（微生物学专业论文）应用pcrdgge技术分析泡菜中乳酸菌的多样性.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壹墨盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：们耐脚 签字同期：如哆年6 月p f 3 学位论文版权使用授权书 本论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：4 百吼堪 导师签名 蜘艺 i 签字只期：娜5 年自 硐 签字目期：口厂年g 月，o 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 3 摘要 泡菜最早始于中国，是入们喜爱的佐餐食品，它是利用蔬菜上附着的乳酸菌 自然发酵而成。研究表明，乳酸菌能够消耗亚硝酸盐，产生细菌素，积累维生素、 有机酸等，并且赋予泡菜特别的风味。 分子生物学方法近年来己被广泛应用于微生物多样性的研究中，也越来越多 地应用予食品微生态的研究。其中，p c r d g g e 技术在不同种群的初步调查以 及优势群落的鉴定中是非常有用的，能够提供有关群体变化和差异的信息，并且 可以和传统方法、杂交技术、克隆测序技术等结合起来，从而全面认识微生态的 组成。本研究首次应用p c r d g g e 技术分析我国传统发酵食品泡菜中乳酸菌的 多样性，并与国内采用传统分离培养方法对泡菜中乳酸菌的研究结果进行了比 较，进一步对d g g e 条带进行了克隆测序，并绘制了进化树( p h y l o g e n e t i c t r e e ) 。 采用c t a b 法直接从泡菜液中抽提总d n a ，对总d n a 中1 6 sr d n a 的v 7 8 可变区序列作p c r 扩增，3 0 - - 4 0 变性梯度凝胶电泳分离效果较好，发现所 耿的不同样品问的菌种差异相当显著。 通过对o g g e 条带割胶回收并进行克隆测序，利用g e n b a n k 中的b l a s t n 与已知序列比对，并利用c l u s t a lx 程序和p h y l i p 软件包进行分析，构建进化树。 结果表明，测定的1 6 sr d n a 部分序列与乳酸菌序列呈现高度的同源性，条带e 与小片球菌( p e d i o c o c c u sp a r v u l u s ) 有相近的亲缘关系，相似性达到9 9 4 ： 条带f 与乳酸乳球菌( l a c 幻c o c c u sl a c t i s ) 有相近的亲缘关系，相似性达到 9 8 2 ；条带g 与植物乳秆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 有相近的亲缘关系， 相似健达到9 9 1 ：条带h 与植物乳杆菌( l a c 幻b a c i l l u sp l a n f a r u m ) 有相近的 亲缘关系，相似性达到9 9 7 ：条带l 与德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) 有楣近的亲缘关系，相似性达到9 9 7 。条带g 与h 的序列有四个碱基不同， 并且g + c 含量不同，可能属于不同的亚种。由此推知，所选取的家庭泡菜样品 中可能含有小片球菌、植物乳卡t 菌、乳酸乳球菌、德氏乳杆菌等。 在d g g e 与国内采用传统分离培养方法对泡菜中乳酸菌的研究结果的比较 研究中，两种方法检测到的细菌多样性结果不完全一致，说明两种方法都有一定 的选择性和局限性，对o g g e 条带进行克隆测序，才更具有说服力。 7 在今后的研究中，有必要利用多种分子生物学技术来检测特定环境中可能具 有的微生物多样性，将经典微生物学方法与免培养方法结合起来，进行综合分析。 只有这样，才能更全面、充分地认识微生物天然存在的状况。 关键词：泡菜多样性p c r d g g e 乳酸菌 8 a b s t r a c t p i c k l e sm , a yo r i g i nf r o ma n c i e n tc h i n a t h i st r a d i t i o n a lf o o di sb a s e do n n a t u r a lf e r m e n t a t i o nc a r r i e do u tb yt h ee p i p h y t i cl a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) f r o mt h ev e g e t a b l e st h a tw e r eu s e df o rr a wm a t e r i a l so fp i c k l e sl a bp l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o d u c t i o no fp i c k l e s l a bc a np r o d u c eo r g a n i ca c i d s ， b a c t e r i o c i n ，v i t a m i n s ，a n do t h e rn u t r i e n t s ，c o n s u m en i t r i t e ，a n dg i v eas p e c i a l f l a v o rt op i c k l e s m o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d sw e r ew i d e l yu s e dt os t u d yt h em i c r o b i a l d i v e r s i t y ，a n di n t r o d u c e di n t ot h er e s e a r c ho nf o o dm i c r o e c o l o g yi n r e c e n t y e a r sp c r d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p c r - d g g e ) i sav e r y u s e f u lm e t h o d ，w h i c hc a nb ec o m b i n e dw i t ho t h e rt e c h n o l o g i e ss u c ha s c u l t u r e d e p e n d a n tm e t h o d ， f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n c l o n ea n d s e q u e n c e t h e r e b yw ec a na s s e s st h em i c r o b i a ld i v e r s i t ym o r ea d e q u a t e l y p c r d g g ew a su s e dt oa n a l y z et h eb i o d i v e r s i t yo fl a bf r o mc h i n e s e t r a d i t i o n a lp i c k l e si np r e s e n ts t u d y t o t a ld n aw a se x t r a c t e df r o mt h ep i c k l ej u i c eb yc t a bm e t h o d t h e v 7 一v 8r e g i o no f16 sr d n aw a sa m p l i f i e db yp c rd g g eb a n d sw e r ee x c i s e d a n dc l o n e d ，p o s i t i v ec l o n e sc o n t a i n i n g1 6 sr d n ai n s e r t sw e r es e q u e n c e da n d b l a s ti n g e n b a n k p h y t o g e n e t i ca n a l y s ew a sp e r f o r m e db yu s i n gp h y t i p s o f t w a r ep a c k a g e p h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do nt h e16 sr d n as e q u e n c e d i s p l a y e dh i g hi d e n t i t yw i t hl a ba b o v e9 8 t h e ya r ep e d i o c o c c u sp a r v u l u s ， l a c t o b a c i t l u s p l a n t a r u m 。l a c t o c o c c u sl a c t i s j l a c t o b a c i l l u sd e i b r u e c k i i a c c o r d i n gt ot h e i rs i m i l a r i t i e s i n c o m p a r i s o nw i t ht h er e s u e s f r o mc l a s s i cm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d s r e p o r t e d ，t h er e s u l t sf r o md g g ew e r en o tm e e tc o m p l e t e l y t h e r ew e r el o t so f f a c t o r st h a ta f f e c tt h er e s u l t s ，s u c ha sv e g e t a b l e su s e d ，s e a s o n s r e g i o n se t c t h em i c r o b i a ld i v e r s i t yo fp i c k l e sb yt h e s et w om e t h o d sw a si n c o n s i s t e n t i t s h o w e dt h a tb o t hm e t h o d sh a v ei t ss e l e c t i v i t ya n dl i m i t a t i o n i ts u g g e s t e dt h a t 9 w es h o u l da p p l yd i f f e r e n tm o l e c u l a ra p p r o a c h e sa n dt h ec o m b i n a t i o no f c u l t u r e d e p e n d a n t a n dc u l t u r e - i n d e p e n d e n tm e t h o d si nt h ea n a l y s i so f m i c r o b i a ld i v e r s i t y ，s ow ec a na s s e s st h em i c r o b i a ld i v e r s i t ym o r ea d e q u a t e l y a n do b j e c t i v e l y k e yw o r d s ：p i c k l e s ；b i o d i v e r s i t y ；p c r d g g e ；l a c t i ca c i db a c t e r i a 1 0 r f l p r a p d a f l p r f l p d g g e f i s h t g g e c 1 _ a 8 t e m e d e d l - a s d s p c r e b d n t p p t g 英文缩略语 r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a a m p l i f i e d f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m t e r m i n a lr e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m d e n a t u r i n gg r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s i s f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e e t h l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n e t h i d i u mb r o m i d e d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e i s o p r o p y l 一1 3 一d t h i o g a i a c t o s i d e o d o p t i c a ld e n s i t y 限制性片段长度多态性 随机扩增多态性 扩增片段长度多态性 末端限制性片段长度多 态性 变性梯度凝胶电泳 荧光原位杂交 温度梯度凝胶电泳 十六烷基三甲基溴化铵 四甲基乙二胺 乙二胺四乙酸 十二烷基硫酸钠 聚合酶链式反应 溴化乙锭 脱氧核苷三磷酸 异丙基一8 一d 一硫代半乳 糖苷 光密度 第一章文献综述 微生物是一类丰富的生物资源，种类繁多，数量巨大，包括了从原核生物到 真核生物的不同类群：如细菌、真菌、放线菌、原生动物、部分藻类和病毒。微 生物作为地球生态系统中重要的一员，其多样性在维持生物圈生态平衡和为人类 提供大量多种珍贵资源方面起着重要的作用，它们的价值是无法估量的。 微生物的多样性是指在一个集合群落中，众多不同类型微生物的变化及它们 之间相对的丰度。对微生物多样性的研究不仅将极大地推动生命科学的发展，也 将有利于发现新的有用微生物资源，进一步造福人类。与宏观生物不同的是，由 于微生物本身所具有的个体微小、形态结构简单等特点，致使微生物的多样性在 形态和分化上表现并不突出，而主要表现在物种和基因水平上，因此要对自然环 境中的微生物多样性有一个客观的认识是一个非常艰巨的任务。对微生物资源的 认识、保护是整个生物圈保护中必不可少的内容，所以人们一直在努力探索研究、 丌发微生物资源，以期更加客观、真实地认识它们，从而更好应用微生物为人类 造福。近年来，对微生物多样性的研究闩益受到人们的重视。 目f j i ，研究微生物生态学有两个主要的趋向：一是利用各种分子生物学技术 或与传统方法的结合，以期更客观地认识研究环境中微生物的丰度、均度等自然 存在状况：二是加强对极端环境微生物的研究，以期发现新的特殊的微生物资源， 了解其适应极端环境的机制。 1 传统方法在微生物多样性研究中的应用 传统的研究方法是首先从特定自然生境( 如土壤、水) 中取样，采用模拟自 然生境的各种培养基和条件进行分离培养，通过纯培养获得菌株后，再对其表型 特征、细胞的性质( 形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察) 进行观 察收集，i 能对其特性进行描述，这种方法又被称作经典方法。经典方法需要进 行一系列繁杂的形态特征和生理生化实验，相关的实验做得越多，得到的结果就 更可靠一些。它最大的缺点是，即使最复杂的实验组合也不能对分离物进行精确 的鉴定，而且不能揭示分离物间的系统发育关系。 对乳酸菌而言，应用经典方法对其进行准确鉴定非常困难，因为不同的种在 1 2 适应某一环境后就有相应的新的营养要求( a m p ee ta l ，1 9 9 9 ) 。人们不能利用传 统的微生物技术获得微生物多样性的真正概貌，这首先在温泉( f e r r i se t a l ， 1 9 9 6 ) 、瘤胃和废水处理工厂( g o d o ne ta l ，1 9 9 7 ) 的微生态研究中得到证实， 那罩的许多微生物很难培养或者根本不能培养。s u a u 等( 1 9 9 9 ) 的研究结果表 明，人类肠道中6 0 8 0 的微生物在目前是不能培养的( u n c u l t u r a b l e ) 。实际上， 我们已经知道，在自然环境中能够分离培养的微生物的数量还不到自然界微生物 总数的1 ( n o r m a n 1 9 9 6 ) ，还有相当多的微生物因无法培养而未被认识。传 统培养方法严重地限制了我们认识微生物的视野，由于缺乏再现环境条件的方法 和培养基质，造成了大多数微生物难以被标准实验室方法复苏分离和培养。这对 于人们f 确认识微生物资源，开发并利用这些资源造成了严重的障碍。因此，传 统方法严重地制约了人们对微生物生态的认识。 虽然传统的依靠培养的方法制约了人们对微生物生态的客观认识，并存在着 研究周期较长等缺点。但是通过纯培养获得菌株后可以对其进行深入、全面的研 究，最终确定其分类学地位并为人类所利用，此外还可以加强人们对微生物群落 结构与功能的认识。因而在微生物学的研究中，经典的微生物技术仍然将是一个 不可替代的方法。 2 分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用 近十年来，分子生物学的发展使得我们可以摆脱依赖培养的传统方法的束 缚，丌辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路、新途径。 p a c e 等( 1 9 8 6 ) 首次将5 sr r n a 基因用于环境样品中总微生物的测定， 随之很快被用于微生物多样性研究领域。由于5 sr r n a 基因相对较小( 约1 2 0 个核营酸) ，携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。1 6 s r r n a ( 约1 5 k b ) 种类少，含量大( 约占细菌r n a 含量的8 0 ) ，分子大小适 中，存在于所有生物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具 有高度的保守性，素有“细菌化石”之称( 焦振泉，1 9 9 8 ) 。细菌的1 6 sr r n a 的可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，设计引物将1 6 sr r n a 基 因扩增出来，利用可变区序列差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，判 定不同菌属、菌种的细菌的遗传关系远近，因而更适于微生物多样性的研究。目 前，1 6 sr r n a 基因序列分析己广泛应用于微生物多样性的研究。 1 3 比较微生物的相对进化关系，典型的方法是比较不同微生物的类似基因并计 算它们碱基序列的不同，微生物间的碱基数相差越多，所比较微生物的进化关系 越远，类似数据用于计算所比较微生物的进化距离并由此建立系统发生树或进化 多样性图谱。 近年来，随着分子生物学技术的不断发展，d n a 标记技术已成为探讨种群 遗传变异的重要选择。主要包括限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t t e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、随机扩增多态性( r a n d o m l ya m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、末端限制性片段长度多念性( t e r m i n a lr e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，t - r f l p ) 、变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n g gr a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 、荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei n s i t u h y b r i d i z a t i o n f i s h ) 等。 2 。1 基于分子杂交技术的分子标记 核酸分子杂交技术是基于d n a 分子碱基互补配对的原理，用特异性的c d n a 探针与待测样品的d n a 或r n a 形成杂交分子的过程。它具有高度的特异性和 灵敏性，近年来已被广泛应用于微生物多样性的研究中，也越来越多地应用于食 品微生态的研究中。a m p e 等( 1 9 9 9 ) 采用九种系统发育寡核苷酸探针研究墨西 哥发酵玉米面团( m e x i c a np o z 0 1 ) 中的微生物群落，尤其是乳酸菌的变化，发 酵早期乳球菌和明串珠菌是优势菌，发酵后期乳杆菌成为优势菌，同时还检测到 肠细菌。 2 1 1 数量印迹杂交( q u a n t i t a t i v ed o tb l o t ) 对环境样品提取的总d n a 进行数量印迹杂交( q u a n t i t a t i v ed o tb l o t ) ，可获 得有关特定d n a 序列丰度的信息。通过设计专一性或通用型探针和环境样品中 分离的总d n a 分别进行杂交，特定d n a 的相对丰度可用此两类探针杂交信号 的比值加以确定，用以间接反应特定的微生物细胞的数量或特定的种群的相对生 理活性等。 2 1 2s o u t h e r n 杂交( s o u t h e r nh y b r i d i z a t i o n ) 对r d n a 的扩增产物或r r n a 的反转录产物进行s o u t h e r n 杂交( s o u t h e m 1 4 h y b r i d i z a t i o n ) ，微生物的r r n a 基因的信号序列在不同层次上存在差异，出此设 计的特定寡核苷酸探针可检测相应微生物的层次。 2 1 3 原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 对环境样品直接进行原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) ， 利用荧光标汜的具有特异性的核酸片段为探针，与中期细胞的或间期细胞核的的 d n a 杂交，从而将这段d n a 序列定位在细胞中。此技术可获得未知菌的微生物 多样性的大量信息。原位杂交技术目前应用较多。 2 1 4 全细胞杂交( w h o l e - c e l lh y b r i d i z a t i o n ) 对微生物菌落进行全细胞杂交( w h o l e c e l lh y b r i d i z a t i o n ) ，可提供比用探针 作s o u t h e r n 印迹杂交更直观的信息。 2 2 基于p c r 的分子标记技术 p c r 技术是美国科学家m u l l i s 发明的一种在体外快速扩增特定基因或d n a 序列的方法，能将极微量d n a 进行大量特异性扩增，以便对已知d n a 片段进 行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析等。在微生物多样性的研究中应 用最广泛的是以1 6 sr r n a 保守性基因为基础设计引物进行p c r 扩增，分析基 因序列研究微生物群落的多样性。 2 2 - 1 末端限制性长度多态性( t - r f l p ) 术端限制性长度多态性( t e r m i n a lr e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m 。t - r f l p ) 根据1 6 sr r n a 保守性基因设计通用引物，其中一个 引物的5 端用荧光物质标记。对待分析样品的总d n a 进行p c r 扩增，p c r 产 物的端就带有荧光标记，然后用合适的限制性内切酶消化。不同的细菌的扩增 片段内存在核苷酸序列的差异，酶切后产生许多不同长度的限制性片段，用自动 测序仪进行检测，只有末端带荧光标记的片段能被检测到，这些术端带荧光标汜 的片段就可以反映微生物群落的组成情况。t - r f l p 技术具有三个明显的优势： 序列数据库具有直接的参考意义。核酸测序技术要比d g g e 或s s c p 所依 赖的电泳系统获得的结果更为可靠。( 萤t - r f l p 的毛细管凝胶电泳分析更为快速， 而且结果是以数据的形式输出。k a p l a n 等( 2 0 0 1 ) 利用t - r f l p 技术，研究了 1 5 饲喂小鼠嗜酸乳酸菌n c f m 的过程中n c f m 的动力学，以及肠道菌群结构的变 化情况。近年来t - r f l p 技术的发展十分迅速，是评估复杂微生物群落多样性、 比较不同生态环境下微生物群落多样性及结构的快速有效的方法。与d g g e 方 法相比，t r f l p 技术更灵敏，能够检测到更多的操作分类单元( o p e r a t i o n a l t a x o n o m i cu n i t s ) 。m o e s e n e d e r 等( 1 9 9 9 ) 对海洋中浮游细菌的研究结果证实 了这一点。h a y a s h i 等( 2 0 0 4 ) 采用t - r f l p 技术研究了健康人粪便中的双岐杆 菌( b i f i d o b a c t e n u ms p p ) ，检测到极少量的b i f i d o b a c t e r i u ms p p ，强调选择合 适的5 f 物非常重要。o e n a r o 等( 2 0 0 5 ) 采用t - r f l p 技术研究了受碳氢化合物 污染的海域中的细菌群落结构及动力学。 2 2 。2 变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 变眭梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 是出 f i s c h e r 和l e r m a n 于1 9 7 9 年最先提出的用于检测d n a 突变的一种电泳技术。 它的分辨精度比聚丙烯酰胺凝胶电泳更高，可以检测到一个核苷酸水平 的差异。19 8 5 年m u y z e r s 等( 1 9 8 5 ) 首次在d g g e 中使用“g c ”夹板， 使该技术同臻完善。19 9 3 年最先由德国的m u y z e r 等( 1 9 9 3 ) 应用于微生态学 的研究。该技术是根据序列的不同，将片段大小相同的d n a 序列分开。双链d n a 分子中a ，t 碱基之间有2 个氢键，而g c 碱基之间有3 个氢键连接，因此a ，t 碱基对对变性剂的耐受性要低于g 。c 碱基对。出于这四种碱基的组成和排列差 异，使不同序列的双链d n a 分子具有不同的解链温度。 d g g e 胶由b i o r a d 公司生产的t h ed c o d eu n i v e r s a lm u t a t i o nd e t e c t i o n s y s t e m 制备，它的变性梯度呈线性增加。首先将1 6 sr r n a 的基因进行p c r 扩增，得到长度相同或相近的片段，然后在电泳中通过线性增加交性梯度分开不 同序列的产物。其原理是1 6 sr r n a 基因依据其序列的特异变性点熔化解链，各 自单独的序列将在各自特定的变性点开始熔解。部分解链的1 6 sr d n a 分子在凝 胶中基本上停止了迁移，而完整螺旋形式的分子继续向前移动，这样不同的片段 就被d g g e 有效分离。一个引物朱端常需附加3 0 5 0 个富含g c 序列的g c 夹 板，以便百分之百的将所有可能变化的序列检测出来。尿素和甲酰胺通常用于形 成变性梯度，温度也可被应用于产生一温度梯度凝胶电泳( t g g e ) 。 1 6 图1d g g e 原理图 f i g 1t h e p r i n c i p l eo fd g g e 2 2 2 1 变性梯度凝胶电泳工作流程( 柴丽红等，2 0 0 4 ) 图2 变性梯度凝胶电泳工作流程示意图 f i g 2t h ef l o wc h a r to fd g g e 1 7 电冰方向 从环境样品直接提取总d n a ，设计引物将1 6 sr r n a 基因扩增出来，得到 含有某一高变区的目的d n a 序列产物，通过d g g e 得到带谱。因为每个条带很 可能就代表一个不同的微生物物种，所以d g g e 带谱中条带的数量和亮度，即 可相应反映出该环境中微生物物种的数量及该群落中的优势菌群。但为了得到更 详实的信息，往往采用种或类群专一性探针与得到的条带进行杂交或将条带切 下，重新扩增后测序，进而得到部分系统发育信息。 2 2 2 2p c r d g g e 方法的优点 检测极限低 m u y z e r 等( 1 9 9 3 ) 用这种方法能检测出数量仅占总群落数1 的微生物。 o m a r 等( 2 0 0 0 ) 证实p c r d g g e 技术检测极限大约为1 - 3 ，如果结合使用 r r n a 杂交技术，还可使检测极限降至o 1 左右。 检钡0 速度快、经济 o m a r 等( 2 0 0 0 ) 等利用该方法实时实地的研究了墨西哥发酵玉米面团p o z o l 在发酵过程中不同阶段微生物种类和数量发生了动态变化。c o c o l i n 等( 2 0 0 1 ) 对意大利香肠发酵动力学变化进行了研究，p c r d g g e 方法能在取样后8 小时 内得到结果，能够实时监测发酵状态，因此可以根据生产的实际需要对工艺作出 调整。 结果比较客观 传统的生化鉴定方法虽然也能对细菌进行鉴定，但会出现假阳性或假阴性结 果，主观性比较强，而且会漏失一些不能培养的微生物。而p c r d g g e 方法则 能客观完整地鉴定微生物，结果也很直观，它根据参考菌株和样品微生物1 6 s r d n a 的p c r 扩增产物在凝胶中的相对位置来进行判断。若将凝胶上的条带切 割下来测序，然后与g e n e b a n k 中的标准序列进行比较分析，就可以得出它们的 遗传相关性。 可同时检测多种微生物，分析多个样品 d g g e 凝胶上至少可以区分1 0 个清晰可辩的条带，每个条带可能来自不同 的微生物。并且可以同时分析多个样品。 能与其它多种方法结合 p c r - d g g e 在不同种群的初步调查以及优势群落的鉴定中是非常有用的， 1 8 能够提供有关群体变化和差异的信息。d g g e 可以和许多方法结合，从而全面 认识微生态的组成、优势菌群等。实际上，这种结合起来的方法目前被认为是研 究微生物真f 的系统发育的最有力的手段，近些年来，这一观点得到了强调和重 视。p c r d g g e 可以和传统方法、糖和发酵产物分析、杂交技术、克隆测序技 术、r a p d 技术等结合起来。例如，c o c o l i n 等( 2 0 0 1 ) 将p c r d g g e 和传统 技术结合起来，m u y z e r 等( 1 9 9 3 ) 将p c r d g g e 和杂交分析结合起来，都得 到了较好的结果。 2 2 2 3 基本操作流程 样品的采集一样品总d n a 提取及纯化一样品1 6 sr d n a 片段的p c r 扩增一预实验( 主要对扩增出的1 6 sr d n a 片段的解链性质及所需的化学变 性剂浓度范围进行分析) 一制胶一样品的d g g e 分析。 2 2 2 4d g g e 技术的关键环节和系统优化( 富曼丽等，2 0 0 4 ) 2 2 2 4 ，1 最佳变性剂梯度的选择 根据变性剂梯度方向的不同d g g e 可分为： 垂直d g g e ，变性剂梯度同电场方向垂直，变性剂浓度梯度范围比较 宽，一般为o 一1 0 0 或2 0 一7 0 ，用于试验最佳变性剂梯度范围。 平行d g g e ，变性剂梯度同电场方向平行，变性剂浓度梯度范围比较窄， 可以更好地分离d n a 片段。 般采用垂真变性梯度实验来选择所要研究的d n a 片段的解链性质及变性 剂浓度梯度。加样孑l 是一个占胶板整个宽度的单一大孔( 与梯度方向平行) 。从 低浓度变性胶的一侧进胶的d n a 片段， 解离，d n a 以双链分子形式迁移较远。 由于未与变性剂发生作用，d n a 片段未 d n a 片段在高浓度变性剂一侧进胶后， 在电泳过程中几乎不能移动，d n a 分子已大部分解链，单链分子在电场中停止 运动。中等变性剂浓度导致d n a 片段不同的解链程度，因此会停在胶板的不同 位置，电泳后经染色处理，d n a 片段呈现出一条清晰的“s ”型曲线。变性剂梯 度范围应选在垂直实验曲线斜率较大的部分。 2 2 2 4 2 最佳电泳时间和温度的确定 电泳的温度要低于待测解链区域t 。值，对大多数天然的d n a 片段5 0 _ 8 5 1 9 是比较合适的，平行d g g e 适用于多个样品的比较分析。根据d n a 片段的分 辨情况柬确定电泳时矧，一般采用低电压时电泳时间要长一点，高电压则相反。 理论上认为，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细， 有一个碱基差异的d n a 片段都可被分开。 2 2 2 4 3 “g c ”夹板技术 由于d n a 分子中的g 、c 碱基对要比a 、t 碱基对结合得牢固，因此，g c 含量高的区域具有较高的解链温度，基于这一原理，“g c ”夹板技术是将段长 度为3 0 - - 5 0 b p 富含g 、c 的d n a 碱基片段附加到双链的一端以形成一个人工 高温解链区。这样d n a 片段的原有部分就处在低温解链区从而可以实现更好的 分离。 常用的“g c ”夹板碱基片段序列( 5 - 3 ) ： c g c c c g c c g c g c g c g g c g g g c g g g g c g g g g g c a c g g g g g g c g c c c g c c g c g c c c c g c g c c c g g c c c g c c g c c c c c g c c c c c g c c c g c c g c g c c c c g c g c c c g t c c c g c c g c c c c c g c c g 2 2 1 2 。4 。4 染色和测序 核酸染色最常用的是溴化乙锭染色法和银染法，银染法是通过银离子( a g + ) 与核酸形成稳定的复合物，再使用还原剂如甲醛使银离子还原成银颗粒，把核酸 电泳带染成黑褐色，其灵敏度比e e , 高2 0 0 倍，是目前最灵敏的方法。但银染法 不易回收d n a ，无法进行后续的杂交分析。近年来，相继出现了s y b rg o l d 、 s y b rg r e e ni 和s y b rg r e e ni | 等新一代荧光核酸凝胶染料，这类染料的背景 极低，可以更好的观察微量的条带。致突变性远低于e b 数倍甚至数1 0 倍，几 乎具有银染的超高灵敏度。由于该染料渗透入凝胶的速度极快，无需脱色，使染 色过程更加简便，节省时间。虽然这种染料的价格比较昂贵，但还是一类具有良 好应用豁景的荧光染料。显色后，凝胶上的条带可以在回收后用于测序，也可以 直接进行凝胶的杂交分析。 2 2 2 5d g g e 技术的应用现状 自1 9 9 3 年m u y z e r 首次将该技术用于研究微生物多样性以柬。在十几年的 时问早己被广泛应用于各种坏境微生物生态的研究，如高温热泉、湖泊、江河、 海洋、根际、土壤、沙丘等，国内已见有关该方法应用于微生物生态学研究的相 关报道。 许玫英等( 2 0 0 3 ) 应用d g g e 技术对活性污泥中总的细菌类群的差异进行 研究，并对氨单加氧酶( a m o ) 的活性进行比较，结果表明采用该技术有利于 更全面地了解氨氧化细菌( a o b ) 的类群和功能，进而改善废水处理系统的处理 效果。 朱伟云等( 2 0 0 3 ) 应用d g g e 技术研究了仔猪断奶后粪样细菌群体的变化 规律，分析比较仔猪个体间细菌群体多样性，研究结果说明，该技术在研究仔猪 粪样微生物区系变化规律上是非常有效的。 陈灏等( 2 0 0 2 ) 应用d g g e 技术对土壤微生物种类分布进行初步的研究， 发现不同的农罔土壤间的菌种差异相当显著，这些差异性反应种植不同作物的农 f 日中存在其特殊的微生物种群。为农田土壤微生态和高效菌肥的研究提供了新的 实验依掘。 柴丽红等( 2 0 0 4 ) 应用d g g e 法和纯培养法，对青海柯柯盐湖、茶卡盐湖 底泥及周边土壤样品的细菌多样性进行了研究，结果显示，两个盐湖存在大量的 未知细菌分离到的纯培养仅占实有细菌的小部分。 李沁元等( 2 0 0 4 ) 应用d g g e 法对云南腾冲热海3 个高温热泉中菌藻席和 泉底沉积物的细菌多样性进行了初步研究，根据d g g e 带谱中条带的数量、位 置等性状进行了聚类分析，结果表明，菌藻席和泉底沉积物中不仅物种组成差异 较大，而且都存在丰富的细菌多样性。 2 2 2 6d g g e 技术应用的局限性 影响d g g e 分析结果的原因很复杂，涉及到d n a 提取到电泳的全过程： 样品的复杂性会对d n a 的提取造成干扰。 提取到的d n a 极为有限，必须进行p c r 扩增刁能进行电泳，p c r 条件 也不可能满足所有的微生物，结果有的扩增得很好，有的根本没有被扩增。 m u y z e r 等( 1 9 9 3 ) 发现d g g e 只能对微生物群落中数量大于1 的优势种群进 行分析。 梯度凝胶及电泳条件也很难适合所有的微生物的d n a ，不同菌的d n a 扩增片段在电泳中可能走到相同的位置。 2 1 近缘物神或菌株的p c r 扩增d n a 片段会形成嵌合体( c h i m e r a ) ，变性 梯度凝胶电泳时也可能形成异源双链体( h e l e r 。d u p l e x ) ，从而影响电泳分析d n a 条带数目。 没有关联的序列可能一齐迁移到相同的位置( v a l l a e y se ta l ，1 9 9 7 ) 。 一个菌株甚至一个克隆产生多条带( f r o m i ne ta l ，2 0 0 2 ) 。 重复性贯穿d n a 提取到电泳的全过程，包括p c r 扩增、扩增产物的电 泳上样量以及染色。 p c r 扩增过程中如何避免优先扩增，使所有模板以均等的几率倍扩增t 这些问题尚有待解决。 引物的设计、扩增程序的选择均对扩增后d n a 片段的质量和数量有很大 影响。 不同的实验条件导致不同的带型谱图。 因此，从某种程度上来说，许多因素的综合使d g g e 方法所得的结果只有 相对的意义。这需要我们不断改进方法，最好综合使用不同的分子生物学方法， j 能使结果比较客观。 今后的发展趋势是加强d g g e 与不同的分子技术之间，以及与传统方法之 间的有机结合，发展新的技术，促进微生物多样性研究的深入开展。 3p c r d g g e 在乳酸菌多样性研究中的应用 p c r d g g e 方法在国外越来越广泛地应用于食品微生态的研究，鉴定食品 中的微生物，评估食品发酵过程中的微生物多样性，进行食品质量评价( e r c o l i n i e ta i 2 0 0 4 ) 。国内尚未见d g g e 法应用于食品微生态研究的相关报道。 t e m m e r m a n 等( 2 0 0 3 ) 应用p c r d g g e 方法调查了市场上销售的益生 菌制品的质量，包括奶制品、果汁饮料、冻干制品，首先扩增1 6 sr r n a 的基因 的v 3 可变区，再通过d g g e 分离扩增产物，结果发现很大一部分益生菌产品 标识不正确，益生菌数量很低。 f a s o l i 等( 2 0 0 3 ) 应用p c r d g g e 方法鉴定酸奶制品中的益生菌，采用 了两套参考菌株电泳条带阶梯作参照，首先扩增酸奶制品中的细菌1 6 sr r n a 的 基因的v 2 一v 3 可变区，扩增产物电泳条带与参考菌株电泳条带阶梯作比较，并 进一步测序鉴定。鉴定结果与酸奶制品包装上的微生物种类一致，而与冻干制品 2 2 包装上的微生物种类不一致，双岐杆菌属与芽孢杆菌属的鉴定不正确，并发现了 役有标注的微生物种类。p c r d g g e 方法被证明是一种免培养的、快速