件下解离，以多聚阳离子的形式存在，主要通过离子键、氢键 和疏水作用等共价键形式与核酸、磷脂和蛋白质等基团相互作用，调节其生理功能。 多胺能和一些带负电荷的分子结合如：d n a ( b a s ue ta 1 ，1 9 9 0 ) 、蛋白质( a p e l b a u me t a 1 ，1 9 8 8 ) 和多糖( o r a c ie ta l ，1 9 8 7 ) 。多胺能稳定核酸分子的结构及促进d n a 凝聚体 的形成。多胺能中和双螺旋结构链上的负电荷，使d n a 凝聚的主要驱动力的静电能 减少。此外，在d n a 的双螺旋结构中，多胺的次丁基部分可以跨过核酸的螺旋浅沟， 把相对的链连接在一起。而丙基部分能把链上相邻的磷酸基团连接起来，还可以中 和核酸中磷酸基团的负电荷，提高水解酶的稳定性，增强核酸的抗变性能力( l i q u o f i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。多胺以多聚阳离子的形式存在，能和膜结构上的磷酸集团结合，提高 膜的稳定性和减轻脂膜过氧化反应造成的损伤( l e s t e r , 2 0 0 0 ) ，同时多胺能和膜上 带负电的磷脂结合中和膜上负电荷，从而导致膜电势降低，来调节膜结合酶的稳定 性，影响到与能量偶联的离子渗透能力以及被动运输。 1 3 3 多胺对氧自由基的清除 植物在正常和逆境胁迫时，能产生活性氧，在正常情况下，活性氧的产生和清 除处于动态平衡状态。但是当植物受到胁迫时，随着胁迫时间的延长和胁迫程度的 加重这种平衡被破坏，活性清除系统的功能逐渐降低，当活性氧积累到一定程度时， 最终使细胞膜膜质过氧化反应并发生自由基链式反应，形成丙二醛( m d a ) ，膜功 能受到伤害，使细胞膜流动性下降，导致植物的生长受到损害( 孙存普等，1 9 9 9 ) 。 多胺能直接和间接清除自由基( b o r se la 1 ，1 9 8 9 ) ，作用大小取决于多胺的氨基 化程度，三胺、四胺的清除自由基的能力大于二胺( d u m b o r f f e ta 1 ，1 9 9 1 ) 。多胺是 多聚阳离子，而且是h 十的载体，它可以部分代替超氧化物歧化酶( s o d ) 的作用， 通过歧化反应将超氧阴离子氧化为过氧化氢达到清除自由基的目的。多胺还能提高 s o d 、p o d 和c a t 等抗氧化酶清除自由基的活性( k u b i ，2 0 0 1 ) ，增强细胞自身的 抗氧化能力( 张木清等，1 9 9 6 ) 。 1 3 4 多胺的合成 在多胺的合成代谢中，腐胺是多胺合成代谢的核心产物，它是由精氨酸通过 两条不同途径形成的，即：一条途径是精氨酸脱羧酶( a d c ) 催化精氨酸脱羧，生 成鲱精胺( a g m ) ，然后再由鲱精胺水解生成腐胺；另一条途径是由精氨酸先脱去一 分子脲生成鸟氨酸，再由鸟氨酸脱羧酶( o d c ) 催化鸟氨酸脱羧，生成腐胺。在动物 和真菌中主要是o d c 途径，植物中往往这两种途径都存在。腐胺再经过亚精胺合成 酶( s p d s ) 和精胺合成酶( s p m s ) 的作用加入氨丙基残基生成亚精胺 ( s p e r m i d i n e ，s p d ) 和精胺( s p e r m i n e ，s p m ) ，氨丙基残基主要于孓腺苷甲硫氨酸在孓 腺苷甲硫氨酸脱羧酶( s a m d c ) 催化下脱羧提供氨丙基( p e g g ，1 9 8 6 ，b o u c h e r e a ue t a 1 1 9 9 9 ) 。 植物中主要存在a d c 和o d c 两条途径，这两条途径到底是那种合成途径合成 为主还是同时存在，主要和取决于a d c 基因和o d c 基因在植物中的定位。抗体实 4 枳槽氨酸脱羧酶基因( p t a d c ) 转化基因烟草提高抗脱水研究 验揭示燕麦的a d c 基因定位于叶绿体内囊膜上( b o r r e l le ta 1 ，1 9 9 5 ) ，而o d c 定位 于细胞核中( s l o c u m ，1 9 9 1 ) 。在不同植物和生理条件下，a d c 基因和o d c 基因有 特异的表达( b o r r e l l ，1 9 9 5 ) 。赵福庚等( 1 9 9 7 ) 在研究花生的幼苗内多胺的合成代谢 时，发现a d c 基因起主要作用，说明a d c 主要参与细胞的生长。汪耀富等( 2 0 0 5 ) 用p e g 6 0 0 0 为胁迫剂处理烤烟，在渗透胁迫下o d c 的活性没有明显变化，而叶片 中p u t 的含量和a d c 的活性呈显著相关同时和根中的p u t 变化相一致，说明了烟草 在逆境胁迫下，叶片中p u t 合成主要由精氨酸在a d c 基因的作用下直接脱羧而形成 的。p a s c h a l i d i s ( 2 0 0 5 ) 研究发现，烟草老的的地上维管束组织中的p u t 合成主要由 a d c 基因负责，而地下部分则主要由催化o m 直接生成。因此认为两类主要酶类的 作用为：o d c 存在于分裂活跃的细胞中，而a d c 则参与细胞的伸长、胚胎与器官 分化和环境胁迫反应等生理过程( t a s s o n ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 1 3 5 多胺的分解代谢 生物体内多胺的含量除受多胺的生物合成和运输调节之外，多胺在生物体内的 分解也能直接影响到多胺的含量。生物体内的多胺的分解主要是由两种酶参与的： 一是分子中含c u 2 + ，以磷酸吡哆醛为辅基的二胺氧化酶( d i a m i n eo x i d a s e ，d a o ) ，另 一种是含黄素蛋白的多胺氧化酶( p o l y a m i n eo x i d a s e ，p a o ) 。p u t 在d a o 催化下氧 化脱氨生成过氧化氢、氨和4 氨基丁醛，4 氨基丁醛再环化形成吡咯啉；而p a o 作 用于s p d 和s p m 生成4 氨基丁醛、氨和过氧化氢，还可以在d a o 的催化下脱氨，生成 氨、过氧化氢、氨基丁醛和氨基并醛，氨基醛在经过反应生成l 一( 3 ) 丙氨基吡咯啉 和成丫氨基丁酸( 丫- a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) ( 苏国兴和刘友良，2 0 0 5 ) 1 3 6 多胺与植物生长发育的关系 1 3 6 1 多胺对植物生长发育的影响 多胺在植物的整个生长周期中都起着很重要的作用，包括种子萌发、细胞分裂、 花发育、果实发育、植物衰老和死亡。在植物种子的萌发中，多胺的水平、其合成 酶和降解酶的活性在这个时期都会发生不同的变化，也因物种不同而有所差异。在 种子萌发的早期多胺含量都会增加，但不同的物种中多胺诱发机制不同，所以在不 同部位增加的多胺种类也不同。s c o c c i a n t i 等( 1 9 9 0 ) 研究表明，在大豆的萌发过程 中发现p u t 水平从基部到茎间增加，在大豆萌发早期，子叶中主要是s p d ，s p m 次之， 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 c a d 含量微乎其微，但在下胚轴和根中则主要是c a d ，且其含量迅速增加，所以说c a d 对大豆萌发生根过程可能有重要作用，例如大麦用多胺浸种可以显著增加其发芽力 ( s u ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。z e i d ( 2 0 0 4 ) 报道，在正常的n a c i 胁迫下，外源施用p u t ( 0 0 1 r e t o o l l ) ，能提高大豆的发芽率，可能原因是腐胺能激活淀粉酶和蛋白酶的活性。 但是多胺的浓度过大则抑制发芽，外源s p d 处理盐胁迫下辣椒种子，在低浓度情况下 ( 0 0 1 1 0m m o v l ) ，能促进辣椒种子的萌发，高浓度( 如1 0m m o l l ) 下抑制辣椒的种 子的萌发和生长( 汪志伟，2 0 0 9 ) 。 高等植物花芽分化与多胺关系密切，在植物的花芽分化阶段，多胺和其前提物 质精氨酸水平会发生不同的变化，外源单独和混合喷施s p d 、s p m 和胁能促进花芽 的发育，增加花芽的数目( 徐继忠等，1 9 9 8 ：徐继忠等，2 0 0 1 ) 。王晓玲等( 2 0 0 5 ) 研 究发现，对花芽不易分化的红富士苹果外源喷施s p d ，能提高红富士苹果叶片内源 s p d 、s p m 、p u t 的含量，而对花芽易分化的新红星苹果喷施s p d ，但是叶片内源s p d 、 s p m 、p u t 的含量变化不大，可能与叶片的吸收有关或者内源多胺含量多。金雅琴等 ( 2 0 0 7 ) 研究石蒜花期前后鳞茎内源多胺含量时发现，整个发育过程中p u t 的含量最 高，变幅较大，而s p d 含量最少，变幅较小，表明p u t 和s p d 与营养生长关系密切。 w o l f b o r s ( 1 9 8 9 ) 也报道用外源s p d 喷施烟草能提高内源p u t 的含量。而内源多胺 含量的增加有利于花芽的分化。 1 3 6 2 多胺与植物的衰老 多胺能延缓衰老的作用在植物中普遍存在，已经发现能延缓许多双子叶和单子 叶植物的衰老如：豌豆、菜豆、芜著、烟草、大麦、小麦、水稻等离体叶片衰老。 当这些离体叶片衰老时，水解酶和蛋白酶活性快速增加，叶绿素含量逐渐下降，但 是外源多胺可以抑制上述过程( 段辉国等，1 9 9 9 ) ，a d c 活性及各种多胺含量均下降 ( k a u r s a w h n e y ，1 9 8 2 ) ；t i b u r c i o 等( 1 9 9 4 ) 通过用多胺氧化酶抑制剂处理燕麦，结 果发现内源s p d 和s p m 含量与燕麦叶片及叶肉原生质体衰老被延缓的程度呈显著的 正相关。张木清( 1 9 9 6 ) 通过对甘蔗叶片衰老情况的研究，发现在蛋白质降解之前 内源多胺含量突然下降。研究表明，多胺抑制植物的衰老作用的机理是，多胺能稳 定细胞膜的结果和抑制乙烯的形成，防止叶绿体的囊体膜的多肽丧失，抑制叶绿素 降解蛋白质的形成，从而保持叶绿体类囊体膜结构的完整性，阻止叶绿素降解，起 到稳定类囊体膜的功能( b o r r e l le la 1 ，1 9 9 7 ) 。乙烯能加速植物的成熟和衰老，乙烯的 6 枳精氨酸脱羧酶基因( 删d o 转化基因烟草提高抗脱水研究 合成和多胺的合成会竞争同一底物s a m 。p u t 和s p m 能抑制s a m 转变为1 一氨基环丙 烷梭酸( a c c ) ，a c c 是产生乙烯的前体物质。而且多胺能代替部分酶的的活性的活 性，清除一些自由基来延迟衰老。 1 3 7 多胺和植物逆境的关系 1 3 7 1 多胺与酸胁迫 李如铁等( 1 9 9 5 ) 利用人工模拟酸雨( p h 为3 o ) 处理植物，测定刺槐、欧洲桤 木、桂花、喜树、樟树、桑树、杨树、日本晚樱和桃叶珊瑚等九种观赏树木中的多 胺含量，发现酸雨胁迫处理下上述树种叶片内腐胺酸含量增加迅速，含量比对照提 高数倍，通过腐氨酸含量增加来提高对酸的抗性。谢寅峰等( 1 9 9 9 ) 通过不同强度的 酸( p h3 6 ) 胁迫处理刺槐、马褂木、二球悬铃木和栀子花四种观赏树木的子叶，发 现酸胁迫下子叶的内源p u t 含量随着胁迫强度的增加而呈现倍数增加，而s p d 和s p m 的含量变化很小，当施用精氨酸脱羧酶的竞争抑制剂( d - a r g ) 后，酸胁迫处理抑制 了子叶内源p u t 的合成，而s p d 和s p m 的含量略有增加，同时使用d - a r g 和p u t 则抑制 了d a r g 的抑制作用。当施用外源p u t 后，测定m d a 的含量、s o d 和c a t 的活性。 m d a 的累积量下降，s o d 和c a t 的活性增强。说明在酸胁迫下对植物起保护作用的 是p u t 。而刺槐子叶经酸胁迫同时外施a d c 的抑制剂d a r g 可有效的抑制胁迫下p u t 的积累，暗示了酸胁迫下p u t 的累积主要由p u t 合成酶a d c 的激活引起p u t 的重新合 成，而不是从结合态p u t 释放的，说明a d c 是酸胁迫反应的主导酶。y o u n g 等( 1 9 8 3 ) 用燕麦和豌豆离体叶为材料研究酸胁迫对内源多胺含量的影响，研究发现在p h3 1 5 胁迫条件下，内源p u t 含量增加到对照0 h6 ) 的8 倍，而其它多胺则没有变化。s u r e s h 等( 1 9 7 8 ) 以香瓜子叶为材料进行酸胁迫处理，研究发现，在酸雨胁迫条件下，叶 片内的腐胺酸含量也增加，但是诱导腐胺酸大量积累的合成酶是a d c ，而不是o d c 。 邱栋梁等( 2 0 0 7 ) 研究发现，在模拟酸雨胁迫下，龙眼幼果的p u t 和s p d + s p m 的含量 随着酸性强度的上升而上升，在脱落的幼果中的p u t 和s p d + s p m 的含量显著高于正常 的幼果，表明是一种应急反应，并随果实的发育而逐渐下降。 1 3 7 2 多胺与盐胁迫 许多研究证明( 谈建康等，2 0 0 4 ) ，在盐胁迫下，植物体内的多胺浓度会发生 变化，但是不同物种