（果树学专业论文）根癌农杆菌介导的酸樱桃离体叶片高效遗传转化体系的建立.pdf

摘要 核果类果树主要包括桃、李、杏、- 扁桃、樱桃等，在植物分类上属于 蔷薇科( r o s a c e a e ) 李属( p r u n u sl ) 植物，在果树生产中占有相当重要的地 位。长期以来，核果类果树一直被国内外同行公认为是最难进行离体( 无性 材料) 再生的一类树种，大家在这方面曾经尝试做过大量实验研究，但成效 甚微。核果类果树由于其自身的离体再生困难等问题，基因工程技术的研 究也明显地相对落后于其它果树的发展。因此，建立和完善有效的遗传转 化再生系统就成为开展核果类果树在这一领域研究的关键。长期以来，国 内外的几个实验室一直致力于这方面的研究，并取得了一定的研究成果。 种种迹象表明，核果类果树( 无性材料) 遗传转化高效再生技术有望在近期 取得突破。 樱桃是一年当中最早上市的水果，俗有春果第一枝的美誉。其营养价 值高，用途广。除鲜食外还可以做点心、酿酒、入药等功能。酸樱桃还具 有调中益气、养精止泻等滋补功能。其叶、核、果皆可入药，通身无弃物。 由于多元酚类化合物含量较高，因此有明显的抗癌、抗动脉硬化和其他心 血管疾病的功效。然而在栽植当中容易感染根癌病，大大限制了该优良树 种的推广，因而提高它的抗逆性是今后发展的目标。传统的育种方法周期 长，而基因工程为加快其育种进程提供了新的手段。但是缺乏高效遗传转 化体系，为建立樱桃优良的遗传转化体系，本论文以酸樱桃为材料，用离 体叶片作为外植体，建立了离体叶片高频再生体系：并通过根癌农杆菌介 导从优化遗传转化的各项参数，建立了离体叶片高效遗传转化体系，其结 果如下： 1 确定酸樱桃离体叶片的再生体系 从再生培养基、激素配比、叶片生理状态、培养基中琼脂用量、不同培养 容器等几个方面对影响离体叶片高效再生的关键因素进行了研究。确定了 c a b 一6 p 的再生培养基为w p m ，最佳激素配比是b a2 m g l + i a a2 m g l ，叶 片的最佳生理状态为试管苗顶部新发出的极为幼嫩并且是合拢状态的幼 叶，琼脂的使用浓度为4 5 9 l ，离体叶片诱导再生的培养容器用广口瓶再 生效果最好。 2 酸樱桃遗传转化中对抗生素抗性敏感性试验的研究 验研究表明，卡那霉素的筛选最佳浓度应为4 0 m g 1 。认为头孢唑啉钠是 c a b 一6 p 的最佳抑菌抗生素，且适宜的浓度范围为5 0 0 m g 1 6 0 0 m g 1 。 3 酸樱桃遗传转化体系的建立 用无菌的c a b - 6 p 试管苗的离体叶片作为受体，优化了农杆菌介导转化体系 的多项参数：以0 d 。为o 5 1 0 的农杆菌菌液侵染1o m ir l 后共培养3 天， 能获得的g u s + 率高达8 0 以上。 4 本实验还进一步研究了立即筛选、延迟筛选、梯度筛选三种选择方式对 抗性芽的百分率及转化率的影响，得到梯度筛选的转化率为1 2 。是该转 化体系最好的筛选方式。另外，a s 也是遗传转化的一关键影响因素。本实 验研究表明，在共培养培养基与农杆菌悬浮液中同时加入浓度为2 0 m g 1 的a s 可提高抗性芽率。 5 通过p c r 扩增分析，初步证明外源基因已经转入酸樱桃c a b - 6 p 。 关键词：酸樱桃；离体叶片；再生；遗传转化；根癌农杆菌 a h i g he f f i c i e n t 、g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mf o r c h e r r y ( p 厂“以“sc e r a s u sl ) l e a v e sm e d i a t e db y a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s b s tr a c t t h ed r u p e sf r u i tt r e em a i n l yi n c l u d e st h ep e a c h ，l i ，t h ea p r i c o t ，t h ea l m o n d ， t h ec h e r r ya n ds oo n ，b e l o n g st ot h er o s e f a m i l yp l u mp l a n ti n t h ep l a n t c l a s s i f i c a t i o n ，h o l d st h eq u i t ei m p o r t a n ts t a t u si nt h ef r u i tt r e ep r o d u c t i o n s i n c el o n g ，t h ed r u p e sf r u i tt r e eh a sb e e nr e c o g n i z e db yt h ed o m e s t i ca n d f o r e i g nc o l l e a g u e sf o rh a sb e e nm o s td i f f i c u l tt oc a r r yo nak i n do f , t r e es e e d w h i c ht h ee x s o m a t i z e ( a s e x u a lm a t e r i a l ) r e g e n e r a t e s ，e v e r y b o d ya t t e m p t e di n t h i sa s p e c th a sd o n et h em a s s i v ee x p e r i m e n t a ls t u d y ，b u tr e s u l tr e a l l ym i c r o t h ed r u p e sf r u i tt r e ea sar e s u l to fq u e s t i o n sa n ds oo ni t so w ne x s o m a t i z e r e g e n e r a t i o nd i f f i c u l t y , t h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y sr e s e a r c ha l s o o b v i o u s l yr e l a t i v e l yf a l l sb e h i n do t h e rf r u i tt r e e sd e v e l o p m e n t t h e r e f o r e ，t h e e s t a b l i s h m e n ta n dt h ec o n s u m m a t i o ne f f e c t i v e g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n r e g e n e r a t i o ns y s t e mb e c o m e st h ed e v e l o p m e n td r u p e sf r u i tt r e ei n t h i sa r e a r e s e a r c hk e y s i n c el o n g ，t h ed o m e s t i ca n df o r e i g ns e v e r a ll a b o r a t o r i e sh a v e d e v o t e dt ot h i sa s p e c tr e s e a r c h ，a n dh a so b t a i n e dc e r t a i nr e s e a r c hr e s u l t s a l l s o r t so fs i g n si n d i c a t e dt h a tt h ed r u p e sf r u i tt r e e ( a s e x u a lm a t e r i a l ) t h eg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n h i g h l y e f f i c i e n t r e g e n e r a t i o nt e c h n o l o g y w i l lm a k et h e b r e a k t h r o u 曲h o p e f u l l yi nt h en e a rf u t u r e t h ec h e r r yi sm i d d l eo n ey e a rm o s ti nt h em o r n i n gt h ec i t yf r u i t ，h a ss p r i n g t h ef r u i tf i r s tf i n er e p u t a t i o nv u l g a r l y i t sn u t r i t i o n a lv a l u ei sh i g h ，t h eu s ei s b r o a d b e s i d e st h ef r e s hf o o dm a ya l s om a k et h ed e s s e r t ，t h ew i n e - m a k i n g ，t o b eu s e da sm e d i c i n ea n ds oo nf u n c t i o n s t h es o u rc h e r r ya l s oh a sm o v e s b e n e f i t sw a sm a dt h a tr a i s e sf i n e s t o p sf l o w ss w i f t l ya n ds oo nn u t r i t i o u s f u n c t i o n i t s ，t h en u c l e u s ，t h ef r u i ta l lm a yb eu s e da sm e d i c i n e ，a l lt h r o u g h n o ta b a n d o n e d b e c a u s et h em u l t i - d i m e n s i o n a lp h e n o lc o m p o u n dc o n t e n ti s h i g h ，t h e r e f o r eh a st h eo b v i o u sa n t i c a n c e rt r e a t m e n t ，t h ea n t i - a r t e r i o s c l e r o s i s a n do t h e rc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e se f f e c t h o w e v e re a s yt oi n f e c tt h er o o t c a n c e ri nt h em i d d l eo ft r a n s p l a n t i n g ，h a sl i m i t e dt h i s f i n et r e es e e d s p r o m o t i o ng r e a t l y ，t h u se n h a n c e si t sr e s i s t a n c ei st h eg o a lw h i c ht h ep r e s e n t w i l ld e v e l o p t h et r a d i t i o n a lb r e e d i n gm e t h o dc y c l ei s l o n g ，b u tg e n e t i c e n g i n e e r i n gt os p e e du pi t sb r e e d i n ga d v a n c e m e n tt op r o v i d et h en e wm e t h o d b u tl a c k st h e h i g h l y e f f e c t i v e g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，a st h e e s t a b l i s h m e n tc h e r r yf i n eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，t h ep r e s e n tp a p e r t a k et h es o u rc h e r r ya st h em a t e r i a l ，t a k e so u t s i d ew i t ht h ee x s o m a t i z el e a f b l a d ep l a n t st h e b o d y ，h a se s t a b l i s h e d t h ee x s o m a t i z el e a fb l a d e h i g h f r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e m ；a n dl i e sb e t w e e nt h r o u g hr o o t c a n c e r a g r i c u l t u r eb a c i l l u sl e a d sf r o mo p t i m i z a t i o n g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n e a c h p a r a m e t e r ，h a se s t a b l i s h e dt h ee x s o m a t i z el e a fb l a d eh ig h l ye f f e c t i v eg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，i t sr e s u l ti sa sf o l l o w s ： 1 d e t e r m i n e st h es o u rc h e r r ye x s o m a t i z el e a fb l a d et h er e g e n e r a t i o ns y s t e m f r o mt h er e g e n e r a t i o nc u l t u r em e d i u m ，t h eh o r m o n ea l l o c a t e dp r o p o r t i o n ，t h e l e a fb l a d ep h y s i o l o g yc o n d i t i o n ，t h ec u l t u r em e d i u mt h ea g a r a g a ra m o u n t u s e d ，t h ed i f f e r e n tr a i s ev e s s e la n ds oo ns e v e r a la s p e c t st oa f f e c t e dt h e e x s o m a t i z el e a fb l a d eh i g h l ye f f i c i e n tr e g e n e r a t i o nt h ek e ya s p e c tt oc o n d u c t t h er e s e a r c h h a dd e t e r m i n e dt h ec a b - 6 pr e g e n e r a t i o nc u l t u r em e d i u mi s w p m ，t h eb e s th o r m o n ea l l o c a t e dp r o p o r t i o ni sb a2 m g l + i a a2 m g l ，l e a f b l a d e sb e s tp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o ns e n d so u tn e w l yf o rt h et e s tt u b es e e d l i n g c r o w ne x t r e m e l yy o u n gt e n d e r ，a n di sc l o s e su pt h ec o n d i t i o ny o u n gl e a f , t h e a g a r - a g a ru s ed e n s i t yi s4 5 9 l ，t h ee x s o m a t i z el e a f b l a d ei n d u c t i o nr e g e n e r a t i o nr a i s ev e s s e lr e g e n e r a t e st h ee f f e c tw i t ht h ew i d e m o u t hb o t t l et ob eb e s t 2 i ns o u rc h e r r yg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nt oa n t i b i o t i cr e s i s t a n c es e n s i t i v i t yt e s t r e s e a r c h e x a m i n e st h er e s e a r c ht oi n d i c a t et h a tt h ec a r dt h a tm i l d e we l e m e n t s s c r e e n i n gb e s td e n s i t ys h o u l db e4 0 m g 1 t h o u g h tt h a tt h es p o r ez u ol i n s o d i u mi st h ec a b - 6 pb e s tb a c t e r i o s t a s i sa n t i b i o t i c ，a n d i ss u i t a b l et h e d e n s i t ys c o p ei s5 0 0 m g l - 6 0 0 m g 1 3 s o u rc h e r r yg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m se s t a b l i s h m e n t t a k e st h ea c c e p t o rw i t ht h ea s e p t i cc a b 一6 pt e s tt u b es e e d l i n g se x s o m a t i z e l e a f b l a d e ，o p t i m i z e d t h e a g r i c u l t u r a lb a c i l l u s t ol i eb e t w e e nl e a d s t r a n s f o r m e d s y s t e m sm a n yp a r a m e t e r s ：a s 0 5 1 0 a g r i c u l t u r a l b a c i l l u s v a c c i n ei n v a d e sd y e s10 m i na l t o g e t h e rr a i s e sa f t e ro d 6 0 0f o r3 d a y s ，c a n o b t a i ng u sr a t er e a c h e sa sh i g ha sa b o v e8 0 4 t h i se x p e r i m e n ta l s of u r t h e rs t u d i e dh a ss c r e e n e d ，d e t e n t i o ns c r e e n i n g ，t h e g r a d i e n tt os c r e e nt h r e ek i n d o fs e l e c t o rm o d ea n t a g o n i s mb u di m m e d i a t e l y t h ep e r c e n t a g ea n dt h ec o n v e r s i o nr a t e i n f l u e n c e ，o b t a i n e dt h e g r a d i e n t s c r e e n i n gc o n v e r s i o nr a t ei s1 2 i st h i st r a n s f o r m e ds y s t e mb e s ts c r e e n i n g w a y m o r e o v e r ，a si sa l s oag e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nk e yi n f l u e n c i n gf a c t o r t h i se x p e r i m e n t a ls t u d yi n d i c a t e dt h a ti na l t o g e t h e rr a i s e st h ec u l t u r em e d i u m a n di nt h ea g r i c u l t u r a lb a c i l l u ss u s p e n d i n gl i q u i ds i m u l t a n e o u s l yj o i n st h e d e n s i t yi s2 0 m g la sm a ye n h a n c et h er e s i s t a n tb u dr a t e 5 i n c r e a s e st h ea n a l y s ist h r o u g hp c r ，p r o v e di n i t i a l l yt h ee x o g e n o u sg e n e a l r e a d yc h a n g e do v e rt os o u rc h e r r yc a b 一6 p k e yw o r d ：s o u rc h e r r y ；e x s o m a t i z el e 可b l a d e ；r e g e n e r a t i o n ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ；r o o t c a n c e ra g r i c u l t u r eb a c i l l u s dire c t e db y ：pr o f lixia o y a n a p p i ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：g a oxiy e ( f r u i tt r e e sp h y s i o l o g y ) ( a g r i c u l t u r eb o t a n i s t i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y h o h h o t0 10 0 1 8 c h i n a ) 插图和附表清单 表1核果类果树转化的目的基因与受体系统4 表2试验中所用的主要培养基15 表3试验中所有的菌株和质粒15 表4不同激素配比对c a b - 6 p 离体叶片诱导再生不定芽的影响2 0 表5不同类型的再生培养基对c a b 6 p 离体叶片诱导再生不定芽的影 响2 1 表6叶片生理状态对c a b 6 p 离体叶片诱导再生不定芽的影响2 1 图1 2培养基中琼脂用量对c a b 6 p 离体叶片诱导再生不定芽的影响 2 2 表7不同培养容器对c a b 6 p 离体叶片诱导再生不定芽的影响2 3 表8不同抗生素对c a b 6 p 不定芽产生的影响2 4 表9 不同抗生素对c a b 6 p 不定根产生的影响2 6 表l0农杆菌侵染浓度对转化率的影响2 7 表1 1农杆菌侵染时间对转化率的影响2 7 表l2共培养时间对转化的影响2 8 表1 3预培养时间对转化的影响2 8 表1 4k a n 梯度筛选对遗传转化的影响2 9 表15a s 的浓度与添加方式对遗传转化的影响3 0 图3a s 的浓度与添加方式对c a b 6 p 遗传转化的影响3 0 表16延迟选择对遗传转化的影响3 l 图4g u s 基因的顺时表达3 2 图5p c r 分析图3 2 培养基选择图片组合2 4 6 遗传转化抗性芽筛选图片组合3 4 7 g u s + 染色图片组合4 4 7 g u s + 染色图片组合5 4 7 p c r 扩增分析图5 4 8 缩略语表 6 一b a b e n z y l a d e n i n e6 一苄氨基腺嘌呤 l h n a a i a a i b a ， t d z c e f k a n c a r b a s g u s n p t i i m s w p m q l d k w x 。g l u c l a c t a b u m i nh y d r o l y s a t e n a p h t h a a c e t i ca c i d i n d 0 1 e 一3 一a c e t i ca c i d i n d o l e - 3 一b u t y r i ca c i d p h e n y l 一3 一( 1 ，2 ，3 一t h i a z o l 一5 一y l ) u r e a c e f o t a x i m e k a n a m y cih u m c a r b e n i c i l l i n a c e t o s y r i n g o n e b e t a g l t l c u r o n i d a s e n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s ei i m u r a s h ig e s k o o g w o o d yp l a n tm e d i t i m q u o i r i n l e p o i v r em e d i t i mw i t hv i t a m i n s d k w j u g a r t s m e d i u m v i t hv i t a m i n s b 一 新 水解乳蛋白 萘乙酸 吲哚3 一乙酸 吲哚3 一丁酸 重氮苯基腺 头孢霉素 卡那霉素 羧苄青霉素 乙酰丁香酮 萄糖苷酸酶 素磷酸转移 酶 培养基 木本植物培养基 培养基 培养基 5 一b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d 0 1 y 1 一d g a l a c t o s i d e5 一溴一4 一氯一3 一眄i 哚一b 一半乳糖苷 y e b a g r o b a c t e r i u mg r o w t hm e d i u m 农杆菌培养基 噻 葡霉 实验药 y e b a g r o b a c t e r i u mg r o w t hm e d i u m 口 口口 0 主 ，同单 上海生工生物工程有限 公司 琼脂粉 q l c h e m i c a lr e a g e n t 天津市珠江卫生材料厂 q u o ir i n l e p o iv r em e d i t i mw i t hv it a m in上海生工生物工程有限 公司 d k w d k w j u 9 1 a n s m e d i u mw i t hv i t a m i n s a s k a n c e f c a r b t d z l h a c e t o s y r i n g o n e k a n a m y ci n u f l l c e f o t a x i m e c a r b e n i c i l l i n 上海生工生物工程有限 公司 b i ob a s i ci n c 中国药品生物制品检定 所 上海新亚药业有限公司 上海四药股份有限公司 卜p h e n y 卜3 一( 1 ，2 ，3 - t h i a z o l - 5 - y l ) u r e a西北植物所赠 l a c t a l b u m i nh y d r 0 1 y s a t e 6 b a b e n z y l a d e n i n e i b a i a a i n d 0 1 e b u t y r i ea c i d i n d 0 1 e 一3 一a c e t i ca c i d n a a n a p h t h a l a c e ti ca c i d 北京奥博星生物技术责 任有限公司 中国科学院上海生物化 学研究所 上海化学试剂站分装厂 北京欣经科生物技术有 限公司 上海化学试剂站 x g l u c5 一b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d 0 1 y l d g a l a c t o s i d eb 1 0 b a s i ci n c 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢阿 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：盅蠡堕日期- 二兰篮：弓 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业高校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：禹墨塑 指导教师签名：垄乙毽垒 日 内蒙古农业大学硕士学位论文1 1 引言 1 1植物遗传转化概述 植物遗传转化是指利用分子生物学和植物基因工程原理和技术，将外 源d n a 片段( 基因) 插入到受体植物的基因组中，改变植物的遗传特性， 并使外源d n a 在受体中稳定表达和遗传，以达到改良植物的某些性状或研 究基因功能的目的。它同传统的育种方法相比较具有以下的特点：( 1 ) 在 分子水平上改造植物的遗传物质，更具有科学性和精确性。( 2 ) 定向改造 植物遗传性状，提高了育种的目的性和可操作性。( 3 ) 打破了物种之间的生 殖隔离障碍，实现了基因在自然界的公用性，丰富了基因资源，19 7 7 年 根癌农杆菌t i 质粒的发现为植物遗传转化奠定了基础。l9 8 3 年利用ti 质粒转化烟草并成功地获得了第一株转基因植株，19 8 5 年h o r s c h 等人创 立了叶盘转化法，使农杆菌t i 质粒转化过程大为简化1 。短短二十多年地 发展，植物遗传转化已经取得了巨大地进展，获得了一大批转基因植株。 目前转基因成功的植物种类已经达到2 0 0 多种，其中农杆菌转化成功的植 物已经达到1 16 种；有近千例的转基因植物被批准进入田间试验。其目 标性状包括抗除草剂、抗病虫、抗逆、品质改良、雄性不育以及利用植物 作为生物反应器生产具有医用价值的糖类、蛋白质和多肽等。近年来， 全世界农业生物技术产业取得了巨大的发展。到1 9 9 7 年底，全球已有12 多种作物的4 8 类转基因植物产品获准进行商品化生产，转基因作物的种 植面积迅速扩大。据统计l9 9 8 和1 9 9 9 年度，转基因农作物的推广面积增 加了2 7 8 0 万h 时和3 9 9 0 万hm 2 。预计在今后的5 年内全世界转基因作物 的推广面积将会有更大幅度的增加。世界银行预测，世界范围内转基因作 物产业的交易额在2 0 0 5 年将会达到6 0 亿美元，2 0 10 年将达到2 0 0 亿美元， 以每5 年3 倍的速度递增。在全球范围内以植物基因工程为核心的农业生 物技术产业已形成。 植物遗传转化包括含许多重要的技术环节。基因克隆技术、d n a 重组 技术和基因表达调控技术等现代分子生物学操作技术是植物基因工程的前 提；植物组织培养是基因工程的基础；外源基因的导入技术是基因工程的 必要手段。经过二十多年的探索磨砺和优胜劣汰，植物基因转化技术日趋 成熟，已经形成了根癌农杆菌t i 质粒介导的基因转化系统、发根农杆菌 r i 质粒载体转化系统、植物病原载体介导的转化系统、种质系统介导的基 因转化以及d n a 直接转化系统等多种转化系统。其中t i 质粒介导的基因转 化系统和以基因枪法为主的d n a 直接转化系统是应用得最多的两大植物基 因转化系统。这两种转化系统机理比较清晰、证据比较充分、成功的例子 较多，约占已获转基因植物的9 0 。t i 质粒介导的遗传转化系统主要 2根癌农杆菌介导的酸樱桃离体叶片高效遗传转化体系的建立 用于双子叶植物。由于单子叶植物尤其是重要的禾谷类作物不易受农杆菌 侵染，因此单子叶植物遗传转化多采用基因枪法。 目前不同物种的转基因研究进展不同，主要原因是有些物种的组织培 养和植株再生困难，以及建立高效的遗传转化体系比较难。在全世界植物 遗传转化的浪潮中，木本植物的遗传转化研究进展缓慢，其中一个重要原 因是木本植物组织培养和植株再生的难度较大，缺乏合适的转化受体材料， 难以建立高效稳定的遗传转化体系。 核果类果树主要包括桃、李、杏、扁桃、樱桃等，在植物分类上属于 蔷薇科( g o s a c e a e ) 李属( 厅u b u sl ) 植物，在果树生产中占有相当重要的地 位。长期以来，核果类果树一直被国内外同行公认为是最难进行离体( 无性 材料) 再生的一类树种，大家在这方面曾经尝试做过大量实验研究，但成效 甚微。核果类果树由于其自身的离体再生困难等问题，基因工程技术的研 究也明显地相对落后于其它果树的发展。因此，建立和完善有效的遗传转 化再生系统就成为开展核果类果树在这一领域研究的关键。长期以来，国 内外的几个实验室一直致力于这方面的研究，并取得了一定的研究成果。 种种迹象表明，核果类果树( 无性材料) 遗传转化高效再生技术有望在近期 取得突破。 1 2 + 核果类果树遗传转化的研究进展 1 2 1 核果类果树遗传转化研究的意义 当前，植物基因工程在农业科学领域开展的如火如荼，从植物、微生 物等材料中克隆获得的功能基因数量每年都在以几何数字增加。并且随着 国际上各类植物基因组计划的陆续展开，可以预料人们可以利用的植物功 能基因数量将是非常庞大可观的，植物基因工程在未来的农业生产中将会 发挥出极其重要的作用。特别是在我国这样的农业生产力水平相对较低的 农业人口大国，面对着人口众多、资源短缺、耕地缺乏、生产生态条件日 益恶劣、效益衰减等日益突出的问题，加速开展植物基因工程领域的研究 更具有极其重要的现实意义。核果类果树作为果树中的一大类群，在果树 生产中占有相当重要的地位。而作为栽培历史久远的一大类果树，同时在 农业生产中也面临着许多日益突出的迫切需要解决的生产实际问题，如病 虫害严重( 尤其是病毒病) 、抗逆境能力差、树体生长习性和果实品质尚需 改良和提高等。这些问题的解决，如果仅仅依靠传统的果树常规育种技术 与方法是很难以在短期内实现的，传统的果树常规育种技术与方法不仅周 期长、时效慢，而且效果也不是很理想。植物基因工程的发展则为这些问 题的妥善解决提供了一种全新的并且是可靠的技术支持系统。 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 核果类果树由于组培离体再生困难等问题，植物基因工程技术的研究 明显地相对落后于其它果树的发展。近几年，国内外的几个实验室已开始 尝试在核果类果树上开展基因工程的研究工作，但由于离体再生问题，绝 大多数的研究工作局限在种子等有性材料上。随着研究工作的积累和深入， 人们对影响再生的各类因子开始有了进一步的了解和认识。特别是近年来， 通过对各类再生因子的优化组合，人们已经开始尝试在扁桃、樱桃的无性 材料上获得转基因植株。尽管研究工作还很初步，但这些实验中所揭示的 信息也为我们更深入地认识和开展核果类果树基因工程研究提供了很好的 参考。因此，核果类果树遗传转化的研究大有广阔的领域与空间，植物基 因工程的研究与发展也应该在核果类果树上有较大的开发领域。今后加强 核果类果树转基因技术的研究与大力开发核果类经济树种的改良与通过基 因工程培育优良性状新品种的选育成为这一领域研究工作的的主要目标， 同时开发新的目的基因也是植物基因工程的一项艰巨的任务，加强新的目 的基因在核果类果树上的应用也是又一大技术难题。 随着果树分子生物学和生物技术的飞速发展，我们坚信转基因技术 必将在核果类果树育种中发挥巨大作用，展示光明前景。 1 2 2核果类果树转化的目的基因与受体系统 植物组织培养是遗传转化的基础，核果类果树的组织培养由于其外植 体在培养初期的褐变、脱分化困难以及诱导生根困难等因素落后于草本植 物，但经过多年的努力，核果类的组织培养已经取得了巨大的进步，多种 品种组织培养已经取得成功，其中有通过愈伤、胚状体、直接分化等途径 产生再生的植株。 目前主要有两种受体系统被用于核果类果树的遗传转化：直接分化再 生系统和体细胞胚发生系统。直接分化再生系统是由于外植体直接分化出 不定芽而获得再生植株的再生系统。该系统具有获得再生植株的周期短， 操作简单，无性系变异小，转化的基因能实现稳定遗传等优点。特别是茎 尖分生细胞建立的直接再生系统，其遗传稳定性更佳。但该系统存在嵌合 体较多，转化频率低等缺点。在核果类果树上，下胚轴、子叶、成熟叶片 和茎段通常被用作转化的受体材料，例如欧洲李、杏、酸樱桃、甜樱桃等 ( 见表1 ) 。 体细胞胚发生是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的情况下， 模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育成一个新个体的形态发生过程。用 该再生系统作为植物遗传转化的受体系统，其特点是产生嵌合体少。在核果 类果树中用此受体系统成功转化的有桃、甜樱桃等( 见表1 ) 。 4 根癌农杆菌介导的酸樱桃离体叶片高效遗传转化体系的建立 果树种类目的基因受体系统转化特性 1 2 3核果类果树遗传转化的方法 尽管遗传转化有近十种方法，但目前用于核果类转化的方法主要有； 农杆菌介导法与基因枪法。其中农杆菌介导成功应用较多。果树中第一例 成功导入外源基因获得转基因植株是通过农杆菌介导法转化的。 随后在许多果树上都进行了农杆菌介导的基因转化研究。目前，通过 农杆菌介导法，已经获得了桃、欧洲李和杏的转基因植株，并建立起这3 个树种的转化系统，还把番木瓜环斑病( p r v ) 的外壳蛋白( c p ) 基因导入 欧洲李，把洋李痘病毒( p p v ) 的外壳蛋白( c p ) 基因导入杏。农杆菌介导 的转化过程是把t i 或r i 质粒的t - d n a 片段转移到植物的核基因组，此方 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 法的转化效率受以下几个方面因素的影响：农杆菌有效转化外植体的能 力与细菌菌株对转化频率的影响很大，在核果类果树上最常用的ti 质粒菌 株为l b a 4 4 0 4 、e h a l0 5 、e h a l0l ，也常用3 2 8 ：t n 5 、a l3 6 c 5 812 7 0 7 ，而常用 的r i ( 发根农杆菌菌株) 则是1 8 55 n c p p b 和a t c c l5 8 3 4 ，外植体和农杆菌共 培养时间一般为2 3 天，共培养后必须向培养基中加入抗生素( 如：羧苄 霉素、头孢霉素) 来抑制细菌的生长，共培养后除菌最关键；对转化细 胞的选择，常用卡那霉素，因为核果类的大多树种对卡那霉素高度敏感， 卡那霉素的浓度一般在5 0 l o o u g m l ，卡那霉素的浓度和加入时间应根据 外植体和物种的不同而进行预先试验转化细胞能否高效地再生是转化的 主要问题，并受所用组织的影响，核果类果树再生尤其困难，导入的外 源d n a ，在植物基因组中的稳定性避免外源基因的瞬时表达和形成嵌合体。 基因枪法也是核果类果树遗传转化的常用方法之一。基因枪微弹轰击 法可用于任何植物组织的转化，而且报告基因的瞬时表达便于分析基因表 达的组织特异性，但获得稳定转化的频率较低，用此方法转化分生组织， 在核果类果树中获得嵌合体，桃遗传转化曾尝试用基因枪法叫引，y e 用基因枪轰击桃为成熟胚、胚轴、茎尖、叶片和长期胚性