（微生物学专业论文）脂肪酶产生菌的筛选、酶基因克隆及应用研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 脂肪酶是一种酯键水解酶，它们能够进行非水相催化的特性使其能够用于 生产许多高附加值的、用化学方法难以合成的水不溶性产品，目前在非水介质 中的脂肪酶催化反应已经被成功应用在多肽合成、聚合物合成、药物合成、立 体异构体拆分、精细化工、食品和香料生产及油脂改性等，成为当前生物技术 领域的一个研究热点。 本论文主要从脂肪酶产生菌的筛选、发酵条件优化、诱变育种、脂肪酶基 因的克隆、脂肪酶在有机相中的催化等几方面进行了研究。 本论文首先经过富集、平板初筛及摇瓶复筛试验，筛选到具脂肪酶活的菌 株8 0 余株，其中c 3 酶活较高。c 3 和g 5 固定化脂肪酶能够高效催化转酯反应 生产生物柴油。通过对c 3 和g 5 进行1 8 sr d n a 分析，结合形态观察，初步确 定此两株菌都属于地霉菌属( g e o t r i c h u m ) 。对c 3 胞外粗酶液酶基本性质的研 究表明：c 3 脂肪酶胞外粗酶液作用的最适温度为4 0 c ，最适作用p h 为7 5 ， 在5 0 以内和p h 6 0 8 0 之间有较好的稳定性。随后，对筛选到的c 3 菌株液 体摇瓶产脂肪酶的条件进行了优化。确定其最适产酶条件为：黄豆粉1 5g 蛋 白胨1 0g 硫酸铵0 5g 蔗糖1 5gk h 2 p 0 4o 1gm g s 0 4 7 h 2 0o 0 5g 橄榄油 1m lh 2 01 0 0 m lp h6 5 。然后，用紫外线及e m s 对g 5 进行诱变育种。结 果证明e m s 诱变效果较好。g 5 经e m s 诱变后传代3 次，酶活比出发菌株提高 了1 6 8 6 。 我们根据gg e o t r i c h u m 脂肪酶基因核酸序列的保守区域，利用热不对称交 错p c r ( t a i l p c r ) 技术扩增得到了g 5 脂肪酶基因的全序列，此基因没有内 含子，全长1 6 9 2 b p ，编码5 6 3 个氨基酸，对其进行了生物信息学分析。 最后，对固定化的g 5 脂肪酶在有机相中催化转酯化反应进行了尝试，此 酶可以转化橄榄油、棉籽油、煎炸废油等多种底物生产生物柴油，对橄榄油的 酯化率达到5 4 。在有机相中还利用此g 5 脂肪酶对生物表面活性剂槐糖脂进 行了结构修饰，对修饰后的槐糖化酶脂的抑菌活性进行了研究，实验证明，通 过修饰提高了其对石膏样毛癣菌和红色毛癣菌的抑制作用，对白色念珠菌有一 定抑制作用，对犬小孢子菌的抑制作用改变不大。 关键词：脂肪酶；基因克隆；生物柴油；槐糖脂；抑菌 h i 山东大学硕士学位论文 a bs t r a c t i nt h i s p a p e r , s c r e e n i n g 7o f l i p a s e p r o d u c i n gs t r a i n s ，o p t i m i z a t i o n o f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，e s t e r i f i c a t i o na n dt r a n s e s t e r i f i e a t i o nb yi m m o b i l i z e dl i p a s e w e r ec a r d e do u t t h eg e n eo fi s o l a t e dg 5l i p a s ew a sa l s oc l o n e d ，p r e p a r a t i o no f b i o d i e s e lf r o mo l i v eo i lo rf i i e do i la n ds h o r t c h a i na l c o h o la n ds t r u c t u r a l m o d i f c a t i o no fs o p h o r o l i p i dw e r ei n v e s t i g a t e d f k s t ) m a n yl i p a s e p r o d u c i n gs t r a i n sw e r es c r e e n e d t h r o u g has e r i e so fs t e p s i n c l u d i n ge n r i c h m e n t ，p l a t ei s o l a t i o n , f l a s k f e r m e n t a t i o na n dd e t e c t i o no f t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y t o c a t a l y z e t h e p r o d u c t i o n o fb i o d i e s e l ，t w o l i p a s e p r o d u c i n gs t r a i n sc 3a n dg 5 、械mh i g h e rl i p a s ea c t i v i t yw e r es c r e e n e d t h e t w os t r a i n sw e r eb o mi d e n t i f i e da sg a l a c t o m y c e sg e o t r i c h u ma c c o r d i n gt ot h e18 s r d n aa n dm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n t h ep r o p e r t i e so fc r u d ee n z y m eo ft h i sc 3 l i p a s ew a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp hf o rt h i sl i p a s ew e r e 4 0 ca n dp h7 5 ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h el i p a s es h o w e dh i g hs t a b i l i t yb e l o w5 0 。ca n d i nt h ep hr a n g eo fp h 6 0 - - 8 0 t h e n ，f l a s kf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fc 3l i p a s e w e r eo p t i m i z e da sf o l l o w s ：1 5gs u c r o s e , 1 5gs o y b e a np o w d e r , o 5 9p e p t o n e ， 0 5 9 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，o 1gk h 2 p 0 4 ，o 0 5 9m g s 0 4 7 h 2 0 ，1 0m lo l i v eo i l ，10 0 m l w a t e r ，p h6 5 a f t e r w a r d s ，t h em u t a t i o nb r e e d i n gb ye m s w a sp r o v e dt ob eb e t t e r m e t h o dc o m p a r e dw i n lu l t r a v i o l e tm u t a t i o n g 5g a l a c t o m y c e sg e o t r i c h u ml i p a s e a c t i v i t yw a sp r o m o t e dt o16 8 6 b ye m s m u t a t i o na n ds u c c e s s i v ec u l t i v a t i o nf o r t h r e eg e n e r a t i o n s 。 a c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v a t i v ed o m a i no fn u c l e o t i d es e q u e n c ei ng a l a c t o m y c e s g e o t r i c h u ml i p a s e ，b yu s i n gt h et h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ( t a i l - p c r ) ， g 5l i p a s eg e n e s e q u e n c ei s16 9 2 b pl o n gw i t h o u ti n t r o na n de n c o d e s5 6 3a m i n oa c i d s ， b i o i n f o r m a t i c so fg 5l i p a s ew a sa n a l y z e d f i n a l l y , t h ei m m o b i l i z e de n z y m eg 5l i p a s ew a sa p p l i e di nt h et r a n s e s t e r i f i c a t i o n i nn o n a q u e o u sm e d i at ot r a n s f o r mo l i v eo i l ，c o t t o ns e e do i lo rf li e do i la n d v 山东大学硕士学位论文 s h o r t 。c h a i na l c o h o li n t ob i o d i e s e l b i o s u r f a c t a n ts o p h o r o l i p i dw a sa l s om o d i f i e db y g 5l i p a s ei nn o n a q u e o u sm e d i a , a n dt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sf o rs o m e p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m so fm o d i f i e ds o p h o r o l i p i d sw e r ei n v e s t i g a t e d n er e s u l t ss h o w e d t h a tt h e a n t i f u n g a l a c t i v i t i e so fm o d i f i e d s o p h o r o l i p i d s w e r ee n h a n c e dt o m i c r o s p o r u mg y p s e u ma n dt r i c h o p h y t o nr u b r u m ，w h i l eh a sw e a k e ra c t i v i t yt o m o n i l i aa l b i c a na n dh a sr i oa c t i v i t yt om i c r o s p o r u mc r 口，z 括 k e yw o r d s ：l i p a s e ；c l o n e ；b i o d i e s e l ：s o p h o r o l i p i d s ：a n t i f u n g a l v l 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盘邕篮e t 期：幽星：兰 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：在立交 导师签名：塞丛 日 期：z 里竺：垒：兰 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c 3 1 1 3 ，甘油酯水解酶) ，是一类特殊的酯键水解酶它们能 催化天然底物油脂( 甘油三酯) 水解，产生脂肪酸和甘油，在水解过程中存在中 间产物甘油单酯和甘油二酯。从催化特性看，脂肪酶可催化酯类化合物分解、 合成和酯交换；其催化的反应往往具有位置选择性、对映体选择性和高度立体 异构专一性。脂肪酶的一个重要特征是只能在异相系统( 即油一水界面) 或有机 相中应用，对均匀分散或者水溶性的底物不起作用，所以可以说脂肪酶是一种 异相特异性酶。 许多动植物及微生物都能产生脂肪酶，而微生物脂肪酶因其种类多、来源 广、生产周期短，具有比动植物脂肪酶广的p h 、作用温度范围以及对底物的专 一性类型，又便于进行工业化生产和获得高纯度制剂，所以比动植物脂肪酶在 酶理论研究和实际应用中有着更重要的作用( v a n e t et ，1 9 9 9 ：k c l a u s e n ，2 0 0 0 ； l i n k o , y ，1 9 9 8 ；r d s c h m i d ，1 9 9 8 ；s v e np a n k e ，2 0 0 2 ；r i cs a x e n a ；d e w e yd y ， 2 0 0 0 ；彭立凤，2 0 0 0 ) 。 目前商品化的脂肪酶大多来自微生物，已经广泛地应用在有机合成、洗涤 剂添加剂、食品加工等领域( 彭立风，1 9 9 8 ) 。但是在制药、精细化工、食品和 香料等工业中许多高附加值的产品是水不溶性的。同时，许多有用化合物是用 普通化学合成方法难以或无法合成的。为了生产和纯化这些产品，人们把目光 投向了利用脂肪酶在非水相介质( n o n a q u e o u sm e d i a ) q 口催化生物化学反应的方 法( c h a t t e r j 。et ，1 9 9 8 ；l a n d e re ta 1 1 9 8 4 ；m a u g a r dt ，1 9 9 7 ；高修功，1 9 9 8 ) 。 非水介质中的酶催化反应已经被成功应用到了多肽合成、聚合物合成、药物合 成、立体异构体拆分及油脂改性等领域。脂肪酶在有机相中可催化的反应主要 有：酯合成、酯交换、肽合成、酯聚合、酰化等，见表1 1 。 山东大学硕士学位论文 表1 - 1 脂肪酶在有机相中催化的反应及产物类型 反应类型 酯合成 酯交换 肽合成 酯聚合 酰化 产物及其类型 饱和脂肪酸酯( 化妆品、食品) 不饱和脂肪酸酯( 化妆品) 羊毛脂异丙酯( 化妆品) 可可酯( 食品) 甘油单酯( 医药、食品、化妆品) 光学活性醇( 半导体材料) 青霉素g 前体肽( 医药) 生物活性肽( 医药) 甜味二肽( 食品) 光学活性寡聚酯 寡聚酯 糖酯类固醇酯 1 1 脂肪酶在非水相系统中的催化作用 1 9 8 4 年美国学者k l i b a n o v 在s c i e n c e 上发表了一篇关于脂肪酶在有机介质 中催化条件和特点的综述。他们在仅含微量水的有机介质( m i e r o a q u e o u sm e d i a ) 中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。他明确指出，只要条 件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和 产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组 成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性 ( z a k sa ，1 9 8 4 ) 。这无疑是对酶只能在水溶液中起作用这一传统酶学观念的挑 战。通常把仅含微量水或几乎无水的有机溶剂或无溶剂中进行的酶催化反应理 解为宏观上的非水相催化，而微观上是微水相反应( k l i b a n o v ，1 9 8 6 ；k l i b a n o v ， 1 9 8 9 ；g u p t a ， 1 9 9 1 ) 。 1 1 1 用于非水反应体系的主要非水介质 在非水介质中，由于酶处于一种与水极不相同的环境，不可避免地导致酶 存在状态与酶结构的改变，在水相中建立起来的酶反应动力学及反应机制都不 2 山东大学硕士学位论文 能直接应用于非水介质中。用于酶催化的非水介质主要包括： ( 1 ) 水有机溶剂两相体系 水- 有机溶剂两相体系( b i p h a s i ca q u e o u s o r g a n i cs o l u t i o n ) 是指由水相和非 极性有机溶剂相组成的分相反应体系，酶溶解于水相中，底物和产物溶解于有 机相中。有机相一般为亲脂的溶剂，如烷烃、醚和氯代烷烃等，这样可使酶与 有机溶剂在空间上相分离，以保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶 剂相接触。水有机溶剂两相体系己成功用于强疏水性底物如甾体、脂类和烯烃 类的生物转化。如在两相体系中珊瑚诺卡氏菌( n o c a r d i ac o r a l l i n a ) 生物转化烯烃 产生的环氧化物能够及时转移到有机相中，可使环氧化物对微生物的毒性降到 最低程度( c o l l i n se ta 1 ，1 9 9 2 ) ( 2 ) 水不互溶有机溶剂单相体系 单相有机溶剂体系( m o n o p h a s i co r g a n i cs o l u t i o n ) 是指用水不互溶的有机溶 剂取代所有的溶剂水( 9 8 ) ，形成固相酶分散在有机溶剂中的单相体系。酶 处于这种体系中，其表面必须有残余的结构水，才能保证酶的催化活性。一般 有机溶剂中含有小于2 的微量水。常用的水不互溶性有机溶剂有烷烃类、醚、 芳香族化合物、卤代烃等，它们的l 妒较大。固定化酶在有机溶剂中具有催化 活性是酶的一项重要特性，在过去十多年的研究中，已证明这种体系是可行、 可靠和多用途的( 田桂玲等，1 9 9 8 ) ( 3 ) 水互溶有机溶剂单相体系 单相水有机溶剂体系( m o n o p h a s i ca q u e o u s o r g a n i cs o l u t i o n ) 是指由水和与 水互溶的有机溶剂组成的反应体系，酶、底物、产物均能溶解于该体系中。常 用的有机溶剂有二甲基二甲基亚砜( d m s o ) 、二甲基甲酰胺( d m f ) 、四氢呋 喃( t h f ) 、丙酮和低级醇等。这种反应体系主要是用于亲脂性底物的生物转化， 否则底物在单一水溶液中溶解度很低，反应速度也很慢。 ( 4 ) 反胶束体系 反胶束体系( r e v e r s em i c e l l e ) 是表面活性剂与少量水存在的有机溶剂体系。 表面活性剂分子是由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中， 它们的疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成一 个反相胶束，水分子聚集在反相胶束内核中形成“小水池”，里面容纳了酶分子， 3 山东大学硕士学位论文 这样酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。反相胶束 中的酶催化反应一般可用于辅酶再生、消旋体拆分、肽和氨基酸合成和高分子 材料合成。e g g e r s 等人( 1 9 8 8 ) 运用b n j - a l i g u a t 3 3 6 一环己醇为反胶束体系，建 立了膜反应器中反相胶束酶法合成色氨酸的生产工艺。 ( 5 ) 超临界流体体系 超临界气体( s u p e r c r i t i c a lg a s e s ) 如二氧化碳、氟里昂c f 3 h 、烷烃类( 甲 烷、乙烯、丙烷) 或无机化合物( s f 6 ，n 2 0 ) 等都可以作为酶催化亲脂性底物 的溶剂( n a k a m u r a ，1 9 9 0 ) ，酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳 定。超临界气体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转酯、醇解、水解、羟化 和脱氢等反应都可以在此体系中进行，但研究最多的是水解酶的催化反应。这 种溶剂体系最大的优点是无毒、低粘度、产物易于分离。超临界气体的粘度介 于气体与液体之间，其扩散性比一般溶剂高l 2 个数量级。超临界气体在临界 点附近的温度或压力有一点微小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变 化，因而很容易调控超临界气体中酶催化反应的特性，如反应速度和选择性 ( b e c k m a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。该体系的缺点是需要有能耐受几十个兆帕的高压容器， 并且减压时酶易失活。此外，有些超临界流体如二氧化碳可能会与酶分子表面 的活泼基团发生反应而引起酶活性的丧失。 ( 6 ) 无溶剂体系 无溶剂体系又称固相合成体系。该体系不需加入有机溶剂，而是在熔融状 态下直接以底物作为反应介质，酶直接作用于底物。然而，到目前为止，对于 无溶剂体系中酶促反应的研究还报道较少。在食品、医药等行业，有时对产物 纯度的要求很高，为避免溶剂残留或由溶剂带入有害杂质，可采用无溶剂体系 进行反应。如c h a t t e r j e e 和b h a t a c h a r y y a 利用脂肪酶在无溶剂体系下合成萜烯酯， 保持了其天然风味，产品绝对的绿色，这是在溶剂相中反应所达不到的，而且 无溶剂体系催化节省成本、分离纯化步骤相对简单。 1 1 2 非水介质中脂肪酶的结构和非水相催化的特性 1 非水相中脂肪酶的结构 按照热力学预测，球状蛋白的结构在水溶液中是稳定的，在疏水环境中是 不稳定的。但在有机环境还能表现出催化活性这一事实说明：酶的结构至少是 4 山东大学硕士学位论文 酶的活性部位的结构与水溶液中的结构是相同的，这是研究有机相中酶催化的 最基本问题。 众所周知，酶在水溶液中以一定构象的三级结构存在，这种结构与构象是 酶发挥催化功能所必需的“紧密”( c o m p a c t ) 又有“柔性”( f l e x i b i l i t y ) 的状态( a l a n ， 1 9 8 5 ) 。紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，而溶液水分子与蛋白质分子 的功能基团所形成的氢键使蛋白质分子内的氢键受到一定破坏，蛋白质分子变 得松散，呈一种“开启”( u n l o c k i n g ) 状态。“紧密”和“开启”两种状态处于一种 可变动的平衡中，表现出一定的柔性，所以酶在水溶液中以其紧密的空间结构 和相当大的柔性发挥催化功能。z a k s 认为酶在疏水环境( h 2 0 苗o o 鬣o o 0 2 3 4 2 酶作用的最适p h 4 04 55 05 56 0 t e m p e r a t u r e ( 。c ) 图2 4 酶的最适作用温度 配制从p h 4 1 0 ，间隔为1 0p h 单位的缓冲液，按照酶活力测定方法，测得 c 3 脂肪酶粗酶液在不同的p h 条件下的酶活力单位。从图2 - 5 可以看出，c 3 脂 肪酶的最适作用p h 值在p h7 5 。 山东大学硕士学位论文 参 ； = u 曩 o 芝 _ 三 o 2 o 2 0 0 4 2 3 4 3 酶的热稳定性 56789l o p i t 图2 - 5 c 3 脂肪酶最适作用p h 将此酶在4 0 、5 0 、6 0 水浴中分别保温1 0 0 r a i n ，每隔2 0 m i n 按前述方 法测定酶活力，以不经处理的酶活力为1 0 0 ，其余所得酶活力折算成百分数， 再对保温时间作图，结果见图2 - 6 。可以看出，c 3 脂肪酶在4 0 保温2 0 r a i n ， 没有明显失活。4 0 c 保温1 0 0 m i n 时保留酶活在8 0 左右；5 0 保留酶活5 0 ； 6 0 保温4 0 m i n 时还有6 0 左右的酶活，6 0 m i n 酶活迅速下降到0 。 2 8 o2 04 06 08 01 0 0 t i m e ( m i n ) 图2 6c 3 脂肪酶在不同温度保温的酶活保留情况 o 8 6 4 2 o ， 1 o o o o o 山东大学硕士学位论文 2 4 4 酶的p h 稳定性 取酶液与不同p h 值( p h 6 1 0 ) 的缓冲液以l ：5 的比例混合，在4 c 时处理 4 8 小时，再将酶液调回到最适p h ，按标准酶活测定法测定酶活，以最适反应 p h 下保温所得的酶活力为1 0 0 ，其余折合成其剩余酶活力的百分数。结果表 明c 3 脂肪酶在p h 6 0 - 8 0 之间比较稳定( 图2 7 ) 。 1 0 0 o 9 5 o 9 0 o 8 5 o 8 0 0 7 5 67891 0 p h 图2 7c 3 脂肪酶的p h 稳定性 2 3 5 产脂肪酶菌株g 5 的诱变育种 2 3 5 1 出发菌株选定 经过摇瓶复筛和转酯效果复筛确定g 5 菌株作为进一步实验用菌株。 2 3