（植物学专业论文）逆境胁迫下拟南芥sen1基因的时空表达研究.pdf

致谢 本论文是在导师吴平教授的悉心指导下完成的。论文从选题、方案制定、 实施到结果分析和撰写，每一个细节都凝结着导师的心血和智慧。三年来导师在 学业上给我以精心的指导，在生活上对我的关心和帮助，这些将使我终生受益。 导师身上所表现出的对科学事业的执着追求、开拓创新的精神，对科学前沿的敏 锐洞察力，以及积极进取的生活态度值得我永远学习。值此论文完成之际，谨向 尊敬的导卿致以衷心的感谢! 在论文完成过程中，候兴亮、姜华武博士、佃蔚敏等同学提供了大量的指 导和帮助，在此对他们表示深深的谢意。此外要感谢易可可老师、李靖老师、刘 非燕老师、吴运荣老师、陈汉民老师、王首锋老师、陈双燕、周洁、张帆、齐晓 朋、党磊、莫肖蓉、林欣大、焦芳婵等老师同学，论文工作的顺利完成得益于他 们在工作和生活上给我的老师般的指导和朋友般的关心和帮助。汤海呖老师也给 了我诸多帮助和关心，在此致以诚挚的感谢。 感谢研究生期间沈翊、朱凌、宋昕蔚、徐敏、汪少敏、何晓薇、王珊珊、韩 秋敏、于杰、毛传藻、吴忠氏、金维正、刘洪家、王首锋、朱世华、严成其、贾 巧召、林涛、缪岩松、杜黎明、段瑞君、张麝龙、王明怡、王芳、樊叶扬、储俊、 ：f 学敏、杨益、余晓波、王栩鸣及实验室的所有其他师兄弟姐妹们对我的热心支 持和无私帮助，和我一起渡过了人生中真正难忘的时光。 感谢我的家人和朋友对我的理解和支持! 略缩语表 缩写词英文名 a b a 6 一b a b o c o r c r t d r e g u s a b s c i s i ca c i d 6 书e n 珂l a d e n i n e b a s ep a i r c 0 1 d - r e g u l a t e d 中文名 脱落酸 6 卡基腺嘌呤 碱基对 冷调控相关的 c 端重复型 d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e n t 脱水反应元件 3 一g l u c u r o n i d a s 。 b d 葡糖醛酸萜苷酶 m a p k m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e促细胞分裂蛋白激酶途径 n a a p c d r d a n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i da 一萘乙酸 p r o g r a m m e d c e l ld e a m细胞程序性死亡 = e s p o n s i v e t od e s s i c a t i o n干旱反应相关的 s a g ss e n e s c e n c ea s s o c i a t e dg e n e s 衰老相关基因 s i r k s o s s s g 8 as e n e s c e n c e i n d u c e dr e c e p t o r 1 i k ek i n a s e受衰老诱导的类似受体激酶 盐份超敏感 s e n e s c e n c e s p e c i f i cg e n e s 衰老特定基因 第一章文献综述 植物衰老与环境胁迫 1 植物衰老 植物衰老，是生物界存在的普遍现象。植物由衰老致死亡，是自然规律，是 植物生命科学研究的核心问题之一。早在1 9 7 8 年，t h i m a n n 提出，衰老是导致植 物自然死亡的一系列衰退过程，是成熟细胞有序降解最终导致死亡的过程 ( t h i m a n n ，1 9 7 8 ) 。1 9 9 3 年r o a c h 补充，衰老是随着年龄的增长，生存与生殖能力 降低的过程( r o a c h 等，1 9 9 3 ) 。n 0 0 d e n 等人进一步补充，认为衰老是植物个体内 部程序性的导致死亡的降解过程，是可以发生于不同的组织并行使不同功能的发 育过程( n o o d e n 等，1 9 9 7 ) 。衰老可以发生在整株植物水平上，也可以发生在器官 或细胞水平上。就作物来说，把在植株生长发育过程中，植株或某些器官中发生 导致生命活动自然终止的败坏过程叫作衰老的现象。认识到衰老的原因，推迟衰 老的丌始日期，延续衰老进程，防止早衰( 非正常衰老) 的发生，对于提高作物 的光合生产量和籽粒产量具有重要的意义。 衰老是一一种器官或组织逐步走向功能衰退和死亡的变化过程，在这段时期 内，植物在成熟叶中积累的物质，包括大量的氮、碳有机化合物和矿物质，被分 解并运送至植物其它生长旺盛的部位。植物在长期进化和适应环境的基础上选择 性地使某些细胞、组织和器官有序死亡，是其生长发育生存的一个主要特征。因 为植物体自身起始和执行死亡过程，故广义上称之为程序化死亡( p r o 掣跗皿e d c e l ld e a t h p c d ) 。植物p c d 是指整个原生质( 有细胞壁或无细胞壁) 在植物某 个牛命时期主动撤退、消化的过程，它在去除不需要的细胞质或整个细胞时主要 通过以下杌制：自溶、裂解和木质化过程。而植物衰老是在植物生长发育的最后 阶段导致许多细胞与器官自然程序化死亡、主动的生理过程，既受核基因控制又 受各种环境因子影响( 王亚琴等，2 0 0 3 ) 。 植物有两种类型的衰老：复制时( 有丝分裂) 衰老和有丝分裂后衰老( g a n 等，1 9 9 7 ) 。细胞复制时衰老是指在成熟过程中细胞进一步分裂能力的丧失：有 丝分裂后衰老发生在细胞成熟或分化过程中，最终导致细胞死亡。大部分叶衰老 是有丝分裂后衰老，其伴随着叶器官水平衰老。 1 1 叶的衰老 植物衰老研究最多的就是叶衰老。叶片衰老是叶片发育的最后阶段，是依赖 于年龄的进程，也可以被各种环境条件所诱导( n 0 0 d e n 等，1 9 9 7 ：g a n 等，1 9 9 5 ， 1 9 9 7 ) 。分子遗传学的分析表明，叶片衰老是一个由很多生理变化和分子事件组 成的复杂过程，n o o d e n 等人( 1 9 9 7 ) 提出三段式理论，把叶片衰老分为起始 ( i n i t i a t i o n ) 、衰退( d e g e n e r a t i o n ) 和终末( t e r n l i n a l ) 三个阶段来分析叶片衰老 的分子机制。 111 叶衰老的变化 很多关于叶衰老生理、生化、分子方面的研究显示，叶衰老伴随着细胞结构、 新陈代谢、基因表达的变化( n o o d e n ，1 9 8 8 ；n 锄，1 9 9 7 ：g a n 等，1 9 9 7 ) 。 在结构上，最早发生、最重要的细胞结构变化是叶绿体被破坏，导致叶色由 绿变黄、脱落。叶具有细胞水平上独特的衰老方式，一些研究表明，在衰老过程 中，叫1 细胞只限于亚细胞结构的变化( t h o m s o n 和p 1 a t t a l o i a ，1 9 8 7 ) 。例如，首先 丧失叶绿体的完整性，而核结构被破坏则相对较晚，可能用于保持营养物质循环 过程顺利进行。 代谢方面，叶衰老不是一种简单的降解过程，而是营养物质的循环利用过程， 十绿素和大分子( 如蛋白、膜脂和r n a ) 的同化作用被异化作用代替，如蛋白 质含量下降，光合磷酸化能力降低，膜脂过氧化加剧，游离氨基酸积累等。许多 大分子物质如蛋白质、膜脂、r n a 等降解形成的氮素等营养物质从老化细胞转 移至嫩叶、发育中的种子或者库器官中，加以重新利用和储存。叶的这种衰老方 式可以解释在许多物种中一种现象：维管系统周围用于营养运输的器官最后衰 老。 在分子水平上，这些变化会导致某些基因表达的改变。 1 1 2 其它器官对叶片衰老的影响 诸多研究表明，连体和离体条件下，叶片的衰老过程是不同的( b e c k e r 等， 1 9 9 3 ；t h i m a n n 等，1 9 8 0 ) 。其主要原因是连体情况下叶片与其它器官( 如根、 茎、花、果实、种子等) 之间有密切的物质、能量、信息的交流和功能的协调， 这对叶片衰老有重大影响。c r a 丘s 等( 1 9 8 8 ) 用不同衰老特性的烟草( n i c o t i a n a t a b a c u m ) 进行叶嫁接试验，把早衰型叶片嫁接到晚衰型梗上，叶片叶绿素含量 ( c h l ) 下降，c 0 2 交换速率和1 ，5 一二磷酸核酮糖羧化力氧酶( r 曲i s c o ) 下降 均延迟，两晚衰型叶片嫁接到早衰型的梗上，叶片衰老速度变化不明显，表明叶 片衰老受其它部分的影响。 1 1 2 1 根对叶片衰老的影响 不同叶片衰老类型的高粱( s o 唱h u m 1 9 a r ep e r s ) 的根系差异很大，在叶 午衰老时，衰老型根系密度及占土壤的体积大大降低，而非衰老型只略有降低。 根系生长受限制或处于逆境时，往往加速叶片衰老。n e s m i t l l 等( 】9 9 2 ) 用不同 容积笳栽限制青椒( c a 口s i c u m 黜u u m ) 根的生长，生长后期叶面积、叶片光合 作用与容器体积里正相关，叶片衰老因根限制明显提前和加剧。根系淹水、干旱、 高温、营养胁迫等不良条件下，叶片衰老提早和加快是常见现象( c a r e r s 等， 1 9 8 5 ) 。 促进生根和提高根系活力往往延缓叶片衰老。m o l i s h ( 1 9 3 8 ) 早期的工作就 发现生根延长离体叶片的寿命，生根早的扦插枝条叶片返青快，雨不生根的很快 衰老死亡。卢敏华等( 1 9 8 5 ) 把棉花( g o s s y p i 啪1 1 i r s u t u m ) 叶片离体培养时， 发根能力毛叶片衰老密切相关。m a r e k 等( 1 9 9 2 ) 把大豆( g l y c i n em a x ) 幼苗上 的叶片切离体衰老1 8 天后复原，叶片c h l 、光合速率、r u b i s c o 均可恢复到 正常生长幼苗中的水平，表明根系有逆转叶片衰老的物质。 “根深叶茂”，根系在叶片衰老和整株衰老中可能起着至关重要的作用，植株 的异常衰老往往是由于根系衰退所致，但限于研究手段，这方面研究甚少。 1 1 2 2 生殖器官对叶片衰老的影响 众多实验表明叶片的衰老受生殖或储藏器官发育和充实的影响。多年生的竹 子一旦开花，枝叶就很快衰亡；田间生长的多数作物在开花及种子、果实成熟后， 叶片即大量衰老；而多年不开花结实的龙舌兰等植物，叶片可维持多年的生理活 性。在干晕诱导情况下，高梁不育系和可育系的幼苗叶片衰老进程相同，而成株 灌浆阶段，不育系的衰老比可育系要慢得多( 1 ( 1 1 籼a 等，1 9 8 8 ) 。干旱诱发羊茅 ( f e s t u c a 口r a t e n s i s ) 叶片衰老时，也观察到开花分蘖的衰老比不开花分蘖的衰老 要快的多( b i 雠m a n 等，1 9 8 8 ) 。用物理手段诱导水稻( o r y z as a t i v a ) 不育或不实， 可延缓灌浆和籽粒形成后期叶片的衰老。 8 1 1 2 3 茎对叶片衰老的影响 茎是叶片的着生器官，也是叶与根、花、果实等器官间物质运输和信息传递 的必由之路。茎被切断或受伤，阻断了叶片与其它器官的交流，对叶片衰老也有 重要影响：用蒸汽切断小麦基部茎，加速了叶片的衰老，而切断穗下茎却延缓了 14 片衰老( f r o l l l i c h 等，1 9 9 1 ) 。 茎对叶片衰老的影响还体现在主茎与侧枝上叶片衰老特性的差异和协调。棉 花和一些果树的主茎叶和果枝叶衰老是不完全相同的，果枝叶一般活性较高、寿 命较短、衰老快，不同节位的叶片生理活性衰老特性也有差异。 ! i 2 4 叶旨问的关系对时片衰老的影响 整株叶片的发育往往是各单叶生衰交错的过程，叶片集体承担整株同化物的 生产和供应，在大田条件下群体枝叶组成冠层，其结构及功能与产量密切相关。 一个或一部分叶片的衰老受其它叶片的影响，摘除幼叶往往延缓成年叶片的衰老 ( c r a f t ，1 9 9 2 ) ，去掉功能期的叶片则促进其它成年叶片的衰老，如去除小麦旗 卜下的其它茎生叶，加快了旗叶的衰老( g u i t m a n 等，1 9 9 1 ) 。 】2 植物衰老的调控 1 2 1 植物衰老相关的调控基因 1 - 2 1 1 衰老上游调控基因 植物的衰老伴随基因表达的变化。随着叶片衰老，一部分m r n a 数量减少或 消失，而另外一部分m r n a 则出现或数量增加。这说明叶片衰老过程中可能有一 些基因受至4 抑制而低水平表达，甚至完全不表达，而另一些基因则在衰老期间被 涛导激活，其表达增强。通过实验鉴定这些衰老相关基因，发现大多数基因的 m r n a 水平随叶片衰老而提高，即该基因的表达是上调的( u p f e g u l a t e d ) ，通常 称之为衰老相关基因( s e n e s c e n c e a s s o c i a t e dg e n e s ，s a g s ) 即衰老上调基因。至 今为止，已经从不同的物种中，分离出很多衰老相关基因，l o h m a l l 等于1 9 9 4 年 从拟南芥中获得了6 个衰老相关基因的c d n a ( s a g l 2 1 7 ) 克隆( l o h m a i l 等，1 9 9 4 ) ， b u c h a n a l l w o l l a s t o n 等从油菜叶中获得了几个与叶片衰老进程密切相关的c n d a 克隆( b u c h a n a n 、l l a s t o n 等，1 9 9 4 ) 。许多基因很有可能编码信号传导通路中的 关键组分，w r k y 转录因子家族的一些成员，就是重要的一类s a g s ，它们都有 一个6 0 a a 的保守区域( w r k y 结构域) ，可能与衰老相关( e u l g e m 等，2 0 0 0 ) ，如 9 爿f 珊刚巧3 和爿f 黝r 衄，6 。爿f 腑世 3 基因在叶衰老早期表达，而在后期表达量下 降，这说明它可能只在叶衰老早期起调控作用。4 r 删r k 在调控衰老和植物防 御反应过程受一些外源和内源信号的影响。已经找到一些与拟南芥4 f 删晰相互 作用的靶基因，包括钙调素相关基因和各种激酶例如跚k ( as e n e s c e n c e i n d u c e d r e c e p t o r l i k ek i n a s e ) ( r o b a t z e k 等，2 0 0 2 ) ，它编码一个叶衰老强烈表达的激酶受 体蛋白，此外，还有其它的下游靶蛋白如衰老相关蛋白s e n l ，茉莉酸调控蛋白 n a c 2 和谷胱甘肽转移酶( l i m 等，2 0 0 3 ) 。与跏胼目似的还有另一种从大豆中鉴 定出来的衰老相关类似受体激酶剐r k ( h a j o u 等，2 0 0 0 ) ，光照和细胞分裂素会 延迟剐r k 基因的表达，但黑暗和乙烯会促进删尼艘耋因的起始表达。这些基因和 激酶在与衰老相关的信号通路中可能会起到重要作用。 现已从8 种高等植物中克隆出了相应的衰老相关基因：水稻( g s l 基因、g s 2 基因) 、拟南芥( r n s 2 基因、s a g l 2 1 7 克隆) 、小麦( r n a s e 基因) 、萝h ( d i n l 摹冈) 、番茄( p 1 o m l 3 、p t o m 3 6 、p t o m 6 6 、p 1 1 0 m 7 5 、p t o m 9 6 、p 1 d m l 2 9 、 d t o m l 3 7 ) 、黄瓜( m s 基因) 、南瓜( 异柠檬酸裂解酶基因、苹果酸合成酶基 因) 、油菜( l s c 5 4 、l s c 9 4 、l s c 7 、l s c 9 9 、l s c 8 、l s c 2 8 ) ( 王亚琴等，2 0 0 2 ) 。 其中一类仅在衰老特定发育阶段表达的基因称为衰老特定基因 ( s e n e s c e n c e s p e c m cg e n e s ，s s g s ) ，它的m r n a 只有在叶片衰老时才能检测到， 如s a g l 2 、s a g l 3 ( b o r r e l l 等，1 9 9 7 ) 、l s c 5 4 ( b u c h a n a n w o i l a s t o n 等，1 9 9 4 ) ，其 中l s c 5 4 虽然是衰老特异的，但并不是叶片特异的，它们不仅在衰老的叶片中表 达，也在衰老的茎、花瓣、萼片、心皮等器官中表达( b u c h a n a n w 0 1 l 髂t o n 等，1 9 9 7 ) 。 另一类s a g s 在叶片生长初期就可检测到有低水平表达，衰老开始后表达量迅速 上升。 在已鉴定的s a g s 中，功能上有类与衰老细胞的保护机制有关 ( & 1 c h a n a n w 0 1 l a s t o n 等，1 9 9 7 ) ，如清除h 2 0 2 的过氧化氢酶( c a t ) s a g s ，防止 病原菌侵染的p r l a ( 病程相关蛋白) s a g s 。重金属结合蛋白s a g s 在叶片衰老过 程中除具有贮存、运输金属离子的功能外，很可能还具有保护核基因不受活性氧 损伤，使s a g s 准确表达的功能。a t p 硫酸化酶在a t p 作用下催化硫酸根转变成半 胱氨酸和蛋氨酸，半胱氨酸可进一步变为谷胱甘肽。谷胱甘肽既是硫的一种贮藏 分子，又是叶片衰老过程中大分子降解所释放的硫的运输分子，同时它还是一种 清除活性氧的小分予( d a v i e s 等，1 9 8 9 ) 1 2 12 衰老下游调控基因 随着衰老的进行，一些基因可能控制降解过程，如叶绿素被破坏，氮、脂类 的再动员每个基因也许仅仅影响随后发生的一部分衰老症状，但这些基因共同 作用可能也会引起大范围的衰老，如在大豆中就观察到这种现象( g “a m e t 等， 1 9 9 4 ，1 9 9 6 ) 。通过转基因方法可以研究这些基因的功能，酰基水解酶基因干涉的 转基因植物推迟了叶衰老的发生，而化学诱导该基因的超表达则会引起早衰( h e 等，2 0 0 2 ) 。转基因植物中衰老引起的脂肪酶水平被降低后也会延迟叶衰老 ( t h o m p s o n 等，2 0 0 0 ) 。在另一实验中，用降低了p l dq ( p h o s p h o l i p a s ed ) 活性 的转基因拟南芥来检测p u ) 与植物衰老的关系，结果发现a b a 和乙烯处理下离体 叶片衰老被延缓，而转基因拟i 自芥叶片中的离子浓度、光合作用效率、叶绿素和 磷脂含量龆仍然保持高水平( f a n 等，19 9 7 ) ，说明p l dd 的抑制并不影响植物生 k 发育，包括自然衰老。因此，推测在离体叶片中的p l d a 是植物激素引起衰老 的f f ，介物，而不是在自然衰老过程中起作用。 在衰老时为了维持细胞的正常活动必须让营养物质重新分布。细胞自我吞 噍，是一种发生在细胞内的细胞质与膜分离成空泡后被降解的过程，在营养物质 循环中需要这种自我吞噬，用以维持衰老植物的生存能力。一种拟南芥t d n a 插入突变体的插入位点位于自我吞噬基因( a 吣p g 8 和a 从p g 9 ) 上，它的叶衰老 现象发生更快，这就表明叶衰老需要这些蛋白来保持细胞的正常活性。如果没有 细胞自我吞噬，营养物质不能被有效利用，就会更快速地出现衰老症状( d o e l l i n g 等，2 0 0 2 ；h a n a o k a 等，2 0 0 2 ) 。 1 ，2 1 3 衰老的蛋白降解调控基因 最新拟南芥遗传研究发现调控蛋白降解可以控制叶衰老。o r e 9 突变体出现大 范酾内的衰老症状，但并不对其它生长发育方面产生不利影响( o h 等，1 9 9 7 ) 。 o r e 9 是一种含f _ b o x 模体的蛋白，是泛素( u b i q u i t i n ) e 3 连接酶复合体( w o o 等， 2 0 0 1 ) ，s c f 复合体是泛索特异性目标底物，会导致其后的蛋白水解( p a 札e m 等， 1 9 9 8 ) 。因此，o r e 9 以泛素蛋白水解途径降解了能延缓拟南芥叶衰老的蛋白( 如 s a g 的转录抑制子) ，从而缩短了叶的生命周期。o r e 9 也有可能是选择性降解自 我保护蛋白约受体。 的后代。在只有p s a g l 2 一g u s 转基因植株中，g u s 活性在衰老出现后的7 1 天里， 随着衰老的进程增加到最高水平，直到叶片干枯。在有p s a g l 2 i p t 的情况下， g u s 表达水平下降了10 0 0 倍，叶片寿命增加，衰老相应延迟。 相对于细胞分裂素对衰老的延缓作用，乙烯( e t h y l e n e ) 、甲基莱莉酸( m e t h v l j a s m o n a t e ) 、油莱索类固醇( b r a s s i n o s t e r o i d s ) 和水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ) 都己知 能促进衰老。早就已知乙烯是一种果实成熟和叶衰老的内源调节剂( b 1 e e c k e r 等，1 9 9 7 ；y a n g ，1 9 8 7 ) 。利用转基因技术发现，在衰老过程中乙烯合成水平发生 了改变，例如，成熟或腐烂时的转基因西红柿a c c 脱氢酶( 1 锄i n o c y c l o p r o p a n e 一1 一c a r b o x v l i c a c i dd e a m i n a s e ) 的表达严重迟滞( k l e e 等，1 9 9 1 ) 。 2 营养和逆境胁迫与植物衰老 2 1 逆境胁迫 逆境是指使植物产生伤害的环境，如寒冷、冰冻、炎热、于旱、盐渍等，这 些逆境作用于植物，使植物形成水分胁迫，细胞脱水，膜系统受害，透性加大。 任何逆境都会使光合速率下降，同化物形成减少，因为组织缺水引起气孔关闭， 叶绿体受伤、有关光合过程的酶失活或变性。 2 1 1 盐和渗透胁迫 盐和渗透胁迫会影响植物生理和代谢的各个方面，并致使植物产生大量变 化，包括适应性的一些变化和胁迫伤害下的病态症状：( 1 ) 生理干旱，水势降 低，吸水困难；( 2 ) 离子的毒害作用，产生单赫毒害，抑制生长；( 3 ) 生理代 谢紊乱，质膜透性增大，蛋白质水解加快，氨基酸与氨积累，光合与呼吸变化。 对于自然界植物来说，丧失一部分结构成份是对胁迫的一种适应性策略。植 物适应性的反应可以分为三个方面：盐胁迫和渗透胁迫下的动态平衡或者渗透调 节：胁迫调控和修复或解毒；生长调控( z h u ，j k 2 0 0 1 ) 。因此，盐和渗透胁迫 信号在功能上可以相应地分为三类( 图3 ) ：用于细胞动态平衡和重建的离子及渗 透压信号；用于调控和修复胁迫损害的解毒信号；用于适应特殊胁迫条件而产生 的细胞分裂、膨胀水平调节信号。动态平衡信号负调控解毒响应信号，因为细胞 动态平衡的建立，将会减少胁迫造成的伤害，但是动态平衡无法建立将会加重胁 迫产生的损伤。动态平衡和解毒信号能导致植物产生胁迫抗性，植物的胁迫抗性 可能会负调节生长抑制反应，或者会减轻生长抑制( z h uj k ，2 0 0 2 ) 。 隔而一 i o m u g m i l j 图3 盐和渗透胁迫信号的功能划分( z h u “，2 0 0 2 ) 仅仅知道信号途径的组成和原理是不够的( x i o n g 和z h u ，2 0 0 1 ) ，还应了 解整条途径中信号精确的输入和输出。在盐胁迫中有条建立在s o s ( s a l t o v e r l v s e n s i t i v e ，盐份超敏感) 基因上的信号途径。s 0 s 途径的输入信号可能是细胞内 外的过量n a + 引发了细胞质中c a + 信号( z h uj k ，2 0 0 0 ) ，输出是指改变了n a + 、 k 十、h + 等离子转运体的表达和活性。渗透胁迫的输入信号可能是细胞组织膨胀 性的变化，一些不依赖于s o s 的蛋白激酶在渗透胁迫信号中起中介作用。其输出 信号却并不清楚( z h u ，j k ，2 0 0 1 ) ，可能包括基因表达、渗透相关生物合成酶的 激活及水份转运体系。盐或渗透胁迫诱导的其它大多数变化被认为是解毒信号的 一部分，包括：( a ) 磷脂水解；( b ) 脱水型基因、分子伴娘和去除变性蛋白后蛋 白酶表达的改变；( c ) 酶激活。解毒途径中的输入信号可能大多数不是离子或渗 透压变化，而是胁迫伤害后的产物，或者是变性蛋白。 2 1 2 冷胁迫 冷胁迫对植物的伤害主要表现在以下几个方面：( 1 ) 呼吸代谢失调。对于 轻微冷害的损伤，若能及时回复到正常温度下，则可使呼吸恢复到原来的水平； ( 2 ) 刺激乙烯生成。进一步研究表明在乙烯生物合成途径中，低温加速了s a m 向a c c 方向转化的反应进程，能明显提高参与此反应的a c c 合成酶的活性：( 3 ) 对物质代谢产生的影响。据分析，低温不仅降低了组织对碳水化合物的利用率， 同时也加速了淀粉向可溶性糖方向的水解作用并诱导了转化酶催化蔗糖向还原 糖的转化。在冷胁迫下，对冷害敏感的组织细胞中蛋白质降解速率大大超过了合 成速率，造成蛋白质匮乏和有毒物质的积累，同时，许多与膜相连的酶系在冷害 卧 、 温度下也发生了急剧变化：( 4 ) 有毒物质的积累。冷胁追下细胞产生的有毒物 质包括无氧呼吸产物、异常n 一代谢产物和过氧化产物等。毒物是否造成伤害，关 键取决于其积累量。 21 - 3 非生物胁迫信号的可能感应元件 三种胁迫都能短暂诱导c 矿流入细胞质中( k n i g h t ，2 0 0 0 ：s a n d e r s 等，1 9 9 9 ) ， 因此，c 矿通道可能是胁迫信号感应元件之一。冷胁迫激活c a 2 + 通道可能由于细 胞结构的物理改变，这可以解释为什么冷诱导植物体中c a 2 + 流入仅仅当温度迅速 f 降时发生( p l i e t h 等，1 9 9 9 ) ，为什么膜流动性和细胞支架在冷胁迫刚开始时重 新组织( 6 “a r 等，2 0 0 0 ；s a l l g w a n 等，2 0 0 l ：w a n g 等，2 0 0 1 ) 。低温的另一种膜蛋自 感应元件是由双组份的组氨酸激酶( t w o c o m p o n e n th i s t i d i n e ) 。有证据显示，藻 表菌组氨酸激酶h i k 3 3 ( s u z u k i 等，2 0 0 0 ) 和枯草杆菌组氨酸激酶d e s k ( a 趴i l a r 等，2 0 0 1 ) 是一种热敏元件，在温度下降时能调节去饱和酶基因的表达。拟南芥 基因组中也确定了几个假定的双组份组氨酸激酶( u r a o 等，2 0 0 0 ) ，但没有证据证 明这些组氨酸激酶是否真的是热敏元件。 在植物中，冷、早、盐都能刺激相应的渗透剂( o s m o l y t c s ) 和抗氧化剂 ( a n t i o x i d a n t s ) 堆积( h a s e g a w a 等，2 0 0 0 ) 。在酵母和动物体中，相应渗透剂和抗 氯化剂产生的途径是促细胞分裂蛋白激酶途径( m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ，m a p k ) 。这些m a p k 途径由受体( r c c e p t o r s ) 和感应体( s e n s o r s ) 激活， 如蛋白酪氨酸激酶( p m t e i n t y r o s i n e l ( i n a s e s ) 、g - 蛋白耦合受体( g p r o t e i n c o u p l e d 1 _ e c e p t o r s ) 和双成分组氨酸激酶。在这些受体型蛋白中，组氨酸蛋白在植物中已 被确定。拟南芥组氨酸激酶a t h k l ，可以与酵母突变体中双成分组氨酸激酶供体 s l n l 相互作用，因此可能包含在植物渗透胁迫信号转导中( u r a 0 等，1 9 9 9 ) 。搞 清楚a t h k l 和其它推测的组氨酸的体外功能，以及它们和渗透胁迫m a p k 途径之 间关系可能可以阐明渗透胁迫信号转导机制。 激活胚胎发生后富有型( 1 a t ee m b r y o n e s i s a b u n d a n t ( 三巴4 ) 呵p e ) 基因途 径不同于调控渗透发生途径，这些包括基因中含有脱水反应元件( de h ) r d r a t i o n r e s p o n s i v ce l e m e n t ，d r e ) 或者c 端重复型( c r e p e a t ，c r t ) 胁迫 反应基因。肌秘一type型基因实际代表了损伤修复机制(zhu，2001；xiong和zhu， 胁迫下调节上翻类似基因的表达，g 蛋白相关受体可能在胁迫产生的二级信号感 受过程中存在并起一定作用。根据这种观点，分析拟南芥g 蛋白突变体助口j ( u 1 1 a h 等，2 0 0 1 ；w a l l g 等，2 0 0 1 ) 胁迫信号会很有意义。g 蛋白相关受体也可能一种a b a 膜上受体。 2 2 营养胁追 植物的营养胁迫主要指氮、磷、钾等植物必需的大量元素的缺乏，影响了植 物正常的营养吸收。氮、磷、钾作为植物必需的大量矿质元素，对于植物维持自 己的正常生理活动是非常重要的。 氮是构成蛋白质的主要成分，占蛋白质含量的1 6 1 8 ，而细胞质、细胞核 和酶都含有蛋白质，所以氮也是细胞质、细胞核和酶的组成成分。此外，核酸、 核苷酸、辅酶、磷脂、叶绿素等化合物中都含有氮，而某些植物激素( 如吲哚乙 酸和激动素) 、维生素( 如b 1 、b 2 、b 6 、p p 等) 和生物碱等也含有氮素。由此 可见，氮在植物生命活动中占有首要的地位。植株缺氮时，植株矮小，叶小色淡 或发红，分枝少，花少，籽实不饱满，产量低。 磷存在于磷脂、核酸和核蛋白中，磷腊是细胞质和生物膜的主要部分，核酸 和核蛋白是细胞质和细胞核的组成部分之一。所以磷是细胞质和细胞核的组成成 分。缺磷时，植株体内累积硝态氮，蛋白质合成受阻，植株幼芽和根部生长缓慢， 叶小，分枝或分蘖减少，叶色暗绿，代谢过程不能正常进行，生长发育受阻。 与氮、磷相反，钾不参加重要有机物的组成，钾主要集中在植物最活跃的部 位，如生长点、形成层等。在钾的作用下，原生质的水合程度增加。粘性降低， 细胞保水力增强，抗旱性也增加。钾不足时，植株茎杆柔弱易倒伏，抗旱性和抗 寒性均差；时片细胞失水，蛋白质解体，叶绿素破坏，所以叶色变黄，逐渐坏死。 植物的营养和逆境胁迫都会造成植物提前衰老。 3 舾m 基因的研究背景 s e m 是从拟南芥中发现的一个与衰老有关的基因( s a g s ) 。该基因的蛋白 编码区由5 个编码1 8 2 个氨基酸的外显子组成，其肽链与细菌硫化脱氢酶具有 显著的相似性，与萝pd i n l 基因具有8 1 的相似性，5 上游区包含类似热激、 a b a 反应元件的序列模体及在胁迫诱导基因中的保守t c a 基序。叶中5 研w 基因同时e 乜受o 1 m m a b a 或1 m m 乙烯利诱导( 0 h 等，1 9 9 6 ) 。研究显示盟w j 基因表达与拟南芥叶衰老有关。黑暗处理下的连体幼叶和老叶中该基因表达都 很强烈，表明基因中含有非常强的黑暗反应元件( w e a v e r 等，1 9 9 8 ) 。 正常培养3 0 天后的拟南芥低磷处理后，用n o r t l l e m 检测艇t ，基因，发现 其在缺磷6 小时后在叶中开始被诱导，4 8 小时在叶中表达最强烈，而根中缺磷 4 8 小时也有显著表达( w u 等，2 0 0 3 ) ( 图4 ) 。 r o o t 图4 低磷处理后拟南芥中髓，基因的n o r n l e m 表达图( w u 甜以，2 0 0 3 ) 舳基因的启动子融合g u s 报告基因转入到烟草中，并检测其在黑暗处 理后该基因的表达机制。s e ，转基因烟草和拟南芥一样，在黑暗和a b a 处理 后出1 ，都被强烈诱导，它的启动子活性在黑暗处理后也随之迅速提高，但是衰 老的衡量参数值( 叶绿素含量、光合作用效率，溶解蛋白含量) 在黑暗培养4 天内仅有微小的改变，这说明在黑暗处理时& 1 ，启动子的活性与叶衰老主要症 状并没有紧密关联。黑暗诱导下s ：e m 启动子活性受外源生理浓度蔗糖的高度抑 制，葡萄糖、果糖对& w z 启动子的活性也有抑制作用。实验进一步证实，黑暗诱 导距，启动予活性与糖含量下降有关，受糖信号负调控。数据表明，糖饥饿能 激活艇w 1 基因( c h u n g 等，1 9 9 7 ) 。 关于s e 1 基因研究一般只限于叶中的表达情况，而对于该基因在其它组 织中表达情况并不清楚。在本研究中，从拟南芥基因组中克隆出艇m 启动子， 并将该启动予融合g u s 报告基因转入到拟南芥中，用于研究不同环境条件下 s e m 的组织表达，有助于对艇w ，基因功能的了解。 2 p 跚盯：g u s 表达载体的构建 21 材料与试剂 工具酶：脚h d i i i 、鼢口i 等核酸内切酶、t 4 聚合酶、t a g 酶、e x t a g 酶。 找体：p c a m b i a l 3 9 1 z 质粒( 图5 ) l a c z a h 8 n w rt 咐1 图5p c a 5 c i b i a l 3 9 l z 质粒载体图 22 方法 2 2 1 引物设计 根据s e j 全基因序列，利用o l i g e 软件设计引物，上游引物：5 c t c t a a g c t t a a a t a t g g c a g t t c a a t o t c a c c3 ，下游引物：5 t t c n r c t a g a a a a c t t c t r 几a g a a t g c t t t g a t g c t a3 ，全长为1 8 1 8 b 口。 2 2 2 载体构建 距启动子p c r 扩增后，用t 4 聚合酶补平，用胁聆胡i i 酶切，连入5 加日i 和肺月讲i i 酶切后的p c a m b i a l 3 9 1 z 质粒( 见图6 ) 。酶切检测后，转入e c o ，f 。 测序检测正确后转入爿即6 c 把r f “me h a l 0 5 农杆菌，。 2 0 胁田i i 跏n i 图6 肥m 启动子连入位点示意图 22 2 1 s _ 阶v 启动子p c r 扩增 e x t a g 晦 o 5 m d n a 樗l 板2 5 引物1 o 5 p l 引物2 0 5 m d n t p5 m 1 0 h l l 誓e r5 州 h 。o 3 6 m 5 0 m 2 2 2 _ 2 龇w - 启动子补平 1 0 x t 4 聚合酶b u f f e r o 1 b s a d n t p 模板 9 4 9 4 5 8 7 2 7 2 1 0 图7 肌w ，启动子p c r 扩增图 5 m 5 3 3 7 埘 5 3 0 ”、 3 0 ” l3 4 c y c i e l 5 0 ”j l o ” f o r e v e r 5 0 m ( 1 ) 模板7 0 放置5 m i n ( 2 ) 3 7 水浴，加入1 m t 4 聚合酶，轻轻混合后，3 7 保温5 m i n ( 3 ) 剧烈振荡3 m i n 后，置于冰上 ( 4 ) 补平产物回收 2 i 2 22 6 电击转化农杆菌 ( 1 ) 取1 0 0 m 农杆菌感受态细胞加入2 山质粒，轻轻混匀 ( 2 ) 感受态细胞移入电击管中，放在电击仪上2 5 0 0 伏高压电击 ( 3 ) 取出电击管加入5 0 0 m 预冷的y e p 培养液，混匀后吸出菌液于离心管中 ( 4 ) 2 8 。c ，2 0 0 0 r d m 振荡培养5 h ( 5 ) 涂扳( 加k a n 、s p ) ，2 8 培养1 5 2 天 ( 6 ) 酶切检测 3 p 艇j v n g u s 转拟南芥 3 ，1 材料与试剂 c 0 1 u m b i a 拟南芥( 爿6 嗣印咖肪小鲫d ) 、表面活性剂s i l 、v e 3 ，2 方法 3 2 1 拟南芥正常培养 拟南芥生长的适宜温度白天为2 2 2 4 ，夜温比日温低2 ，适宜的湿度 为6 0 一7 0 生长期适宜的光强为1 5 0um o l s 1 1 m 2 ，幼苗期不耐高光强，可适 当遮荫，光质选用植物生长专用的目光灯。拟南芥生长室的目照长度定于1 4 1 6 h 。 准各发苗培养基：1 2m s ，s u c m s e ：l o g l ，p h 5 7 ，a g a r ：o 7 一o 8 ，灭菌 后，在超净台上分装入培养j 】i 【。 种子消毒：种子放在1 5 m l 试管中，加入1 m 1 1 0 n a c l 0 ，混匀，消毒5 m i i l ， 用无菌水洗5 次以上( 用移液枪吸) 。 播种：周移液枪将种子吸到培养皿上，可多加些水，将种子铺均匀，用移液 枪吸二f 水，在超净台上让培养皿干了，密封盖子，4 暗处理两天后，移到光照培 养箱( 2 2 光周期1 2 h ) 。 移苗：将蛭石与珍珠岩按( 3 ：1 ) 的比例混好，装入花盆，将花盆放入有水 的塑料周转框中，框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来，待花盆中的基质湿透 后即可移苗。小心轻轻用镊子从培养皿中连根拉出小苗，把根平放在蛭石表面， 用镊子把根轻轻压下。移苗结束后，用保鲜膜覆盖3 4 天后揭膜，从苗期直至开 花，可在羯斟周转框中始终保持l 一3 c m 的水层。在开始收籽期，不再需要过多的 水分，可保持塑料周转框干燥，此时每隔2 3 天浇一次水即可。整个生长期可浇 3 4 次拟南芥营养液。 222 6 电击转化农杆菌 (1)取100m农杆菌感受态细胞加入2山质粒，轻轻混匀 ( 2 ) 感受态细胞移入电击管中，放在电击仪上2 5 0 0 伏高压电击 (3)取出电击管惫罐毫襄捌倒棼鏊毽囊星箱潞!警甏裂拦e纨副缈鳞飘型垒 ! 女i | i 霉。i 昌甜产蕾协型羹is ；姥当；讣譬刊：霎 l ；霉百孺孽 i ；? i 彰 i#f爱兰种元i 薹舔篓跚耋番摹磊省矗羔i ? ! 罐迫 ，细胞 脱水，膜系统受害，透性加大。任何逆境都会使光合速率下降，同化物形成减 少，因为组织缺水引起气孔关闭，叶绿体受伤、有关光合过程的酶失活或变性 。植物的营养和逆境胁迫都会造成植物提前衰老；大 多数植物激素可以调节 细胞活动，包括衰老。 1 材判j 方法材料： p 艇h g u s 转基因拟南芥方法：转基因拟南芥用普通1 2 m s 固体培养基正常培养五天后，一部分分 别转入缺氮、磷、钾的l ，2 m s 进行养分胁迫处理( 3 天) 正常的1 ，2 m s 包黑纸 后胃于培养箱中黑暗处理，一部分转入含3 葡萄糖胺的1 ，2 m s 正常培养，一 部分罱于4 培养箱中进行冷处理( 3 天) ，一部分在分别含o 1 m ma b a 、1 m n aa 、1ym6 ，b a 的1 2 m s 培养基上培养( 3 天) ，一部分置于含3 0 0 m mn a c l 液体12 m s 的饱和滤纸上进行高盐处理( 3 天) ，另一部分置于含3 0 p e g 6 0 0 0 液体的滤纸上进行高渗处理( 3 天) ( m a n a b ui s h i t a n i 等，1 9 9 7 ) 。 x 收籽：在种荚变黄，变千时可以收籽。将种子抖落在纸上，用金属滤网过一 下以除去杂质，将种子装入写了标记的小纸袋中，放于干燥的环境中让种子进一 步干燥后封存于1 5 m l 试管中。 附拟南芥营养液配方( n u 缸e n ts o l u t i o nc o n t a i n i n g ) 5 m m k n 0 3 ，2 5 m mk h 2 p 0 4 ，2 m mm g s 0 4 ，2 m mc a ( n 0 3 ) 2 ，5 0 p mf e e d t a ， 7 0 ”mh 够0 4 ，1 4 p mm n c l 2 ，o 5 p mc u s 0 4 1p mz n s 0 4 ，o2 p mn a 2 m o o 4 1o m n a c l ，0 01u mc o c l 2 ，a d i u s t e dt op h 5 7 32 2 拟商芥转基因 按上述方法培养拟南芥，约三星期左右，剪去已经开花的主茎，抑制顶端优 势。约四星期左右，抽出的侧枝大量开花，此时正是用浸润法( y c 等，1 9 9 9 ) 转 基因帆最佳时机。 取农秆菌菌液2 0 儿加入5 m l y e p ( y e a s te x t r a c t1 0 9 l t r y p t o n e l o g l ，n a c l 5 仨l ，灭菌蜃，添加灞霉素) ，3 q 恒温振摇过夜，将此弧1 菌液铆入2 5 e p ( 添加潮霉素，3 0 恒温振摇过夜此时，农杆菌的浓度应达到0 d 6 0 0 = 1 8 。 4 0 0 0 r p m 譬：心15 分钟，弃去上清，加入浸润法培养基( 1 ，2 m s 大量+ 1 x m s 微量 + ix m s 铁盐+ l m s 肌醇+ l m s 维生素+ m e s 05 9 几十s u c r o s e 5 ，p h 5 7 高压灭 菌) 。使农秆菌以1 ：l 的比例重悬于浸润培养基，并加入表面活性剂s i l w e t ，使 其终浓度达到0 0 2 ( 每升加2 0 0 山) 。 将拟南芥花笳蒙上纱布，用橡皮筋扎紧，以免花盆倒扣时培养基质下漏。将 花锰倒扣子装有2 5 0 m l 菌悬液的浸润罐上，使植栋的花序浸没在菌液中，浸润持 续2 m i n ，转化后用吸水纸吸去过多的菌液，但不需要吸得很干。转化后的植株， 用保鲜膜覆盖过