（预防兽医学专业论文）结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基相互作用的研究.pdf

结核分枝杆菌螺旋酶a 、b 亚基相互作用的研究 摘要 d n a 拓扑酶广泛存在于生物体细胞核内，参与了细胞内几乎所有的d n a 活动，如d n a 的复制、转录和基因重组、染色质的重组以及其它的细胞生理过 程。d n a 螺旋酶是拓扑异构酶中唯一一种能引入负超螺旋的酶，对细菌的转录、 复制等生理功能是必需的，而人类不存在这种酶，因此螺旋酶是一个成功的抗菌 药物靶标。同时，细菌对喹诺酮类的抗性是由于g y r a ，g y r b 的突变引起的。 d n a 螺旋酶是由a ，b 亚基组成的二源四聚体，单个的a 、b 亚基不具有任何 催化活性，二者必须发生相互作用而重组后，才具有酶催化活性。 目前为止，结核分枝杆菌螺旋酶g y r a 、g y r b 亚基相互作用的研究并不深入， 只知道g y r b 的碳端是与g y r a 产生相互作用的功能结构域。本研究旨在确定结 核分枝杆菌螺旋酶g y r a 和g y r b 亚基产生相互作用的功能结构域，主要结果如 下： 1 将g y r b 从碳端截短，成功构建了一系列碳端不同程度的缺失体，包括 g y r b l - 4 6 2 、g y r b l - 5 6 4 、g y r b l - 6 3 1 、g y r b l - 6 6 3 、g y r b l - 6 9 0 和g y r b ，将这些片段 连入酵母诱饵载体，同时将g y r a 完整基因连入酵母捕获载体，进行酵母双杂交 试验。研究结果表明，g y r b l 5 6 4 、g y r b l 6 3 1 、g y r b l 6 6 3 、g y r b l 6 9 0 、g y r b 蛋白与g y r a 在激活报告基因组氨酸和d 半乳糖苷酶表达中呈阳性反应，即 g y r b l 5 6 4 、g y r b l 6 3 1 、g y r b l 6 6 3 、g y r b l 6 9 0 、g y r b 蛋白与g y r a 存在相互 作用，而g y r b l 4 6 2 与g y r a 没有相互作用，因此，g y r b 与g y r a 相互作用的区 域在g y r b 的第4 6 3 到5 6 4 个氨基酸之间。 2 将g y r b 从氮端截短，成功构建了一系列氮端不同程度的缺失体，包括 g y r b l 0 5 - 7 1 4 、g y r b 2 7 8 7 1 4 、g y r b 3 7 6 7 1 4 和g y r b 4 6 3 - 7 1 4 ，将这些片段连入酵母 诱饵载体，同时将g y r a 完整基因连入酵母捕获载体，进行酵母双杂交试验。研 究结果表明，g y r b l 0 5 7 1 4 、g y r b 2 7 8 7 1 4 、g y r b 3 7 6 7 1 4 、g y r b 4 6 3 7 1 4 蛋白与 g y r a 在激活报告基因组氨酸表达中呈阳性反应，但是在激活报告基因d 半乳糖 苷酶表达中呈阴性反应。因为d 半乳糖苷酶报告基因的筛选比组氨酸报告基因的 筛选更为严谨，推测可能是因为g y r b 的氮端截短造成了g y r b 与g y r a 亚基相 互作用的区域4 6 3 5 6 4 个氨基酸之间蛋白构象的改变，从而使某些重要相互作用 位点被堵塞而使得相互作用减弱，所以在激活报告基因d 半乳糖苷酶表达中呈阴 性反应。 3 因为t o p r i m 结构域包含了g y r b 4 6 3 - 5 6 4 ，所以通过重叠p c r 缺失g y r b 的t o p r i m 结构域，构建g y r b 缺失t o p r i m 结构域的突变体g y r b z 冬t ，然后进行酵 母双杂交试验，试验结果得出g y r b a t 与g y r a 在激活报告基因组氨酸和p 半 华中农业大学硕士学位论文 乳糖苷酶表达中呈阴性反应，表明o y r b 蛋白缺失t o p m 结构域的突变体与c , y r a 没有相互作用，从而验证了前期的试验结论，并且能推断出t o p r i m 结构域是 g y r a 、g y r b 亚基产生相互作用的关键结构域。 4 成功构建了g y r a 、g y r b 、g y r b l 5 6 4 、g y r b l 6 3 1 、g y r b l 6 3 1 、g y r b x t 、 g y r b 4 6 3 7 1 4 的表达载体，进行了蛋白质的诱导表达和纯化，为测定酶活和进行 s p r 验证试验提供了材料基础。 关键词：结核分枝杆菌；螺旋酶；拓扑异构酶；酵母双杂交；t o p f i m ；蛋白质相 互作用 2 结核分枝杆菌螺旋酶a 、b 亚基相互作用的研究 a b s r a c t d n at o p o i s o m e r a s e se x t e n s i v e l ye x i s ti nn u c l e io fe v e r yc e l lt y p ea n da r e i n v o l v e di na l m o s td n aa c t i v i t i e si n c l u d i n gr e p l i c a t i o n , t r a n s c r i p t i o n , r e c o m b i n a t i o n a n do t h e rc e l l u l a rb i o p h y s i l o g i c a lp r o c e s s d n ag y r a s e ，t h eo n l yt o p o i s o m e r a s ea b l e t oi n t r o d u c en e g a t i v es u p e r c o i l si n t od n a ，i se s s e n t i a lf o rb a c t e r i a lt r a n s c r i p t i o na n d r e p l i c a t i o n b e c a u s eo fi t sa b s e n c ei nh u m a n s ，i ti ss u c c e s s f u l l yu l t i l i z e da st h et a r g e t f o ra n t i m i c r o b i a l s m e a n w h i l e ，i t sg e n em u t a t i o n sa r er e s p o n s i b l ef o rs o m ed r u g r e s i s t a n c es u c ha sq u i n o l o n e s 1 1 1 ed n a g y r a s ec o n s i s t so ft w os u b u n i t s ，g y r aa n d g y r b m a tf o r maf u n c t i o n a la 2 8 2t e t r a m e r h o w e v e r ，t h es e p e r a t es u b u n i tg y r ao r g y r bd on o th a v ec a t a l y t i ca c t i v i t y u pt op r e s e n t , t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng y r aa n dg y r bh a sn o tb e e nd e e p l y s t u d i e d ，a l lw ek n o wi st h a tg y r b - c t d ( c - t e r m i n a ld o m a i n so fg y r b ) i si n v o l v e di n t h ei n t e r a c t i o n b e t w e e ng y r aa n dg y r b t h u st h i sr e s e a r c hw a sa i m e dt od e t e r m i n e t h ee x a c tf u n c t i o n a ld o m a i n n l ef i n d i n g sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： f i r s t l y , w ec o n s t r u c t e dd i f f e r e n tc t e r m i n a lt r u n c a t e dg y r b l - 4 6 2 、g y r b l 5 6 4 、 g y r b l 6 31 、g y r b l 6 6 3 、g y r b l 6 9 0 、g y r br e c o m b i n a n tv e c t o r s o fp g a d t 7 m e a n w h i l ew ea l s os u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dg y r ar e c o m b i n a n tv e c t o ro fp g b k t 7 ， a n dt h e ni n v e s t i g a t e dt h ei n t e r a c t i o no fg y r a 、析t 1 1n t e r m i n a lt r u n c a t e dg y r bb y m e a n so fy e a s tt w oh y b r i d n l er e s u l t ss h o w e dt h a ti nt h er e a c t i o no fa c t i v a t i n g t r a n s c r i p t i o no fh i sa n dl a c zr e p o r t e rg e n e s ，g y r b l - 5 6 4 、g y r b l - 6 31 、g y r b l 6 6 3 、 g y r b l - 6 9 0 、g y r bg o tp o s i t i v er e s u l t s ，w h e r e a sg y r b l - 4 6 2g o tn e g a t i v er e s u l t ，v i d e l i c e t ， g y r a h a di n t e r a c t i o n w i t h g y r b l - 5 6 4 、g y r b l 6 3 l 、g y r b l - 6 6 3 、g y r b l - 6 9 0 、g y r b a n dn o t 、矶t hg y r b1 - 4 6 2 t h u sw ec a nc o n c l u d et h a tt h ed o m a i nf r o m4 6 3t o5 6 4 a m i n oa c i d so fg y r bp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h ei n t e r a c t i o no fg y r aw i t hg y r b t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ed o m a i nf r o m4 6 3t o5 6 4a m i n oa c i d so fg y r bd e t e r m i n e d t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng y r aa n dg y r b s e c o n d l y ，w ec o n s t r u c t e dd i f f e r e n tn - t e r m i n a l t r u n c a t e dg y r b10 5 714 、 g y r b 2 7 8 - 7 1 4 、g y r b 3 7 6 7 1 4 、g y r b 4 6 3 7 1 4r e c o m b i n a n tv e c t o r so f p g a d t 7 ，a n dt h e n u s i n gt h et e c h n i q u eo fy e a s tt w oh y b d dt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no fg y r a 、析t 1 1 n t e r m i n a lt r u n c a t e dg y r b 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a ti nt h er e a c t i o no fa c t i v a t i n g t r a n s c r i p t i o no fh i sr e p o r t e rg e n e ，g y r b l 0 5 - 7 1 4 、g y r b 2 7 8 - 7 1 4 、g y r b 3 7 6 7 1 4 、 g y r b 4 6 3 - 7 14g o tp o s i t i v er e s u l t s ，b u ti nt h er e a c t i o no fa c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o no f l a c zr e p o r t e rg e n e ，a l lm u t a n t sy i e l d e d n e g a t i v er e s u l tp r o b a b l yb e c a u s el a c z 3 华中农业大学硕士学位论文 r e p o r t e rg e n es c r e e nw a sm o r es t r i n g e n tt h a nh i sr e p o r t e rg e n e t h e r e f o r e ，w e p r e s u m e dt h a tt h en - t e r m i n a lm m c a t i o no fg y r bh a dac o n s i d e r a b l ee f f e c to nt h e i n t e r a c t i o no fg y r b 、析t 1 1g y r aa n di n d u c e dc o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo fd o m a i nf r o m 4 6 3t o5 6 4a m i n oa c i d so fg y r bb yb l o c k i n gt h ea c t i v es i t e so fi n t e r a c t i o n t h i r d l y , w ec o n s t r u c t e dt o p r i md e f i c i e n tg y r br e c o m b i n a n tv e c t o r so fp g a d t 7 b yo v e r l a pp c ra n dt h e nu s e dt h et e c h n i q u eo fy e a s tt w oh y b r i db e c a u s et h et o p r i m d o m a i nc o n t a i n si ng y r bc o n t a i n e da m i n oa c i dr a n g eb e t w e e n4 6 3a n d5 6 4 w eg o t p o s i t i v er e s u l t si n 也er e a c t i o no fa c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o no fb o t hh i sa n dl a c z r e p o r t e rg e n e ss h o w nb yt h er e s u l tt h a tt o p r i md o m a i nd e f i c i e n to y r bh a dn o i n t e r a c t i o nw i t hg y r aa n dt h u sc o n f i r m i n gt h ea b o v ec o n c l u s i o n f o u r t h l y , w ec o n s t r u c e de x p r e s s i o nv e c t o r so f g y r a 、g y r b l - 5 6 4 、g y r b l - 6 3 1 、 g y r bat 、g y r b 4 6 3 - 7 14 、g y r ba n dp u r i f i e dt h e s ep r o t e i n s t h e s ep r o v i d e d e x p e r i m e n tm a t e r i a l s f o rf u r t h e rt e s to fg y r a s ea c t i v i t yw i t hs u r f a c ep l a s m o n r e s o n a l e e k e yw o r d s ：m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s 括；t o p o i s o m e r a s e ；g y r a s e ；y e a s tt w oh y b r i d ； t o p r i m ；p r o t e i ni n t e r a c t i o n 4 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 药 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究2 r _ 作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：高鹰 时间：如1 午月，弓日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：南寿 导师签名： 衍毳叫 签名日期：e 。o f 年月乃日 签名日期：钐9 年月i 弓 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 结核分枝杆菌螺旋酶a 、b 亚基相互作用的研究 1 文献综述 1 1 我国结核病现状 结核病是慢性传染性疾病。目前，全球已有2 0 亿人感染结核菌，活动性结 核患者数达1 5 0 0 万，每年新发结核患者达8 0 0 1 0 0 0 万，有1 8 0 万人因结核病死 亡。1 9 9 3 年世界卫生组织( w h o ) 宣布“全球结核病处于紧急状态 ，将结核 病列为重点控制的传染病之一。1 9 9 8 年，w h o 再次指出“遏制结核病行动刻不 容缓 。 据w h 0 2 0 0 8 年全球结核病控制报告估计，2 0 0 6 年我国结核病发病人数为 1 3 1 万，占全球的1 4 3 ，位居全球第二位，是全球2 2 个结核病高负担国家之一。 2 0 0 0 年全国结核病流行病学抽样调查结果显示，我国结核病疫情特点是：感染 人数多，全国5 5 亿人口已感染结核菌，明显高于全球平均感染水平；患者数多， 全国有活动性肺结核患者约4 5 0 万人，其中传染性肺结核患者约1 5 0 万人；死亡 人数多，全国约有1 3 万人死于结核病；农村患者多，全国约8 0 结核患者在农 村，而且主要集中在中西部地区；耐药患者多，特别是耐多药和严重耐多药患者。 在我国传染病疫情网络报告中，肺结核报告发病和报告死亡数位居甲乙类传 染病前列。四分之三的肺结核患者为最具有劳动能力的青壮年。结核病仍是制约 农村地区特别是贫困地区经济和社会发展的重大疾病之一。同时，我国结核病防 治工作还面临流动人口结核病、耐多药肺结核和结核菌艾滋病病毒双重感染等 新的挑战。虽然我国结核病控制已经取得了举世瞩目的成效，实现了全球结核病 控制阶段性目标，但要如其实现规划终期目标，以及我国政府承诺的联合国 千年发展目标，仍然面临许多困难和障碍( 陈维松，2 0 0 9 ) 。 耐药结核病己成为全球结核病急骤上升的四大原因之一，特别是耐多药结核 病的发生对结核病控制规划的实施构成严重的威胁( r a t t a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。结核病 仍将是下一世纪严重危及人类健康的疾病，移民、h i v 感染和耐药是2 1 世纪全 球结核病控制面临的三大难题( r a v i g l i o n e ，2 0 0 3 ；c u r d ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。2 1 世纪， 科学技术的发展将为结核病控制带来新的前景，结核病控制将继续受分子生物学 发展之惠，在结核病的分子发病机制、分子生物学诊断、易感个体的基因治疗、 菌苗研制和新型抗结核药物、耐药的分子机制等诸多方面都将得益于分子生物学 的发展。 5 华中农业大学硕士学位论文 1 2d n a 螺旋酶在结核病防治中的重要作用 螺旋酶除了上述的一些基本的生物学活性外，也是喹诺酮和香豆素家族等抗 菌药物的作用靶标( m a x w e l l 八1 9 9 7 ) 。喹诺酮家族中的氟喹诺酮类，如环丙氟 哌酸，氟哌酸，是通过干扰g y r a 与d n a 亚基断裂重连的中间复合物来抑制螺旋 酶的( s n y d e ra n dd r l i c a , 1 9 7 9 ) 。而香豆素家族中的新生霉素，香豆霉素是通过 作为a t p 的竞争性抑制剂结合c , y r b , x 基来抑制螺旋酶的( r e e c ea n dm a x w e l l ， 1 9 9 1 ；w a n g ，1 9 9 6 ) 。很多研究表明细菌对香豆素的抗性是由于g y r b 亚基的突变产 生的( m a x w e l l ，1 9 9 3 ；w a n g ，1 9 9 6 ) 。细菌对喹诺酮类的抗性是由于g y r a ，g y r b 的突变引起的( s r e e d h a r a ne ta 1 1 9 9 0 ) 。多耐药性菌株的出现多是因为喹诺酮和 新生霉素各自作用的靶标发生基因突变，导致氨基酸的改变，因而使已有的药物 无法完全防控结核病，在一定程度上导致了结核病的重新暴发。 1 3d n a 拓扑异构酶研究进展 d n a 拓扑酶广泛存在于生物体细胞核内，能调节核酸空间结构动态变化， 是控制核酸生理功能的关键酶。d n a 拓扑异构酶是d n a 世界中的魔术师，能使 一d n a 单链通过另一瞬时切割的d n a 单链或者一d n a 双链通过另一瞬时切割 的d n a 双链，能解决d n a 在复制、转录、以及其他细胞生命活动中所有的拓 扑结构问题( w a n g , 2 0 0 2 ) 。因此，在拓扑异构酶切割d n a 时如果有复合物进行 阻断，那么细胞就会产生毒性损伤，这些复合物有的已经被研发成抗菌剂或抗癌 药物用于现在的疾病治疗中( g r a i l l ee ta 1 ，2 0 0 8 ) 。美国哈佛大学的j a m e scw a n g 在1 9 7 1 年从大肠杆菌细胞提取物中分离出一种可特异松弛负超螺旋d n a 链的 酶，之后在老鼠细胞提取物中发现有可同时松弛负超螺旋和正超螺旋d n a 链的 活性，还发现在大肠杆菌中有一种能依赖于a t p 提供能量从而将松弛d n a 转化 为负超螺旋d n a 的活性，这些酶最后分别被称为大肠杆菌d n a 拓扑异构酶i 、 老鼠d n a 拓扑异构酶i 和大肠杆菌螺旋酶。最近发现认识的，是1 9 9 7 年基因测 序鉴定的古生菌拓扑异构酶( t o p ov i ) 。随着不断研究以及研究的深入，发现细 菌螺旋酶成为抗生素和毒素的靶标，真核拓扑异构酶i 、i i 为很多抗癌药物的靶 标，对拓扑异构酶的研究也延伸到药理学和临床医学领域。近些年来，以d n a 拓扑异构酶为靶分子设计各类抑制剂，作为抗癌药物的研究已经成为肿瘤化疗的 新热点。 6 结核分枝杆菌螺旋酶a 、b 亚基相互作用的研究 1 - 3 1d n a 拓扑异构酶的分类 d n a 拓扑异构酶分为两大类：t y p ei ( 类型i ) 和t y p ei i ( 类型) ，类型i 拓扑异构酶每次只瞬时切割单链d n a ，类型拓扑异构酶可以切割双链螺旋 d n a 。这两种类型又可以进一步分为五个亚家族：i a 、i b 、i c 、i i a 和i i b 。同 一亚家族的拓扑异构酶在结构和机制方面相似，但i c 与l 、i b 差异大而不具有 同源性( w a n g ，1 9 9 6 ；a m m o n e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 类型i 拓扑异构酶切割单链d n a 并且在切割反应的第一步就使连环数产生 变化，拓扑异构酶n 通过酪氨酰键瞬时连接于单链d n a 切口的5 端磷酸基团， 细菌的d n a t o p o i s o m e r a s e si 和i i i ，真核d n a t o p o i s o m e r a s e si i i 都属于拓扑异 构酶队亚族，它们分别由t o p a ，t o p b ，t o p 3 基因编码；在大肠杆菌中，t o p a 催化负超螺旋的松弛反应。细菌的d n a 螺旋酶在催化d n a 连环数改变的功能 上与t o p a 是相反的，因此通过这两种酶以及它们在表达水平上的调控机制就能 够维持d n a 的负超螺旋在适当狭窄的范围内保持动态的平衡( h a n a i ，1 9 9 6 ) 。现 在对真核和细菌的d n at o p o i s o m e r a s e si i i 的了解还很少，这些酶有很强的相关 性并且都拥有高效的解缠绕活性。酵母的t o p 3 在减数分裂时期，对抑制重复d n a 序列重组有重要作用( w 址l i se ta 1 ，1 9 8 9 ；k i i ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。古生菌中的反转螺旋酶 也属于拓扑异构酶队亚族，此酶是a t p 依赖型，催化d n a 的正超螺旋 ( c o n f a l o n i e r ie ta 1 ，1 9 9 3 ) 。拓扑异构酶i b 通过酪氨酰键瞬时连接于单链d n a 切口的3 端磷酸基团，真核d n a t o p o i s o m e r a s ei 属于此亚家族，它是由t o p j 基因编码的产物，t o p l p 与t y p ei a 类型的酶相似性很小，此酶能催化正超螺旋 或负超螺旋的松弛反应。在酵母中，t o p l 基因是非必需的，因为其他的细胞因 子，如d n a t o p o i s o m e r a s ei i 或t r f 4 p 能够补偿t o p l p 功能的丧失( c a s t a n oe ta 1 ， 1 9 9 6 ；g o t oa n dw a n g ，1 9 8 5 ) 。 类型i i 拓扑异构酶也分为a 、b 两个亚族，拓扑异构酶i i a 和拓扑异构酶i i b 有一些相关，它们具有相似的a t p 结合域，同时通过酪氨酰键瞬时连接于双链 d n a 切口的5 端磷酸基团。类型i i 拓扑异构酶中除d n a 螺旋酶外，都是a t p 依赖型并且能催化负超螺旋的松弛反应，而d n a 螺旋酶是拓扑异构酶中唯一一 种能引入负超螺旋的酶( r e e c ea n dm a x w e l l ，1 9 9 1 ；w i g l e y , 1 9 9 5 ) 。拓扑异构酶i i a 亚族包括真核拓扑异构酶i i ( 如酵母的t o p oi i ) 、原核拓扑异构酶i i ( 如大肠杆 菌的d n a 螺旋酶) 、拓扑异构酶i v ( 如大肠杆菌中的t o p oi v ) 以及一些噬菌体 拓扑异构酶i i ( p h a g et 4 ) ( b j o m s t i ，1 9 9 9 ；c o r b e t ta n do s h e r o f f , 1 9 9 3 ；w a t ta n d h i c k s o n ，1 9 9 4 ) 。这个亚家族中的所有酶类都具有相当广泛的序列和功能相似 性，这些酶有的是二源四聚体( 细菌的拓扑异构酶) ，有的是同型二聚体( 酵母 7 华中农业大学硕士学位论文 的拓扑异构酶) 。细菌的d n a 螺旋酶由两个g y r a 和两个g y r b 亚基组成，分别 由g y r a 和g y r b 基因编码，能够在d n a 中引入负超螺旋或催化正超螺旋的消除。 大肠杆菌的d n a 螺旋酶是目前研究得最广泛和深入的螺旋酶。d n a t o p o i s o m e r a s ei v 由p a r c 和p a r e 基因编码，是高效的解缠酶( u l l s p e r g e ra n d c o z z a r e l l i ，1 9 9 6 ) 。真核d n a t o p o i s o m e r a s ei i ，是酵母基因t o p 2 编码的产物， 以同型二聚体为功能单位并且催化正超螺旋的松弛或引入负超螺旋，这个酶是非 常基本的并且在有丝分裂的姐妹染色体复制时是必需的。在所有情况下，重要的 机体工作机制显示这些酶以a t p 依赖的蛋白夹形式结合d n a ( r o c a , 1 9 9 5 ；b e r g e r e ta 1 ，1 9 9 6 ；o s h e r o f f , 1 9 8 6 ) 。双链d n a 被切开后产生粘性的、结合蛋白质的切 口，第二段d n a 片段通过这个切口后，切口就会重新连接。酶变构效应的改变 需要a t p 的水解。在人细胞中t o p oi i 是由t o p 2 口和t o p 2 夕基因编码的两种亚 型酶组成的，当这两种基因在酵母细胞中共表达时，能检测到有催化活性的异二 聚体，说明t o p 2q 邝异二聚体可能是哺乳动物细胞中d n at o p o i s o m e r a s ei i 中 的组成部分( j e n s e ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。拓扑异构酶i i b 亚族只有存在于古生菌中的 t o p ov i ，这种酶是1 9 9 7 年通过对古生菌中编码t o p oi i 两个亚基的基因进行测 序时才被发现的，目前为止，t o p ov i 是拓扑异构酶i i b 亚族中唯一的成员 ( b e r g e r a te ta 1 ，1 9 9 7 ) 。t o p ov i 也是由a 、b 亚基组成的二源四聚体，和t o p oi i a 亚族的酶没有明显的同源性( g a d e l l ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ，t o p ov i 是a t p 依赖性的酶， 它能催化正超螺旋和负超螺旋的松弛反应，并且还能有效地解缠。除t o p ov i 外， 类型i i 拓扑异构酶在一级序列水平上是同源的，但蛋白质的寡聚化状态不同 ( b e r g e r , 1 9 9 8 ) 。通过对不同界的多数有机体的广泛的生化数据和基因组序列进 行比对，说明d n a 拓扑异构酶在d n a 世界中是最保守的蛋白质之一( c h a m p o u x ， 2 0 0 1 ：f o a e r r e ，2 0 0 1 ) 。 1 3 2d n a 拓扑异构酶的功能 t y p ei a 型d n a 拓扑异构酶能够松弛缠绕不足或者负超螺旋的d n a ，- - d , 段双链d n a 首先不对称的与酶结合，接着瞬时的切割导致在结合的区域形成单 链的d n a ( w a n g ，1 9 9 6 ；k i r k e g a a r da n dw a n g ，1 9 8 5 ) 。d n a 负超螺旋得越少，那 么此酶不对称结合d n a 就越困难，因此，酶的催化效率就会降低。如果双链 d n a 有切口或缺口时，t y p ei a 型d n a 拓扑异构酶也能将一段d n a 双螺旋穿 过另一段d n a 双螺旋( t s ea n dw a n g ，1 9 8 0 ) 。t y p ei b 型d n a 拓扑异构酶能高效 的松弛正超螺旋和负超螺旋d n a ，虽然有报道在体外实验中t y p ei b 型d n a 拓 扑异构酶能缠绕或解缠绕有切口的双链环状d n a ，但是现在仍然不清楚此酶是 怎样使d n a 链在分子间通过( b r o w na n dc o z z a r e l l i ，1 9 8 1 ) 。t y p ei 型酶对单链 8 结核分枝杆菌螺旋酶a 、b 亚基相互作用的研究 d n a 的亲和力要比对双链高得多，这正是它识别负超螺旋d n a 分子的基础，因 为负超螺旋的d n a 常常会有一定程度的单链区，负超螺旋越高t y p ei 型酶作用 越快。现己知道，生物体内负超螺旋稳定在5 左右，低了也不行，高了也不行。 生物体通过类型i 拓扑异构酶和类型i i 拓扑异构酶的相反作用而使负超螺旋达到 一个稳定状态。 与t y p ei 型酶相比，t y p ei i a 和l i b 型酶都是a t p 依赖型运输一条完整的 双螺旋d n a 链通过另一条链( w a n g ，1 9 9 6 ；c h a m p o u x ，2 0 0 1 ；w a n g ，1 9 9 8 ) ，在解 缠绕、缠绕、松弛正超螺旋或负超螺旋的拓扑结构转换过程中，都已证实t y p ei i 型酶是a t p 依赖型运输一条完整的双螺旋d n a 链通过另一条链( b e r g e r , 1 9 9 6 ) 。 t y p ei id n a 拓扑异构酶能催化一系列的反应：包括松弛正超螺旋和负超螺旋， 缠绕和解缠绕d n a 环，打结和解结d n a ( w a n g ，1 9 9 8 ) ， 这些反应通常都需要 水解a t p 。多数t y p ei i 型酶倾向于松弛反应和解缠绕反应，例如原核的t o p o i v 和真核的t o p o l i ，d n a 螺旋酶是唯一的能将负超螺旋引入d n a 的拓扑异构酶 ( w a n g ，1 9 9 8 ；r e e c ea n dm a x w e l l ，1 9 9 1 ) 。所有的t y p ei i 型酶都有一定程度的序 列相似性，但是在它们的碳端有差别 e a t o na n dw a n g 19 9 4 ) 。 1 3 3d n a 螺旋酶的功能结构域 螺旋酶g y r a 亚基具有酶催化活性中心，因此g y r a 在螺旋酶催化反应中具 有关键性的作用。d a v i d 等人鉴定出大肠杆菌螺旋酶g y r a 亚基中第1 2 2 位的酪 氨酸是酶的活性中心，在酶切割d n a 磷酸二酯键时该酪氨酸共价结合于d n a 上( h o r o w i t z c a n dw a n g ，1 9 8 7 ) 。螺旋酶的g y r a 亚基通过形成一个0 4 磷酸酪氨酸 键共价结合于d n a 中的5 磷酰基团。螺旋酶的所有酶反应过程，均通过活性中 心酪氨酸和d n a 磷酸骨架之间形成共价磷酸酪氨酸键来进行切割和重连反应来 完成。将大肠杆菌g y r a 的第1 2 2 位酪氨酸突变为丙氨酸后，导致螺旋酶的活性 丧失( h o r o w i t z e a n dw a n g ，19 8 7 ) 。 在溶液中，g y r a 易形成结合稳定的二聚体( h o c k i n g sa n dm a x w e l l ，2 0 0 2 ) 。 大肠杆菌螺旋酶g y r a 亚基由两个结构域组成：6 4k d an 端域( n t e r m i n a l d o m a i n so fg y r a 。g y r a - n t d ) 和3 3k d ac 端域( c t e r m i n a ld o m a i n so fg y r a 。 g y r a c t d ) ，g y r a - n t d 含有切割重连d n a 的活性位点和与切割d n a 链结合 的表面，此外还含有一个能运输d n a 的洞穴。x 射线衍射晶体结构显示g y r a 二聚体接触界面呈心形排列( m o r a l se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。g y r a - n t d 形成二聚体核心， 两边被致密的梨形g y r a c t d 包围，螺旋酶的特异性是由于g y r a c t d 能缠绕 d n a ( c o s t e n a r oe ta 1 ，2 0 0 5 ) ，螺旋酶g y r a c t d 具有包裹d n a 的功能区域， 但是与其他i i 型拓扑异构酶有明显的序列差异( l e v i n ee ta 1 ，1 9 9 8 ) ，而且在不同 9 华中农业大学硕士学位论文 种类细菌的g y r a 蛋白中g y r a c t d 序列变异最大。大肠杆菌的g y r a c t d 是非 特异性的d n a 结合区域，能够稳定螺旋酶和d n a 的复合物，从而提高螺旋酶 的活性( r e e c ea n dm a x w e l l ，1 9 9 1 b ) 。g y r a c t d 虽然自身没有任何酶活性，但具 有包裹缠绕d n a 的功能，能诱导d n a 以正超螺旋的方式结合于其上，螺旋酶 引入负超螺旋的能力取决于d n a 以正螺旋方式包裹于g y r a c t d 蛋白。d n a 螺旋酶与其他t y p ei i 拓扑异构酶的区别，是螺旋酶可利用g y r a c t d 蛋白来直 接捕获t - 片段。研究证明截掉g y r a c t d 结构域的螺旋酶不能进行超螺旋化反 应，但仍能以依赖于a t p 的方式松弛d n a ( k a m p r a n i sa n dm a x w e l l ，1 9 9 6 ；w i l l i a m sa n dm a x w e l l ，19 9 9 ) 。 限制性蛋白水解试验显示g y r b 蛋白由两个结构域组成：4 3k d an 端域 ( n t e r m i n a ld o m a i n so fg y r b ，g y r b - n t d ) 和4 7k d ac 一端域( c - t e r m i n a ld o m a i n s o fg y r b ，g y r b c t d ) ( k a m p r a n i sa n dm a x w e l l ，19 9 8 ) 。g y r b - n t d 含有a t p a s e 的功能，可水解a t p 为超螺旋化提供能量( r o e a , 1 9 9 5 ) ，g y r b c t d 能与g y r a 亚基发生相互作用，并且g y r b c t d 对d n a 的结合是必需的，目前为止还没有 解析出g y r b c t d 的三维结构图，但是同源蛋白质酵母t o p o l i 的x 射线晶体结 构已经解析出了( b e r g e re ta 1 ，1 9 9 6 ；f a s se ta 1 ，1 9 9 9 ) ，酵母的t o p o l i - n t d ( a m i n o t e r m i n a ld o m a i n ) 与g y r b 亚基同源，c t d 与g y r a 亚基同源，全酶是同 源二聚体，已知结构的酵母t o p oi i 缺少a t p a s e 结构域，但是同源区域包含了 g y r b c t d 的两个结构域。 根据x 射线小角度衍射的最新结果显示g y r b 蛋白外形类似蝌蚪状 ( c o s t e n a r oe ta 1 2 0 0 7 ) 。g y r b 蛋白可细分为三个结构域：a t p a s e 结构域即 g y r b - n t d ，而g y r b c t d 可分为两个结构域，第一个是t o p r i m 结构域，t o p r i m 结构域是一个保守的结构域，在i 型a 和i i 型异构酶中都有，在引发酶、核酸 酶、d n a 修复蛋白中也有t o p r i m 结构域( a r a v i n de ta 1 ，1 9 9 8 ) ，它有保守的吖p 折叠结构，这个结构域有两个保守的模体：第一个模体是以保守的谷氨酸为中心 的模体，谷氨酸在拓扑异构酶和核酸酶进行切割d n a 片段时作为广义酸，还参 与拓扑异构酶的重连反应；第二个模体是有两个保守天冬氨酸的模体( d x d ) ，这 个模体能提供广义酸与m 9 2 + 配位结合，来完成拓扑异构酶的切割重连活性位点 ( n o b l ea n dm a x w e l l 2 0 0 2 ) 。已经证实了重组修复蛋白r e e r 的t o p r i m 结构域能 够结合r e e f 和r e e o 蛋白，t o p r i m 结构域的酸性氨基酸区域是r e eo 蛋白的结 合位点，e 1 4 4 a 和e 8 4 a 此蛋白的8 4 位谷氨酸突变为甘氨酸，1 4 4 位谷氨