（特种经济动物饲养专业论文）蜂群用药对蜂蜜中药物残留影响的研究.pdf

福建农林大学硕上学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 摘要 随着现代畜牧业向规模化、集约化发展，存在的问题越来越多，蜂产品的质 量安全也倍受关注，抗生素残留控制已成为各国食品安全工作的重要部分之一。 本研究以反相高效液相色谱为定量分析手段，通过对蜂群进行糖浆给药和花 粉给药，研究糖浆给药和花粉给药后蜂蜜中药物残留的差异，并探讨药物的休药 期，以找到合适的给药途径和休药期来降低蜂产品中的药物残留。 本研究选择生产上常用的四环素类药物土霉素和氟喹诺酮类药物环丙沙星 作为试验代表药物。土霉素以5 0 0m g 1 0 足框蜂和1 2 5r a g 1 0 足框蜂的给药剂量 进行饲喂，环丙沙星以5 0 0m g 1 0 足框蜂和2 5 0m g 1 0 足框蜂的给药剂量进行饲 喂，给药后，分别采集无休药期时和休药4 5 天后的蜂蜜样品，进行相应的前处 理后，土霉素和环丙沙星残留分别用二极管阵列检测器和荧光检测器进行h p l c 检测。 通过试验，结果表明： 使用不同药物浓度饲喂后，药物在蜂蜜中的残留量存在明显的差别，给药剂 量越大，残留就越多，在无休药期时和使用糖浆给药时尤为明显。 无论是采用哪种方式给药，无休药期时蜂蜜中药物的残留量都高于休药4 5 天后的，此时糖浆给药后所得样品中药物残留都超过残留限量。休药期对糖浆给 药的影响较大，但对花粉给药的影响不明显。 无论是在无休药期时还是在休药4 5 天后采样，采用糖浆给药的方式蜂蜜中 的药物残留量明显高于利用花粉给药，土霉素大约为3 1 0 倍，环丙沙星为1 0 - 2 0 倍。 关键词：蜂蜜；给药方式：药物残留；休药期 a bs t r a c t w i t ht h el a r g e s c a l ea n di n t e n s i v ed e v e l o p m e n to fa n i m a lh u s b a n d r y , m o r ea n d m o r ep r o b l e m sa p p e a r t h eq u a l i t ya n ds a f e t yo fb e ep r o d u c t sa r ew e l lc o n c e r n e do n n o w a d a y s ，a n dt h ec o n t r o lo fa n t i b i o t i cr e s i d u e sh a sb e c o m eo n eo ft h em o s t i m p o r t a n tp a r t so ff o o ds a f e t yw o r k a f t e rf e e d i n gt h eh o n e y b e ew i t ht h es y r u pa n db e ep o l l e nw h i c hc o n t a i nd r u g s ， t h er e s i d u e si nh o n e yw e r ed e t e r m i n e db yr p h p l cm e t h o d s t u d yt h ed i f f e r e n c e s b e t w e e nt h et w od r u gd e l i v e r yw a y sa n dd i s c u s st h ew i t h d r a w a lt i m eo fd r u g sb y c o m p a r i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fd r u gr e s i d u e s ，i no r d e rt of i n das u i t a b l ew a y t of e e d d r u gt or e d u c et h ed r u gr e s i d u e s o x y t e t r a c y c l i n ea n dc i p r o f l o x a c i n ，w h i c hw e r ew i d e l yu s e di na n i m a lh u s b a n d r y w e r es e l e c t e df o ro u rr e s e a r c h t h eo x y t e t r a c y c l i n ew a sf e dt oh o n e y b e ea tt h ed o s a g e o f5 0 0 m ga n d12 5 m g ，a n dt h ec i p r o f l o x a c i nw e r ef e da tt h ed o s a g eo f5 0 0 r a ga n d 2 5 0 r a gr e s p e c t i v e l y t h e n , t h es a m p l e so fh o n e yw e r eg a t h e r e d f r o mt h ec o l o n y r e s p e c t i v e l yw h e ni ti sw i t hn ow i t h d r a w a lp e r i o da n dw i t ht h ew i t h d r a w a lp e r i o df o r 4 5d a y s t h er e s i d u e sw e r ee x t r a c t e df r o mt h es a m p l e sb yu s i n gs o l i dp h a s ee x t r a c t i o n t e c h n o l o g ya n dd e t e r m i n e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n a l y s i s t h er e s i d u e s o fo x y t e t r a c y c l i n ea n d c i p r o f l o x a c i n w e r er e s p e c t i v e l y a n a l y z e db yp h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o ra n df l u o r e s c e n c ed e t e c t o r a f t e re x p e r i m e n t s ，t h ec o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： t h e r ee x i s tr e m a r k a b l ed i f f e r e n c e si nd r u gr e s i d u e sw h e nd r u g sa r ef e da tv a r i o u s d o s a g el e v e l s t h eh i g h e rt h ed o s a g ei s ，t h em o r et h er e s i d u e sw i l lb e ，e s p e c i a l l y d u r i n gt h et i m ew i t hn ow i t h d r a w a lp e r i o da n dw h e nd r u g sa r e f e db ys y r u p n om a t t e ri nw h i c hw a yt h ed r u g sw e r ef e dt oh o n e y b e e ，t h ec o n c e n t r a t i o no f d r u gr e s i d u e si nt h es a m p l e sg a t h e r e di nt h en o n s t o p p i n gp e r i o da r em u c hh i g h e r t h a n t h o s eg a t h e r e dw h e ni ti sw i t hw i t h d r a w a lt i m ef o r4 5d a y s t h er e s i d u e si nt h e s a m p l e sg a t h e r e df r o mt h ec o l o n yt ow h i c hd r u g sw e r ef e db ys y r u pw e r es t i l l a b o v e t h em r l sw h e ni ti sw i t hn ow i t h d r a w a lp e r i o d t h e r ei sa no b v i o u se f f e c to fh a v i n ga m e d i c i n e d e p r i v e dp e r i o do nt h ed r u g f e db ys y r u p ，b u tt h e r ei saw e a ke f f e c to nt h e i i 塌建农林大学颈上学位论文 蜂群用势对蜂蜜质量影响的研究 d r u g f e db yb e ep o l l e n 。 w h e t h e rw i t h1 1 0w i t h d r a w a lp e r i o do rw i 诹w i t h d r a w a lt i m ef o r4 5d a y s ，t h e c o n c e n t r a t i o no fd r u gr e s i d u e si nt h es a m p l e sg a t h e r e df r o mt h ec o l o n yt ow h i c h d r u g sw e r ef e db ys y r u pi sm u c hh i g h e rt h a nt h a tt ow h i c hd r u g sw e r ef e db yb e e p o l l e n t h ec o n c e n t r a t i o no fo x y t e t r a c y c l i n ei sa b o u t3 - 10t i m e sh i g h e r ，w h i l et h e c o n c e n t r a t i o no fc i p r o f l o x a c i ni s10 2 0t i m e sh i g h e r k e y w o r d s ：h o n e y ；d r u g - d e l i v e r yw a y ；d r u gr e s i d u e s ；w i t h d r a w a lp e r i o d 1 1 1 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：康粹林 日期：知。矽、6 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：廖林怫 日期：加。彦乡_ 哆 指导教师亲笔签名 福建农嚣天学颈l - 举篷论文蜂瑟丽药愆蜂蜜质量蟛雅熬研究 第一部分文献综述 我国是世界蜂产矗生产和出口的大国，无论是蜂群饲养量还是蜂产品产量均 屠世界第位q 多年来蜂产燕一巍是我国出瀚剖汇的主要产龋，溺时也是国内 墨盏高涨的保健燕市场上倍麴看好的传统品种，然两在国际市场上帮始终没有话 语权，蜂产器靛鲞鞠单侩及相关检测标准尽掌握在其链匿家之手，以致于在发达 国家设立的绿色壁垒瑟笥，我国的窦疆贸易屡屡受挫，出口受检种类嗣趋增多， 限量日趋严格。这些遭遇主要是由蜂产品中药物残熬较多，产品质量下降，市场 竞争力下降等原因弓l 起的。另外，入类长期摄入含有药物残留的食龋后，药物在 体内蓄积，当达到一定量后，对人体产生毒害作用，造成一系列食晶安全闷邀。 壹照看来，蜂产品中药物娥留琵经严重影响到我国蜂亚酶正常发震和危害久类健 康，透此，进行蜂产品中药物残留方面酶硒究甚成为我国食最科学和安全麴重要 任务。 l 蜂产品中抗生素的残留及安全控制 1 1 蜂产品的营养价值 蜂产品主要包括蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉、蜂胶、蜂蜡等凡大类。我滔民趔食 用蜂产品的历史悠久，二千多年前酶东汉药物学著作弹农本草经孛就有“久 服蜂蜜，强志轻身，不老延年”的记载【z l 。 蜂产品的营养价值和药用价值都极离，如蜂壬浆能够提高人体免疫功能，增 强抵抗力；能够促进新陈代谢，提高造血功能，修复组缫，增殖细臌；有刺激生 殖的麓力；可以调节神经、血压和盘糖的失衡，增强体力；还可以提高大脑工作 效率，增强记忆力，消除疲劳，延缓脏器和皮肤衰老等律焉5 3 q 。蜂花粉被誉为 拜微型营养库 、“浓缩的维生素 ，其蛋童质含量高达3 0 ，禽包括人体必需昭 | s 糟氨基酸在肉豹| 7 静氦基酸，鼹时还含有多种类型的糖、脂肪、无魏盐、微 量元素和维生素a 、b 、c 、嚣、k 等以及某些延缓人体衰老的激素和抗菌素。其 中糖类含量2 5 4 8 ，其中花粉多糖具有 陵强的免疫翻防癌功能，蜂芯粉中的 多种活性物质，如黄酮类、激素、核酸、酶、绿原酸等具有增强毛细血管强度、 抗炎、强心、抗动脉硬化的功效 1 1 - 1 4 。蜂胶是一静理想的天然广谱抗菌携质，天 然免疫增强剂，天然抗氧化剂和直液清道夫，是人类健康豹保护享枣。作为一种营 福建农林人学硕士学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 养丰富、保健功能突出的食品，蜂产品正走俏于国际市场，在欧洲的很多国家已 被列为动物源天然保健食品。 1 2 蜂产品生产中常用抗生素的种类 抗生素是2 0 世纪最伟大的医学发现。它是某些微生物如某些细菌、放线菌、 真菌等在其生命活动过程中产生的，能在低微浓度下抑制微生物生长和其他细胞 增殖或能够选择性地杀灭他种生物化学物质。除了这些从微生物培养液中提取得 来的，目前也存在用合成、半合成的方法制造的抗生素，如磺胺类和硝基呋哺类 药物等。自1 9 4 0 年青霉素被应用于临床以来，抗生素的种类已达几千种，在临 床上常用的亦有几百种【1 5 , 1 6 ，给那些正与各种传染病进行殊死搏斗的人们带去了 福音。在蜂业的发展中，抗生素也发挥了巨大作用，生产上常用的，也是出现问 题较多的抗生素主要有氯霉素类、氨基糖甙类、四环素族、磺胺类、硝基眯唑类、 硝基呋哺类和氟喹诺酮类等。 1 3 蜂产品中抗生素残留的原因及现状 自改革开放以来，我国国民经济得到了快速发展，人民生活水平有了显著的 提高，我国居民的生活消费及食品结构己发生了显著变化，动物源性食品在居民 的食品消费中已占相当比重。在市场驱动及国家农村产业结构调整的引导下，我 国的养殖业发展迅速，目前己成为农村发展的支柱产业。随着畜牧业的现代化、 集约化和规模化生产扩大及贸易的发展，动物源性食品在生产过程中遭到潜在污 染的危险也空前增加【1 7 1 。动物源性食品从生产、加工、贮运到消费各个环节， 容易受到环境有毒有害物质污染是不争的事实【1 8 , 1 9 】。同时，动物源性食品在加工、 贮运和流通过程也容易受到各种环境病源微生物的侵染，使食品腐败变质，致使 食物中毒事件时有发生【2 0 1 。 畜禽产品除了上述因生产方式或生产过程控制疏漏，存在着各种污染和安全 隐患外，兽药残留特别是抗生素残留，也是各国政府和公众关注的问题【z 。在 兽医临床上，使用药物的主要目的是安全有效地防治动物的各种疾病，但是由于 使用不当或过量使用，常常造成动物源性食品中药物残留超标【2 2 】。蜂产品和其 他的动物源性食品相似，各种污染和问题也来自于从养殖场到餐桌的不同生产、 加工、和流通过程，从过去到现在的相当长的一段时期，主要问题包括：化学性 物质污染( 兽药、农药和重金属污染) 、病原微生物污染、生物毒素污染、其他 福建农林大学硕上学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 问题( 掺假造假、致敏物和添加剂) 等，其中的化学性物质污染中的药物残留尤 其是抗生素残留是主要问题【2 3 】。 自2 0 世纪4 0 年代后期，发现抗生素在动物饲养中有多方面的作用：( 1 ) 能 显著降低畜禽病死率而被用于动物疫病的治疗与防治。虽然抗生素过度使用及使 用不当产生的潜在危害日益受到人们的关注，但在现代养殖业中，迫于规模化、 工厂化、高密度饲养方式下疫病防治的压力，抗生素药物作为防治目的的使用还 将持续【2 4 1 。( 2 ) 提高饲料利用和转化率，促进动物生长。抗生素在亚治疗剂量 ( 即治疗剂量1 3 或更低的抗生素用量) 下作为药物性饲料添加剂，在实际生产 中被证明具有促生长剂的作用后，抗生素被作为添加剂大量且普遍的用于畜禽养 殖业【2 5 1 。( 3 ) 改善产品的某些性能、提高生产效能。由于药物添加一般能提高 养殖生产效能并带来巨大利润，2 0 世纪5 0 年代以来，亚治疗剂量被作为动物日 粮添加剂普遍使用，8 0 以上的家禽长期( 数月) 或终生( 上市前) 使用药物添 加剂【2 6 1 。目前大多数食用动物长期使用至少一种药物【2 7 】。非治疗目的亚剂量抗 生素添加剂长期普遍使用，在动物体内会发生积蓄或被动物的组织和器官富集而 在动物源性产品中存在残留。 抗生素等药物在蜂业生产中发挥了巨大作用，但由于科学知识的缺乏和经济 利益的驱使，养殖者在生产中滥用药物的现象普遍存在2 8 , 2 9 】。因此，在养蜂生产 上疾病治疗过程中药物的不合理使用就成为蜂产品药物残留的主要原因【2 4 1 。主 要体现在：( 1 ) 养蜂生产者长期以来存在一种传统的错误观念，对抗生素产生依 赖性，认为抗生素是万能药，因此不分时间和病原种类，只要蜜蜂感染疾病，就 首先用抗生素治疗。( 2 ) 养蜂者缺乏蜂病用药的基本知识和防治技术，对传染病 未作出正确诊断便盲目用药，而且认为用药量越大越好，结果适得其反。不但造 成经济浪费，而且还使病原物对药物产生抗药性，降低药物防治效果，同时更增 加了药物对蜂产品污染的机会。( 3 ) 养蜂者为了早期获利，用药后不遵守休药期 的规定，还没过休药期就进行生产，此时这些产品中抗生素很有可能超过规定标 准。( 4 ) 蜜蜂疾病发生及流行特点出现新的变化趋势，尤其是近些年来，普遍发 生的“爬蜂病，多为一种或几种病原同时出现在同一蜂群，危害大，难治愈。 蜂农的习惯和传统观念是首先使用抗生素进行治疗，这样做的结果不但没有防治 效果，反而会造成蜂蜜中抗生素残留含量超标【2 0 】。 福建农林大学硕士学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 随着现代畜牧业向规模化、集约化发展，其中存在的问题也越来越多，长期 以来抗生素残留超标都是各国控制的重点之一。另外，兽药残留引起食物中毒和 影响畜禽产品出口的报道越来越多，食品中抗生素的质量浓度已经成为评价产品 质量的重要指标之一。蜂业生产中也不例外地存在着严重的抗生素超标问题，抗 生素残留量也是蜂产品的必检项目之一1 3 0 】，一定程度上阻碍了蜂业的正常发展。 通常所说的药物残留一般不是质的问题，而是量的问题。每个国家和地区都存在 药物残留，区别仅在于药物残留的量不同 3 1 , 3 2 。秦皇岛出入境检验局曾经对我国 出口蜂蜜样品检测，结果显示，1 9 9 9 年我国出口蜂蜜的合格率仅仅为5 4 ，2 0 0 0 年的为4 2 t 3 3 】。2 0 0 2 年欧盟以我国蜂蜜中氯霉素等抗生素超标为由发出了中止 从中国进口包括蜂蜜在内的部分动物源性产 3 4 , 3 5 】，并波及英国、日本、美国和 加拿大等国家f 3 卅，使我国蜂蜜生产的质量和安全问题成为国际关注的焦点，使 我国的养蜂业蒙受了巨大的打击，全国蜂产品出口大幅度下滑。据报道，仅2 0 0 2 年上半年，中国蜂产品出口量减少4 4 3 ，出口创汇收入减少3 8 6 3 7 】。虽然最 近几年通过无公害蜂产品标准的制定和实施，我国蜂产品中药物残留问题有好转 的迹象，但在进口国家制定的贸易壁垒下，但还未得到有效解决。由于“日本肯 定列表”的实施，2 0 0 7 年1 - 5 月我国蜂王浆对日出口与2 0 0 6 年相比出现较大 的下滑，鲜王浆出口下降2 3 6 3 ，蜂王浆冻干粉下降1 2 6 9 ，蜂王浆制剂下降 6 0 0 1 。2 0 0 7 年8 月出口西班牙的冷干蜂王浆被检测出含有诺氟沙星，拒绝入 境【3 8 】；2 0 0 7 年9 月，日本厚生劳动省公告，福冈和横滨检验所在中国产蜂蜜及 其制品中检出禁用药物氯霉素，其含量分别为0 0 0 0 6m g k g j 和0 0 0 1 lm g k g 。1 3 9 1 ；2 0 0 8 年1 月下旬，欧盟委员会对包括蜂蜜在内的我国动物源性食品禁令发 布后，接连接到我国驻英国、德国外交部门及欧盟食品快速预警系统反映和通报 我国出口蜂蜜在英国、德国被检出氯霉素、链霉素残留超标的情况。2 0 0 8 年2 月出口出口西班牙的蜂蜜却由于含有环丙沙星、链霉素及其他抗生素被遣回1 4 州， 同时，英国的蜂王浆胶囊因含有禁用药物氯霉素被撤出英国市场【4 1 1 。由此可见， 蜂产品中的抗生素残留严重制约着其出口，是急需解决的问题。为了保障国民健 康，促进我国畜牧业的发展，必须采取有效的措施，减少和控制药物在动物源性 食品中的残留。 福建农林人学预一l ：学位论文酶群用旃对蜂蜜质量影响的研究 1 4 抗生素的残留危害 1 4 1 抗生紊残留对人类的危害 俗语说：“是药三分毒”，任何药物都存在不同程度的毒、副俸用，抗生素虽 然能有效地杀灭各种瘸原微生物，但其也存在各种毒副作用。尽管残留在食燕中 的药物水平通常很低，发生急性中毒的可能性l l l , j ，但长期低剂量的摄入，通过 环境和食物链的富集作用间接对人体健康造成潜在危害，产生各种慢性和积蓄性 的毒性伤害。药物残留对健康和环境的危害往往具有隐蔽性，易造成实质性和难 以逆转的危害。具体说来主要有以下几点： ( 1 ) 誊接毒性作用2 弓3 l 虽然动物组织中药物残馨水平通常缀低，一般一个人每天扶动物产品中摄入 的药物远低予人的治疗剂量，发生急性中毒的可能性极小，但长期摄入可产生慢 性或蓄积毒性。也有一些药物能形成高残留如克伦特罗( 在组织中 1 0 0r i g 影1 ) 易引起急性中毒。关于克伦特罗中毒的报道较多。 食品中的激素残留对青少年发育有严重的影响。长期摄入雄激素会干扰人体 正常的激素平衡，男性出现睾丸萎缩、胸部扩大、翠秃、肝、肾功能障礴或肝肿 瘤；女性出现雄性化，冤经失调、髋岗增生、鼍发增多等。长甥摄入雌激素不仅 会导致女性化、性早熟、抑制骨懿秽精予发育，焉且雌激素类物质具有明显的致 癌效应，可导致女性及其女性后代的生殖器畸形和癌变。 氨基糖苷类抗生素及其残留对人、畜均有明显的毒副作用，如链霉素、庆大 霉索、卡那霉素等的主要毒性反应为对第八对脑神经的损害，引超耳鸣，头昏， 眩晕等，若使用量较大可导致听力减退，重听，甚至有耳聋的可能。庆大霉素还 有雩l 起肾脏损害，心肌损伤，过敏反应等毒害作用，这些虽然较少觅但也是一个 不可忽略的危害。链霉素还有潜在的致畸作用等。 磺胺二警瞳啶能诱发人的甲状朦癌，邕体激素( 如己烯雌酚) 能引起女性早 熟和男性女性化及子宫癌；对磺胺五甲基嘧啶的激素样效应和潜在致癌性质正在 进一步研究中。 四环素类药物能引起肝损害，并且其容易与骨骼中的钙质结合，从而抑制骨 骼和牙齿的生长，影u i ；, j j l , 童身体的正常发育。特别是对牙齿的作用尤为明显，能 够产生牙齿黄染。另外，四环素类药物还具有刺激性和抑制蛋白质合成的副作用。 福建农林大学硕上学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 动物源性食品中残留的氯霉素具有较强的毒、副作用，能导致严重的再生障 碍性贫血，并且其发生与使用剂量和频率无关。人体对氯霉素较动物敏感。婴幼 儿的代谢和排泄机能尚不完善，对氯霉素最敏感，可出现致命的“灰婴综合征”。 氯霉素在组织中的残留浓度能达到1m g k g 。以上，对食用者威胁很大。氯霉素 是第一个被禁止用于食品动物的抗生素。 大部分的氟喹诺酮类药物具有光敏作用，个别品种在真核细胞内已经显示致 突变作用。 ( 2 ) 产生过敏反应和变态反应 有些药物本身就具有抗原性，能够直接刺激机体产生抗原抗体反应，引起过 敏反应，严重者可导致休克、喉头水肿、呼吸困难等症状，如青霉素类药物。关 于青霉素类药物过敏的报道很多，因为它具有很强的致敏作用，轻度的过敏只是 引起皮炎或皮肤瘙痒，严重的可能导致虚脱危及生命，而且与剂量无关。青霉素 类容易引起变态反应的主要机理是青霉素类分子的几个原子或基团可以直接或 间接地与蛋白质或多糖发生共价结合反应，形成抗原，产生免疫活性。另外，经 常食用含低剂量抗生素的食品，会使食用者由于反复受到抗生素的刺激而被致 敏，己被致敏的人，当再次接触( 用药或食用含有同种抗生素残留的食品) 同种 抗生素，将发生过敏反应，严重者可导致死亡【2 5 1 。 ( 3 ) 诱导细菌产生耐药性 当一种抗生素用久了，细菌对其产生了适应性，或者分泌某种酶，使抗生素 的结构发生破坏，从而达不到杀菌的效果，这都是耐药性。极易产生耐药性的细 菌主要是金黄色葡萄球菌和肠杆菌科的细菌。 细菌耐药性的增加是使用亚治疗剂量抗微生物药物的直接后果【5 4 1 。动物在 经常反复接触某一种抗菌药物后，其体内的敏感菌株将受到选择性的抑制，细菌 产生耐药性，使耐药菌株大量繁殖，因此，当人体经常食用含药物残留的动物性 食品，动物体内的耐药菌株可传播给人体，当人体发生疾病时，往往由于耐药性 菌株的存在而使抗生素的疗效降低或失败，给临床上感染性疾病的治疗带来一定 的困难，延误正常的治疗，加重病人的医疗负担，在更大的范围危及人类公共卫 生防疫体系和人类自身健康5 5 5 9 1 。另外还给新药的开发带来压力。至今为止，具 有耐药性的微生物通过食品转移到人体内后，对人体健康产生危害的问题尚未得 福建农林大学硕上学位论文 蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 到解决【6 0 】。 ( 4 ) 造成环境平衡紊乱或菌群失调 在正常条件下，人体肠道内的菌群由于长期共存，已经能够与人体能相互适 应，如某些菌群能抑制其它菌群的过度繁殖，某些菌群能合成b 族维生素和维 生素k 以供机体使用。若长时间摄入含有抗生素残留的食品，将会使这种平衡 发生紊乱，造成一些非致病菌死亡，致病菌过度繁殖，使胃肠道微生态平衡失调， 从而导致长期的腹泻或引起维生素缺乏等反应，对人的健康造成危害【6 1 1 。 ( 5 ) 污染自然环境 动物用药以后，药物在体内维持一定的水平，多余的部分则通过多种代谢途 径，主要是通过肝脏代谢排出体外，以原药或代谢物的形式随粪、尿等排泄到环 境中。首先，多数兽药性质稳定，不易降解，排入环境后，在相当时间内仍然具 有活性，对土壤微生物、水生生物及昆虫等造成影响，使环境平衡被打破，甚至 改变当地的生态环境1 6 2 , 6 3 】。h a m s c h e r 等曾报道，在用畜禽排泄物施肥土壤的 0 4 0c m 的表层检测到了土霉素和金霉素残留，其浓度分别高达3 2 3m g k g _ 和2 6 4m g k g 一。另外，进入环境中的兽药残留，在多种环境因子的作用下，可 产生转移、转化或在动植物中蓄积，有可能对人类造成潜在危害。 ( 6 ) 社会影响 兽药残留对畜牧业行业的发展也会造成负面影响。如生产者因为残留违规而 丢失市场、负担残留检测费用和调查活动的费用、受到惩罚等，有的还直接影响 到对外贸易。如欧盟在进口中国的冻虾产品中发现氯霉素超标后，于2 0 0 2 年1 月发出了中止进口包括蜂蜜在内的部分中国产动物源性产品的指令【6 5 1 ，使中国 蒙受巨大的经济损失，也影响到外在的形象。残留对大众心理和社会的影响也是 巨大的。连续发生的食品安全事件使消费者对食品安全的信心下降，甚至产生恐 慌，继而对政府产生不信任感。 总之，兽药残留对人类的影响是巨大而深远的，已经成为影响人们生活质量 和国家经济利益的重要因素。为了保证人类的生命安全，寻找控制残留的措旌、 建立残留检测方法毫无疑问地成为控制残留的重要手段。 l 。4 2 抗生素残留对蜜蜂的危害 由于在生产过程中缺乏对蜜蜂病害有效的防治方法，抗生素成为我国养蜂 福建农林人学硕十学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 者治疗发病蜂群及预防蜜蜂疾病的一种依赖性药品。对抗生素的滥用，对蜜蜂 带来的危害也是很严重的。首先，抗菌素可以引起蜜蜂体质的下降，寿命缩短， 优良品性逐年退化。当蜜蜂吸取大量抗生素后，虽然杀死了致病细菌，同时也 杀死了蜜蜂体内的有益菌群，引起消化系统，消化系统，呼吸系统和血液循环 系统的紊乱，使蜜蜂变得体弱多病【吲。法国c t y s s e t 等【6 7 1 认为，即是使用小剂 量也危害不小，它同样将诱发蜜蜂病原菌对抗生素产生抗药性，抗药性细菌的 变种和发展，会导致蜂房正常微生物的失衡，使一般药物或药量无效，甚至诱 发其它疾病。 1 5 蜂产品中抗生素残留的安全控制 发达国家对兽药残留的关注较早，欧美等国于2 0 世纪7 0 、8 0 年代就开始注 意到抗生素在动物体内的残1 6 8 , 6 9 】，并制定了兽药的最高残留量、休药期及有关 法规和标准。欧美、日本、澳大利亚、加拿大等国均已建立非常完善的兽药残留 监控体系【7 0 。3 1 。欧盟在2 0 0 2 年提出从中国进口的蜂蜜中的氯霉素检出量每千克 不得超过0 1 雌，即l 万吨蜂蜜中氯霉素含量不得超过lg ，还规定a 类禁用药 中的任何一种都不允许在蜂蜜中使用【7 4 】。当人食用含有抗生素残留的动物性食 品后，可能会引起肠道正常菌群失调和直接诱导耐药菌株的出现，有鉴于此，欧 盟从1 9 9 9 年就开始禁止使用磷酸泰乐菌素、弗吉尼亚菌素、杆菌肽锌和螺旋霉 素等4 种抗生素作饲料添加剂使用7 5 1 。国际上尤其是欧盟各国已对蜂产品中抗 生素类残留量作了严格的限制，不合格者不能入境。例如，德国对蜂蜜中链霉素 的残留量要求不断降低，由原来的2 1 0 5g 变为2 x1 0 堪g 7 6 1 。从1 9 9 9 年l o 月 开始，欧盟对不少磺胺类抗球虫药也颁布了禁令，已全面禁止使用洛硝唑和氯羟 吡啶【7 7 1 。2 0 0 2 年美国食品与药物管理局( f d a ) 公布了禁止在进口动物源性食 品中( 包括蜂蜜、蜂王浆) 中使用1 1 种药物，其中包括二甲硝咪唑及其它硝基 咪唑类药物。 由于日本是我国蜂蜜出口的主要国家，日本对我国蜂蜜等产品的质量要求越 来越严格，尤其是2 0 0 5 年1 1 月2 9 日，日本厚生省在日本政府网站上发布了对 日本进口所有食品制订的新控制标准，也就是在2 0 0 6 年6 月1 日起正式实施的 表格，即日本“肯定列表制度” 7 8 1 。新的标准几乎囊括了所有可能对食品产生 污染的农、兽药和食品添加剂，总共有8 6 4 种，分三大类，列在公布的一张表中， 福建农林人学硕i ：学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 若今后日本进口食品中，只要检出其中的一种，违反了表中规定，就将被禁止入 关或就地销毁。这种制度的实施，对我国农产品出口日本的冲击是非常巨大的， 可能是灾难性的，蜂蜜也不例外。根据对列表中的8 6 4 种物质分析，与蜂蜜有关 的共有6 4 种。其中有正在严格控制的农药杀虫脒，兽药类氯霉素、链霉素、四 环素族、磺胺类、硝基呋喃，也有过去未检查过，但蜂场常用药，如青毒素类和 以氟哌酸为代表的氟喹诺酮类药。日本厚生劳动省在2 0 0 7 年8 月2 1 日又增加了 1 3 项对进口蜂产品兽药残留的检查项目。该省称，增加这些项目是参照其他国 家对蜂产品检出的问题作出的决定。这1 3 个项目分别为磺胺喹恶啉、磺胺氯哒 嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噻唑钠、磺胺邻二甲氧嘧 啶、磺胺乙吡唑、磺胺吡啶、苯甲酰磺胺、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺 6 甲氧嘧啶。 我国有关部门也非常重视兽药残留，在兽药残留监控方面做了许多工作，于 1 9 9 9 年和2 0 0 0 年在全国抽检马、牛、猪、鸡、鱼、虾、蜂蜜等动物组织或产品 中兽药及其它物质的残留，同时制定了各种监控兽药的法规，修订了动物性食 品中兽药最高残留限量的标准，于2 0 0 2 年1 2 月2 4 日以2 3 5 号文公告发布，请 各地遵照执行，为实现我国动物性食品中兽药残留监控计划迈出了重要一步【7 9 1 。 2 0 0 3 年我国农业部和国家质量监督检验检疫总局为解决蜂产品中兽药及违禁药 物残留问题联合组织开展了蜂产品兽药残留专项整治工作。为继续加强兽药残留 监控工作，保证蜂产品出口安全，于2 0 0 7 年7 月9 日第二十次修订了出口食品 安全卫生检测监控项目( 表1 1 ) ，规定了蜂产品中一些药物的最高残留限量【8 0 】。 表1 1出口食品安全卫生检测监控项目一览表 食品名称 国别 检测项目限量标准项目依据 备注 加拿大磺胺氯哒嗪 0 0 1 0 p p m 国质检明发 磺胺嘧啶 0 0 0 5 p p m 2 0 0 2 1 1 5 号 磺胺间二甲氧氧嘧啶 0 0 1 0 p p m 磺胺邻二甲氧嘧啶 0 o l o p p m 蜂蜜、蜂 磺胺甲基嘧啶 0 0 0 5 p p m 王浆 磺胺甲氧哒嗪 o 0 0 5 p p m 磺胺甲氧嘧啶 0 0 0 5 p p m 磺胺苯吡唑 0 0 2 0 p p m 磺胺吡啶 0 0 0 5 p p m 磺胺喹恶啉 o 0 5 0 p p m 福建农林大学硕：仁学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影i | l 句的研究 磺胺噻唑 0 0 0 5 p p m 磺胺二甲基异恶唑 0 0 2 0 p p m 磺胺二甲嘧啶 0 0 0 5 p p m 蜂蜜、蜂 磺胺甲噻二唑 0 0 0 5 p p m 磺胺甲基异恶唑0 0 1 0 p p m 王浆 十霉素 0 0 0 2 p p m 四环索 0 0 0 3 p p m 金霉素 0 0 0 4 p p m 氯霉素 0 0 0 1 p p m 2 5 0 种杀虫剂0 017 - 0 0 3 4 p p m 氯霉素 n d 国质检食函 链霉素一律标准 呋喃代谢物 不得检出 2 0 0 6 1 3 0 8 号 日本 日本肯定列 四环素族 3 0 0 p p b 表 氯霉素 0 3 p p b 杀虫脒 2 0 p p b ( 蜂蜜) 质检食函 蜂蜜 2 0 0 2 1 5 0 号 c 1 3 ： - 2 3 5 国检检 蜂蜜c 1 3 与蛋 【1 9 9 2 1 3 | 5 号 美国 碳同位素 白质c 1 3 绝对 国检检函 值之差 l ( 蜂 【1 9 9 7 1 1 8 0 号 蜜) 国质检食函 氟喹诺酮类 2 5 p p b 2 0 0 6 1 3 0 3 号 硝基呋喃代谢物 不得检出 硝基咪唑不得检出 蜂蜜、蜂 磺胺类总残留 l o o p p b 王浆 氯霉素 不得检出 出口欧盟动 链霉素 2 0 p p b 物源性食品 待最后 杀虫脒 l o p p b 残留限量标 确定 欧盟 双甲脒 2 0 0 p p b 准和重点检 蜂蜜 c 1 3 ： 测项目汇编 2 3 5 国检检函 蜂蜜c 1 3 与蛋 【1 9 9 7 1 8 0 号 碳同位素白质c 1 3 绝对 值之差 l ( 蜂 蜜) 国质检食函 沽霉素 l o p p b 【2 0 0 7 1 2 6 8 号 - 1 0 福建农林人学硕士学位论文 蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 氯霉素0 3p p b 国质检明发 2 0 0 6 正 蜂蜜、蜂 韩国2 月5 王浆 硝基呋喃代谢物不得检出 【2 0 0 6 9 号 日更新 蜂蜜、蜂 其它国氯霉素 o 3 p p b 家及地 王浆 区 四环素族 0 1 p p m 日本从 氯霉素 0 3 p p b 日本从2 月 2 月1 6 蜂蛹粉 日开始 ( 包括雄 日本 硝基呋哺代谢物 l p p b 1 6 日开始对 该产品实施 对该产 蜂蛹粉) 品实施 5 0 的抽检 5 0 的 抽检 注：彳】“”为每批必检项目，“”为监控项目。监控频- 率由各局视产品特性向定。 2 蜂产品中药物残留的检测 兽药残留检测是复杂混合物中痕量组分的分析技术。残留分析最显著的特点 是需要严格的样本前处理步骤。残留分析既需要精细的微量操作手段，又需要高 灵敏的痕量检测技术，难度大、仪器化程度和分析成本高，分析质量控制和分析 策略( 筛选性分析、确证性分析) 有特殊要求引】。现代兽药残留分析方法通常 包括分离和检测两个基本方面，样品分离是核心，按分析过程可分为样本前处理 ( 提取、净化、浓缩和衍生化) 和检测两个部分。 2 1 样品前处理【8 2 8 5 1 2 1 1 提取 使用适当溶剂将待测物连同部分样本基质从固态样本转至易于净化或分析 的液态，通常可除去9 9 的样品杂质。 2 1 2 净化 就是将待测物与提取液中的样品干扰杂质分离。前处理中净化具有强大分离 效能或高选择性检测能力的测定体系可大大降低对净化的要求。兽药残留分析中 常用的净化方法是液液分配和固相萃取( s p e ) 。 2 1 3 浓缩 是待测物富集或转溶的常用方法。前处理中以浓缩过程待测物损失最大。应 避免样品液被直接蒸干，否则待测物可能附着于器皿上或与样本基质结合使回收 率下降。 福建农林大学硕j 二学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 2 1 4 衍生化【8 6 8 9 】 提高检测的灵敏度和选择性己成为残留分析中衍生化的最主要目的。h p l c 衍生化分为柱前和柱后衍生化。柱后衍生化需要专门的反应装置( 高压泵、混合 及反应管道) ，待测物从色谱柱流出后与衍生化试剂反应，再进入检测器。其突 出优点是在线反应，动态检测，无需反应进行完全，不影响现有的分离条件；主 要不足是衍生化试剂可能对检测有干扰和柱外峰展宽，对流动相亦有限制。近年 来柱后衍生化在兽药残留分析中的应用有所增加。 2 2 蜂产品中药物残留的检测方法 针对蜂产品中的抗生素残留，各国研究者已经相继建立了多种检测方法，有 的还出现了国家标准。按方法机理的差异分为微生物法、免疫学法和物理化学法 几类。 2 2 1 微生物法 该方法的主要原理是样品中若有抗生素残留，则对培养基中的细菌产生抑菌 圈，根据抑菌圈的有无及大小来判定结果，采用不同的试验菌，可检测不同的抗 生素残副9 们。目前微生物法主要有棉签法、杯碟法、纸片法等。 如用棉签法检测氯霉素时，用棉签( 拭子) 蘸取待检样品液，然后将其放置 于涂满枯草杆菌的培养基中保存过夜，第二天观察拭子周围是否出现抑菌环，如 果有，即表明待检液中存在抗生素。根据氯霉素对微生物的生理机能、代谢的抑 制作用，可以定性和定量检测蜂蜜中氯霉素的残留量，但此方法氯霉素的最低检 出限为1 0 0m g k g - 1 【9 1 1 。显然此方法检测限较高，易造成氯霉素漏检，因此该方 法仅适用于动物性食品中氯霉素残留的现场基层初筛。杯碟法曾作为蜂产品中四 环素族抗生素残留量的常规检验方法，该法具有灵敏度高，重复性好的特点。最 低检出量0 0 5m g k g 一，但已经不能满足对出口蜂产品中四环素族抗生素残留的 检出限量要求【9 2 1 。 微生物学检测方法一般属于筛选方法，在快速筛选检验程序中是非常有效 的。这类方法操作简单、费用少、速度快，广泛用于动物性食品中兽药残留的检 测，且不需要昂贵的仪器设备，非常适合于基层单位使用，但方法的灵敏度较差， 特异性差，易受其它抗生素影响【9 3 1 ，检出限较高，而且不能定量。 福建农林大学硕：j ：学位论文蜂群用药对蜂蜜质量影响的研究 2 2 2 免疫分析法 免疫分析技术( i a s ) 是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的 分析技术，此方法不属于生物检测范畴，而是以生物材料作为试剂的理化分析技 术，其中的抗体是核心试剂。因免疫反应具有极高的选择性和灵敏性，作为兽药 残留分析的手段能使得此检测技术中的样品的前处理步骤大大简化 9 4 , 9 5 1 ，显示 了它的优越性，在现场监控和日常大批量检测工作中有着广阔的应用前景。 免疫检测方法的步骤包括待测物选择、半抗原及人工抗原的合成、抗体制备 和测定【9 6 】。该方法主要包括放射免疫测定法( r i a ) 、酶免疫测定法( e i a ) 、荧 光免疫测定法( f i a ) 、化学发光免疫测定法( c i a ) 、固相免疫传感器掣9 7 1 。 放射免疫测定法( 对a ) 目前主要用于人类药物残留问题的检测上，在食品 中的应用还不是很广泛，虽有报道说在蛋、肉、奶中氯霉素的放射免疫的痕量分 析，但在蜂蜜中应用还没有见报道【9 引。与e l i s a 相比，灵敏度比较高，但r i a 具 有同位素半衰期短、存在放射性污染，影响环境和人的健康及需要复杂仪器设备 等缺点，因此目前使用最普遍的是e l i s a 法。 酶联免疫测定法( e l i s a ) 是利用抗体与抗原间特异的免疫化学反应，酶标 抗生素结合体与待检样品中抗生素残留物同时竞争固定在酶标孔的抗生素抗体 9 9 1 。待检样品中抗生素的含量愈高，显色反应愈浅；待检体中抗生素的含量愈 低，显色反应愈深。该方法在检测蜂蜜中氯霉素残留量的灵敏度为0 3p g k g ， 基本达到国际检测标准要求，与放射免疫法和高效液相色谱法相比，更适合于现 场大量食品样品的快速筛查。若用乙酸乙酯萃取，可以增加反应的灵敏度和