（法医学专业论文）法医dna分析若干问题的研究.pdf

四川大学硕士学位论文张伟娟 第一部分弟一部分 6 个s t r 基因座的遗传多态i 生 及种属特异性研究 摘要 目的对6 个短串联重复序列( s h o r t t a n d e m r e p e a t s ，s t r ) 基因 座在成都汉族群体中的遗传多态性及其种属特异性进行研究，探讨 其在法医学中的应用价值，并为法医d n a 分型提供新的候选s t r 遗 传标记。 方法用c h e l e x 法从1 1 0 名成都汉族无血缘关系个体的新鲜血 以及1 4 种常见动物组织中提取d n a 。从g d b 数据库中查出6 个四核 苷酸重复序列d 4 s 2 3 6 6 、d 4 s 2 3 6 7 、d 6 s 4 7 4 、d 6 s 1 2 8 1 、d 2 s 1 3 9 6 和 d 2 0 s 6 0 1 ，按数据库提供的序列合成引物，经p c r 扩增、非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色技术检测，对1 1 0 名成都汉族无血缘 关系个体的6 个s t r 基因座进行d n a 分型，应用p o w e r s t a t s 软件 对分型结果进行统计分析，获得各基因座基因频率及法医遗传多态 性数据。应用所合成的引物对1 4 种常见动物d n a 进行p c r 扩增和电 泳检测，对6 个s t r 基因座的种属特异性进行研究。 结果d 4 s 2 3 6 6 、d 4 s 2 3 6 7 、d 6 s 4 7 4 、d 6 s 1 2 8 1 、d 2 s 1 3 9 6 和 d 2 0 s 6 0 1 基因座在成都汉族群体中等位基因个数分别为7 、7 、6 、7 、 5 和7 ：观察杂合度分别为o 8 0 2 、0 7 0 8 、0 7 7 0 、0 6 2 7 、0 5 4 2 和 四川大学硕士学位论文张伟娟 0 6 7 2 ；个人识别率分别为0 8 8 7 、0 8 2 8 、0 8 4 9 、0 8 4 8 、0 7 9 4 和 0 8 6 5 ；非父排除率分别为0 6 0 2 、0 4 4 1 、0 5 4 4 、0 3 2 5 、0 2 2 7 和 0 3 8 6 。通过种属特异性的评价发现，在d 2 0 s 6 0 1 基因座对1 4 种动 物d n a 扩增，电泳未检测到p c r 扩增产物；在另外5 个s t r 基因座， 猴子d n a 均有扩增产物，且猴子d n a 扩增产物的片段大小与人的d n a 扩增产物片段大小接近，其它个别动物d n a 在不同的基因座有很少 的扩增产物。 结论在成都汉族群体中d 4 s 2 3 6 6 、d 6 s 4 7 4 、d 6 s 1 2 8 1 和d 2 0 s 6 0 1 基因座可作为法医学个人识别和亲予鉴定新的候选遗传标记， d 2 s 1 3 9 6 和d 4 s 2 3 6 7 基因座应用于法医学时鉴定能力较差；d 2 0 s 6 0 1 有较好的种属特异性，在法医学研究中具有较大的应用价值，其余 5 个短串联重复序列种属特异性较差。 关键词s t r ：遗传多态性：种属特异性；成都汉族；法医学 冲c 本课题由教育部科技基础条件平台项目资助。 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 p o l y m o r p h i c a n ds p e c i e ss p e c i f i c r e s e a r c ho fs i xs t rl o c i a b s t r a c t o b j e c t i v ei no r d e rt od e v e l o pas e to fn e wm a r k e r sf o rf o r e n s i c a p p l i c a t i o n ，w eh a v ec h o s e n6s h o r tt a n d e mr e p e a t s ( s t r ) l o c it os t u d y t h ep o l y m o r p h i s ma n ds p e c i e ss p e c i f i c i t yi nc h i n e s eh a np o p u l a t i o ni n c h e n g d u m e t h o d s110e d t a b l o o d s a m p l e s w e r ec o l l e c t e df r o mt h e u n r e l a t e di n d i v i d u a l si nc h e n g d uc i t y ，s i c h u a np r o v i n c e ，a n dd n aw a s e x t r a c t e db yc h e l e x t h ep r i m e r so f6s t rl o c iw e r es y n t h e s i z e da n d d n aw a s a m p l i f i e db y t h e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( p c r ) p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) a n ds i l v e rs t a i n i n gw e r e u s e dt oa n a l y z et h ep c rp r o d u c t s t h ed a t aw e r ea n a l y z e db yt h e p o w e r s t a t ss o f t w a r e t h et i s s u e sd n ac o l l e c t e df r o m1 4a n i m a l s w a se x t r a c t e da n da n a l y z e du s i n gt h es a m em e t h o d s r e s u l t st h ep o l y m o r p h i s m so fa l l6s t rl o c ih a v eb e e no b t a i n e di n c h i n e s eh a np o p u l a t i o ni nc h e n g d u t h en u m b e ro fa l l e l e so fd 4 s 2 3 6 6 ， d 4 s 2 3 6 7 ，d 6 s 4 7 4 ，d 6 s 1 2 8 1 ，d 2 s 1 3 9 6a n dd 2 0 s 6 0 1w a s7 ，7 ，6 ，7 ，5a n d7 ， r e s p e c t i v e l y t h eo b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t y ( h o ) o ft h e mw a so 8 0 2 ，0 7 0 8 ， o 7 7 0 ，0 6 2 7 ，0 5 4 2a n do 6 7 2 ，r e s p e c t i v e l y t h ed i s c r i m i n a t i o np o w e r ( d p i o ft h e mw a so 8 8 7 ，0 8 2 8 ，0 8 4 9 ，0 8 4 8 ，0 7 9 4a n d0 8 6 5 ，r e s p e c t i v e l y t h e 3 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 e x c l u s i o np o w e r ( e p ) o ft h e mw a so 6 0 2 ，0 4 4 1 ，0 5 4 4 ，0 3 2 5 ，0 2 2 7a n d o 3 8 6 ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dw i t h1 4d i f f e r e n ta n i m a l sa sc o n t r o l s ， d 2 0 s 6 01l o c u sw a sf o u n dt ob es p e c i f i cf o rh u m a nb e i n g a to t h e r5 s t rl o c i ，s o m ep c rp r o d u c t sf r o mm o n k e yw e r ed e t e c t e dw i t ht h e l e n g t hc l o s et ot h a tf r o mh u m a nb e i n g ，w h i l eo n l yf e wp c rp r o d u c t s f r o mo t h e ra n i m a l sc o u l db ed e t e c t e d c o n c l u s i o nd 4 s 2 3 6 6 ，d 6 s 4 7 4 ，d 6 s 1 2 8 1a n dd 2 0 s 6 0 1l o c ia r e h i g h l yp o l y m o r p h i ca n dc a nb ea p p l i e da sn e wc a n d i d a t em a r k e r sf o r f o r e n s i cp e r s o n a li d e n t i f i c a t i o na n dp a t e r n i t yt e s t i n g ，w h i l ed 2 s13 9 6 a n dd 4 s 2 3 6 7a r el o w l yp o l y m o r p h i c h u m a ns p e c i f i c i t yw a so b s e r v e d a td 2 0 s 6 0 11 0 c h s k e yw o r d ss t r ；p o l y m o r p h i s m ；s p e c i e ss p e c i f i c i t y ；c h i n e s eh a r t p o p u l a t i o n ；f o r e n s i cs c i e n c e s u p p o r t e db yt h ef o u n d a t i o nf r o mt h em i n i s t r yo fe d u c a t i o n 4 e y ) j l 大学硕士学位论文张伟娟 二l j l - - j l - - 月l j 罱 d n a 多态性遗传标记的检测和分析是个人识别和亲子鉴定的 重要基础。目前应用于法医检验中的多态性遗传标记主要有s t r 长 度多态性和m t d n a 序列多态性1 1 ，2 1 。s t r 是法医d n a 分析中应用 最广泛的长度多态性遗传标记，s t r 基因座在基因组中分布广泛， 其等位基因片段长度多在4 0 0 b p 以下，扩增成功率高，适用于大多 数法医物证检材的检验：s t r 基因座等位基因在各种检测技术中容 易得到准确分型，多个s t r 基因座同时使用，可有较高的个人识别 和非父排除能力，在法医个人识别和亲子鉴定中有较大的使用价值。 s t r 分析以高灵敏度、高鉴别能力和标准化分型等特点成为目前法 医d n a 分析中的主流技术1 3 j 。 人类基因组中广泛分布的s t r 基因座为遗传学研究和应用提供 了高信息量遗传标记的丰富来源【4 。8 】，但目前仅有一部分s t r 基因座 被利用。法医检验实际工作需要我们进一步增加新的s t r 遗传标记， 提高s t r 的检测能力。不同人群s t r 基因座的群体遗传学数据有一 定差别，在使用s t r 遗传标记进行法医学个人识别和亲子鉴定前必 须进行群体调查，得出基因频率、多态信息含量、观察杂合度等多 态性数据，给检验结果提供参考。 在法医实践中，由于现场检材受外界环境的影响较多，易被其 它有机质污染，动物血或组织是常见的污染源之一。动物血的污染 对检测结果造成较大影响，选择有种属特异性的s t r 基因座进行法 医学检验可以避免动物血对检测结果的影响。s t r 基因座的种属特 异性分析可以为选取新的s t r 基因座提供参考。 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 目前最常使用的s t r 基因座主要来自遗传学数据库( g e n e t i c d a t a b a n k ，g d b ，h t t p ：h w w w g d b o r g ，而g d b 中大多数基因座尚未 进行群体调查。本课题选择了6 个四核苷酸重复s t r 基因座，即 d 4 s 2 3 6 6 、d 4 s 2 3 6 7 、d 6 s 4 7 4 、d 6 s 1 2 8 1 、d 2 s 1 3 9 6 和d 2 0 s 6 0 1 ， 利用扩增片段长度多态性技术研究其在中国成都汉族群体的遗传多 态性及种属特异性，以期为法医遗传学应用提供新的s t r 遗传标记。 6 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 材料与方法 1 材料 1 1 样本 1 1 0 名无血缘关系个体均来自成都汉族群体，遵照知情同意原 则，采集其静脉血，e d t a 抗凝，一2 0 保存；猴、猪、狗、牛、羊、 鸡、鸭、鱼、猫、兔、豚鼠、家鼠、鳝鱼和蛙1 4 种常见动物组织， 2 0 c 保存。 1 2 试剂 t a q 酶( 华美，国产) ：d n t p ( p h a r m a c i a ，瑞典) ；p r o t e a s e k ( p h a r m a c i a ，瑞典) ：丙烯酰胺( 分析纯，国产) ；甲叉双丙烯酰胺 ( f l u k a ，瑞士) ；t r i s ( p h a r m a c i a ，瑞典) ；硼酸( 分析纯，国产) ；e d t a ( 分 析纯，国产) ；p c r 产物纯化试剂盒( v i t a g e n e ，国产) ：5 0 b p d n a l a d d e r ( 天为时代，国产) ；其余试剂均为国产分析纯。 本研究中的6 对引物均由北京华大公司合成。 1 3 仪器 p e 9 6 0 0 扩增仪( a b i 公司，美国) ；高速离心机( e p p e n d o r f 公 司，德国) ；多功能电泳仪( p h a r m a c i a ，瑞典) ；d y y - i i l 2 8 6 型电泳槽 ( 北京六一仪器厂) ；x h - 8 9 漩涡振荡器( 浙江乐清仪器厂) ：可调 移液器( e p p e n d o r f 公司，德国) ；纯水体系( m i l l i p u r e ，法国) ；去离 子水体系( e a s y p u r er f , 美国) ：恒温水浴箱；a b i3 7 7 型自动d n a 序列分析仪( a b i ，美国) 。 i 四) j l 大学硕士学位论文张伟娟 2 方法 2 1d n a 提取 用c h e l e x 法提取1 1 0 份血样本d n a ( 详见附录1 ) 。 2 2p c r 扩增 6 个s t r 基因座引物序列均查自于g d b 数据库，引物序列见表 1 1 。p c r 反应体系总体积为3 7 5 t x l ，其中模板d n a 约为2 2 0 n g ， 1 d n t p 6 i l ( 2 0 0 j m o l l ) ，1 0 缓冲液( b u f f e r ) 3 7 5 “l ，m 9 2 + 2 2 5 9 l ( 1 5 m m o l l ) ，t a g 酶0 3 9 l ( 1 5 0 ) ，引物各o 3 1 a l ( 5 0 i t m o l l ) ，牛血 清蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 3 7 5 “l ( 1 6 m g l ) 。6 个s t r 基因座的p c r 扩增参数见表1 2 。 表1 1 s t r 基因座的引物序列 8 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 2 3 等位基因分型标准物的制各 6 个s t r 基因座的p c r 扩增产物均采用非变性聚丙烯酰胺凝胶 垂直电泳分离，硝酸银染色法显示电泳谱带( 垂直电泳及染色的详 细步骤分别见附录2 和附录3 ) 。在硝酸银染色显带后的凝胶上，选 择基因座的每一种等位基因片段，从电泳谱带处切下凝胶；分别置 于0 5 m l 的e p 管中，加0 1 m l 左右的1 t e 缓冲液浸泡；3 7 水浴， 4 8 h 7 2 h 后取出；离心l m i n ，一2 0 保存备用。 用引物分别扩增各基因座的等位基因凝胶浸泡液，将p c r 扩增 产物混合起来，制成各基因座的等位基因分型标准物【9 l 。 2 4 等位基因的测序和命名 对各基因座所有等位基因的凝胶浸泡液分别进行p c r 扩增，用 d n a 纯化试剂盒纯化p c r 扩增产物( 详细步骤见附录4 ) 。对纯化 后的p c r 扩增产物在a b l 3 7 7 自动测序仪上直接测序。 每个基因座上的等位基因经过测序后，按照国际法医血液遗传 学会d n a 委员会( t h ed n ac o m m i s s i o no ft h ei n t e r n a t i o n a ls o c i e t y o f f o r e n s i ch a e m o g e n e t i c s , i s f h ) 推荐的原则进行命名【1 0 】。 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 2 5 非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分型 每个s t r 基因座的p c r 扩增产物与等位基因分型标准物和 5 0 b p 梯度的分子量分型标准物同步电泳，硝酸银染色法显示电泳谱 带。根据等位基因分型标准物和分子量分型标准物确定扩增产物的 有无，观察样本中等位基因的情况。 2 6s t r 基因座种属特异性分析 提取1 4 种常见动物组织的d n a ，并用上述2 5 中垂直电泳的方 法对这6 个s t r 基因座进行种属特异性分析。 2 7 统计学分析 采用计数法直接计数s t r 基因座的等位基因频率，应用 p o w e r s t a t s 软件( h t t p ：f w w w p r o m e g a c o r n ) 对数据进行统计分 析，获得各基因座的基因型频率、匹配概率( p r o b a b i l i t yo fm a t c h p m ) 、观察杂合度( o b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t y ，h 。) 、多态信息含量 ( p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t ，p i c ) 、个人识别率( p o w e ro f d i s c r i m i n a t i o n ，d p ) 和非父排除率( p o w e ro fe x c l u s i o n ，e p ) 。按 肚刍1 1 - 喜p ? 户算期望杂厶度( e x p e c t e d h e t e r o z y g o s i t y , h e ) ，其 中n 为样本中所有等位基因的总数，七为等位基因种类的数目，p 。 为样本第j 个等位基因的频率；按h o u ，s 等的方法进行 h a r d y w e i n b e r g 平衡分析。 1 0 四川大学硕士学位论文张伟娟 结果 1 等位基因序列和命名 上述6 个s t r 基因座，为分析其等位基因序列，按i s f h 推荐的 原则进行命名，本课题对各基因座的所有等位基因进行了测序。各 基因座的等位基因序列和命名见表1 - 3 、表卜4 、表1 5 、表1 6 、 表1 7 和表卜8 。 表卜3d 4 s 2 3 6 6 基因座的等位基因序列和命名 表卜4d 4 s 2 3 6 7 基因座的等位基因序列和命名 婴型盔堂堡主茎焦监塞鲞笪塑 表1 5d 6 s 4 7 4 基因座的等位基因序列和命名 竺垡茎里苎垦奎! ：! 堕! 重墨堕壁型 一 15 i51 4 5 b p ( t a g a ) l s 5 2 b p 16 15 5 4 5 b p ( t a g a ) 1 6 5 2 b p 17 15 9 4 5 b p ( t a g a ) t v 5 2 b p 18 i6 3 4 5 b p ( t a g a ) i s 5 2 b p 1 9 1 6 7 4 5 b p ( t a g a ) 1 9 5 2 b p 2 0 17i 4 5 b p ( t a g a ) 2 0 5 2 b p 表l 一6d 6 s 1 2 8 1 基因座的等位基因序列和命名 等位基因 片段大小( b p ) 蘑复区序列 _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ h _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ 一一一 1 21 7 3 2 1 b p ( t t a g ) 4 t t a a a g a ( t a g a ) s 9 7 b p 1 41 8 l 2 1 b p ( t t a g ) s t t a a a g a ( t a g a ) 9 9 7 b p 1 71 9 3 2 1 b p ( t t a g ) 6 t t a a a g a ( t a g a ) i t 9 7 b p 1 8 1 9 7 2 i b p ( t t a g ) 6 t t a a a g a ( t a g a ) t 2 9 7 b p 1 92 0 1 2 1 b p ( t t a g ) 6 t t a a a g a ( t a g a ) i a 9 7 b p 2 0 2 0 5 2 1 b p ( t t a g ) 6 t t a a a g a ( t a g a ) 1 4 9 7 b p 2 l 2 0 9 2 1 b p ( t t a g ) 6 t t a a a g a ( t a g a ) 1 5 9 7 b p 表卜7d 2 s 1 3 9 6 基因座的等位基因序列和命名 箜垡墨里生垦查尘! 塑! 里墨垦壁型 8 1 15 3 9 b p ( t a t c ) a 4 4 b p 9 1 19 3 9 b p ( t a t c ) 9 4 4 b p 1 0 1 2 3 3 9 b p ( t a t c ) t 0 4 4 b p 11 l2 7 3 9 b p ( t a t c ) n 4 4 b p 12 131 3 9 b p ( t a t c ) j 2 4 4 b p 1 2 i 四) j l 大学硕士学位论文张伟娟 表卜8d 2 0 s 6 0 1 基因座的等位基因序列和命名 等位基因片段大小( b p )重复区序列 61 0 0 3 2 b p ( c t a t ) 6 4 4 b p 810 8 3 2 b p ( c t a t ) s 4 4 b p 9 11 2 3 2 b p ( c t a t ) 9 4 4 b p l o1 1 6 3 2 b p ( c t a t ) 1 0 4 4 b p 1 11 2 0 3 2 b p ( c t a t ) n 4 4 b p 1 21 2 4 3 2 b p ( c t a t ) l z 4 4 b p 1 31 2 8 3 2 b p ( c t a t ) t ，4 4 b p 2 各基因座电泳分型结果 p c r 扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分型，6 个s t r 基因座的p c r 扩增产物均得到良好的分型。电泳时以已知 样本作为阳性对照，以不加d n a 模板的空白试剂扩增后的产物作为 阴性对照。以d 2 s 1 3 9 6 基因座为例，电泳分型图见图1 一l 。d 2 s 1 3 9 6 基因座等位基因分型标准物的5 个等位基因，从阴极到阳极依次命 名为1 2 、1 l 、1 0 、9 和8 ，根据等位基因分型标准物和分子量分型 标准物，1 7 号样本分型结果依次为8 8 、8 8 、8 - 8 、8 - 8 、8 - 1 l 、 1 1 1 1 和1 1 1 2 。 图1 1 d 2 s 1 3 9 6 基因座电泳分析图 图左侧数字为分子量分型标准物的大小，图上方数字1 7 为样本编号，“m ” 代表等位基因分型标准物，“l ”代表分子量分型标准物，“阳”代表阳性对照， “阴”为阴性对照。图上方为阴极，下方为阳极。 1 3 婴型盔堂堡主茎焦堕兰鲞笪塑 3 各基因座遗传多态性研究结果 6 个s t r 基因座等位基因分型标准物构建及命名方法如前所述。 各基因座分型观察值见表卜9 。按照上述数据处理方法进行处理， 获得基因频率及多态性参数值见表卜1 0 和表卜1 1 。 表卜9 成都汉族6 个s t r 基因座的基因型分布 g p ：g e n o t y p e ( 基因型) ；o b e ：o b s e r v e d ( 观察值) 1 4 i 四) j l 大学硕士学位论文张伟娟 h a r d y - w e i n b e r g 平衡检验 表卜1 1 成都汉族6 个s t r 基因座的遗传多态性数据 1 5 四川大学硕士学位论文张伟娟 4 种属特异性分析 对6 个s t r 基因座进行种属特异性分析，电泳结果见图1 - 2 、图 1 3 、图1 4 、图1 5 、图1 6 和图1 7 。1 4 种动物在d 2 0 s 6 0 l 基因座 未见任何扩增产物；猴子在d 4 s 2 3 6 6 、d 4 s 2 3 6 7 、d 6 s 4 7 4 、d 6 s 1 2 8 1 和d 2 s 1 3 9 6 基因座的分型区内有扩增产物，且其片段大小与人的 d n a 扩增产物片段大小接近。除猴子外，在d 4 s 2 3 6 6 基因座分型区 内，狗、猪、猫和豚鼠有少量扩增产物；在d 4 s 2 3 6 7 基因座分型区 内鸡、牛和猪有少量扩增产物；在d 6 s 4 7 4 基因座分型区内狗有少 量扩增产物；在d 6 s 1 2 8 1 基因座分型区内牛、猪、鱼和兔有少量扩 增产物；在d 2 s 1 3 9 6 基因座分型区内牛和猪有少量扩增产物。羊、 鸭、家鼠、鳝鱼和蛙在6 个基因座均未见扩增产物。 图1 - 2 1 4 种动物在d 4 s 2 3 6 6 基因座电泳分析图 图左侧数字为分子量分型标准物的大小，图上方数字1 1 7 为样本编号，l ： 牛，2 ：猪，3 ：羊，4 ：猫，5 ：鸡，6 ：鸭，7 ：l ，8 ；鱼，9 ：兔，l o ：豚 鼠，l l ：家鼠，1 2 ：蛙，1 3 ：鳝鱼，1 4 ：阴，1 5 ：阳，1 6 ：狗，1 7 ：猴。“l ” 代表分子量分型标准物，“阳”代表人类d n a 的p c r s t r 分型结果作为阳 性对照，“阴”为阴性对照。图上方为阴极，下方为阳极。 1 6 四川大学硕士学位论文张伟娟 图1 。3 1 4 种动物在d 4 s 2 3 6 7 基因座电泳分析图 图左侧数字为分子量分型标准物的大小，图上方数字1 1 7 为样本编号，1 ： 牛，2 ：猪，3 ：羊，4 ：猫，5 ：鸡，6 ：鸭，7 ：l ，8 ；鱼，9 ：兔，1 0 ：豚 鼠，l 】：家鼠，1 2 ：蛙，】3 ：鳝鱼，1 4 ：阴，1 5 ：阳，】6 ：狗，】7 ：猴。“l ” 代表分子量分型标准物，“阳”代表人类d n a 的p c r s t r 分型结果作为阳 性对照，“阴”为阴性对照。图上方为阴极，下方为阳极。 图1 4 1 4 种动物在d 6 s 4 7 4 基因座电泳分析图 图左侧数字为分子量分型标准物的大小，图上方数字1 1 7 为样本编号，1 ： 牛，2 ：猪，3 ：羊，4 ：猫，5 ：鸡，6 ：鸭，7 ：l ，8 ：鱼，9 ：兔，l o ：豚 鼠，1 1 ：家鼠，1 2 ：蛙，1 3 ：鳝鱼，1 4 ：阴，1 5 ；阳，1 6 ：狗，1 7 ：猴。“l ” 代表分子量分型标准物，“阳”代表人类d n a 的p c r s t r 分型结果作为阳 性对照，“阴”为阴性对照。图上方为阴极，下方为阳极。 1 7 四川丈学硕士学位论文张伟娟 图1 5 1 4 种动物在d 6 s 1 2 8 1 基因座电泳分析图 图左侧数字为分子量分型标准物的大小，图上方数字l 1 7 为样本编号，1 ： 牛，2 ：猪，3 ：羊，4 ：猫，5 ；鸡，6 ：鸭7 ：l ，8 ：鱼，9 ：兔。1 0 ：豚 鼠，1 1 ；家鼠，1 2 ：蛙，1 3 ：鳝鱼，1 4 ：阴，1 5 ：阳，1 6 ：狗，1 7 ：猴。“l ” 代表分子量分型标准物，“阳”代表人类d n a 的p c r s t r 分型结果作为阳 性对照，“阴”为阴性对照。图上方为阴极，下方为阳极。 图1 - 6 1 4 种动物在d 2 s 1 3 9 6 基因座电泳分析图 图左侧数字为分子量分型标准物的大小，图上方数字1 1 7 为样本编号，1 ： 牛2 ：猪，3 ；羊，4 ：猫，5 ：鸡，6 ：鸭，7 ：l ，8 ；鱼，9 ：兔，1 0 ：豚 鼠，1 l 家鼠，1 2 ：蛙，1 3 ：鳝鱼，1 4 ：阴，1 5 ：阳，1 6 ：狗，1 7 ；猴。“l ” 代表分子量分型标准物，“阳”代表人类d n a 的p c r s t r 分型结果作为阳 性对照，“阴”为阴性对照。图上方为阴极，下方为阳极。 1 8 i 四) j l 大学硕士学位论文张伟娟 图l - 7 1 4 种动物在d 2 0 s 6 0 1 基因座电泳分析图 图左侧数字为分子量分型标准物的大小，图上方数字1 1 7 为样本编号，l ： 牛，2 ：猪，3 ：羊，4 ：猫，5 ：鸡，6 ：鸭，7 ：l 。8 ：鱼，9 ；兔，1 0 ：豚 鼠，1 1 ：家鼠，1 2 ：蛙，1 3 ：鳝鱼，1 4 ：阴，1 5 ：阳，1 6 ：狗，1 7 ：猴。“l ” 代表分子量分型标准物，“阳”代表人类d n a 的p c r s t r 分型结果作为阳 性对照，“阴”为阴性对照。图上方为阴极，下方为阳极。 1 9 四川大学硕士学位论文张伟娟 讨论 1 各基因座的遗传多态性 6 个s t r 基因座中d 2 s 1 3 9 6 基因座共观察到5 个等位基因，等 位基因8 频率高达0 6 0 7 ，而等位基因1 2 频率仅为o 0 6 1 ；d 4 s 2 3 6 7 共观察到7 个等位基因，等位基因8 频率最高为o 5 5 4 ，而等位基因 1 3 的频率最低为0 0 2 1 。实验结果说明d 2 s 1 3 9 6 和d 4 s 2 3 6 7 基因座 在成都汉族人群中的基因频率分布较差。d 4 s 2 3 6 6 、d 6 s 4 7 4 、 d 6 s 1 2 8 1 和d 2 0 s 6 0 1 在成都汉族群体中等位基因个数分别为7 、6 、 7 和7 ，基因频率分布较好，详见表1 1 0 。遗传多态性研究显示6 个s t r 基因座的杂合度分布在0 5 4 2 0 8 0 2 之间。其中d 4 s 2 3 6 6 的观察杂合度和多态信息量分别达到o 8 0 2 和o 7 1 ，多态性最好； d 2 s 1 3 9 6 的观察杂合度和多态信息量分别为0 5 4 2 和0 5 6 ，多态性 最差。除d 2 s 1 3 9 6 外，5 个基因座的个人识别率均达到0 8 2 以上。 群体遗传学和法医学数据提示：上述d 4 s 2 3 6 6 、d 6 s 4 7 4 、d 6 s 1 2 8 l 和d 2 0 s 6 0 1 基因座可作为法医学个人识别和亲子鉴定新的候选遗传 标记，d 2 s 1 3 9 6 和d 4 s 2 3 6 7 基因座应用于法医学时鉴定能力较差。 2 种属特异性分析 在法医学检验中常用的s t r 基因座大多是针对人类基因组特有 的序列设计引物。人类特异性引物只能与人类的基因组d n a 相结 合，扩增出人类特有的d n a 片段，动物的基因组d n a 没有扩增产 物或者扩增产物在人类基因组d n a 的p c r 扩增产物分型区外，这 样的s t r 基因座具有种属特异性。但并不是所有的s t r 基因座都具 有种属特异性 。这就要求新的s t r 遗传标记被用于法医学个人识 别和亲子鉴定之前进行种属特异性分析【l 4 1 。 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 本课题中对6 个s t r 基因座做种属特异性分析结果显示，在 d 2 0 s 6 0 1 基因座，对1 4 种动物d n a 扩增，未见任何p c r 扩增产物， 说明d 2 0 s 6 0 1 有良好的种属特异性；在另外5 个基因座，猴子有扩 增产物且其片段大小与人的d n a 扩增产物片段大小接近，无法与人 的d n a 扩增产物区别，说明猴子和人的种属关系较近：羊、鸭、家 鼠、鳝鱼、蛙在6 个基因座均没有扩增产物，也说明它们和人的种 属关系较远。其它个别动物d n a 在不同的基因座有很少的扩增产 物。所以在法医学实践中使用这些基因座做现场血痕的个人识别时， 一定要考虑到动物血对检测结果的影响，以常见动物血作为对照样 本，通过优化p c r 扩增条件等，达到区分人d n a 与动物d n a 的 p c r 扩增产物【l5 1 ，进一步进行个人识别的目的。 需要指出，在法医学个人识别和亲子鉴定中常常要采用统计学 中的乘积定律( p r o d u c tr u l e ) 方法检测多个遗传标记来达到极小概率 事件【1 6 】，支持同一性或认定亲子关系的结论。所检测的各个系统遗 传标记之间具备独立性是运用乘积定律的先决条件。一般情况下， 位于不同染色体的基因座和位于同一染色体上物理距离大于1 0 m b 以上的基因座处于连锁平衡( 1 i n k a g ee q u i l i b r i t m a ，l e ) 状态，基因座之 间相互独立。但确定基因座之间是否存在连锁及连锁关系如何，不 能仅依据物理距离或遗传距离1 1 7 j ，还需要调查分析大量的家系资料 才能得出结论【”】。d 4 s 2 3 6 6 与d 4 s 2 3 6 7 、d 6 s 6 7 4 与d 6 s 1 2 8 1 之间， 以及这6 个s t r 基因座和其它正在使用的基因座之间是否存在连锁 关系及连锁关系如何是下一步研究工作的重点。本项研究仅仅是为 这6 个s t r 基因座的法医学应用作了初步的工作，尚有大量的实验 研究需要完成，如基因座突变率的分析，基因座在中国其他民族中 的研究等。 2 四川大学硕士学位论文张伟娟 结论 在本课题中，利用人类常染色体基因组的s t r 基因座信息，寻 找了6 个s t r 基因座，并合成了相应的引物。通过对1 1 0 个样本的 p c r 扩增、电泳分型和测序，分析了这6 个s t r 基因座的等位基因 序列，按照i s f h 的推荐原则进行了标准化命名。结果显示6 个s t r 基因座能进行高效而特异的p c r 扩增和准确的电泳分型。其中， d 4 s 2 3 6 6 、d 6 s 4 7 4 、d 6 s 1 2 8 1 和d 2 0 s 6 0 1 基因座基因频率和多态 性较好，是高信息量的遗传标记，可作为法医学个人识别和亲子鉴 定新的候选遗传标记。d 2 s 1 3 9 6 和d 4 s 2 3 6 7 基因座应用于法医学时 鉴定能力较差。对6 个s t r 基因座做种属特异性分析，结果显示： d 2 0 s 6 0 1 有良好的种属特异性；在另外5 个s t r 基因座，猴子有扩 增产物且其片段大小与人的d n a 扩增产物接近，无法与人的d n a 扩增产物区别。因此，在法医学实践中使用这5 个s t r 基因座做现 场血痕的个人识别时，一定要考虑到动物血对检测结果的影响。 i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 参考文献 1 侯一平法医学第l 版北京：高等教育出版社，2 0 0 4 ，1 5 1 15 9 2 吴梅筠法医物证学第1 版北京：人民卫生出版社，1 9 9 8 ，1 5 0 一1 8 5 3 侯一平法医物证学第2 版北京：人民卫生出版社，2 0 0 4 ，4 8 1 3 1 4 h e a r n ec m ，g h o s hs ，t o d dj a m i c r o s a t e l l i t e sf o rl i n k a g ea n a l y s i s o fg e n e t i ct r a i t s t r e n d sg e n e t ，19 9 2 ，8 ( 8 ) ：2 8 8 - 2 9 4 5 a l f o r dr l ，h a m m o n dh a ，c o t oi ，e ta 1 r a p i da n de f f i c i e n t r e s o l u t i o no fp a r e n t a g eb ya m p l i f i c a t i o no fs h o r tt a n d e mr e p e a t s a m jh u m g e n e t ，1 9 9 4 ，5 5 ( 1 ) ：1 9 0 1 9 5 6 h a m m o n dh a ，j i nl ，z h o n gy ，e ta 1 e v a l u a t i o no f1 3s h o r tt a n d e m r e p e a tl o c if o ru s ei np e r s o n a li d e n t i f i c a t i o na p p l i c a t i o n s a mjh u m g e n e t ，1 9 9 4 ，5 5 ( 1 ) ：1 7 5 1 8 9 7 b r i n k m a n nb ，j u n g ea ，m e y e re ，e ta 1 p o p u l a t i o ng e n e t i cd i v e r s i t y i nr e l a t i o nt om i c r o s a t e l l i t e h e t e r o g e n e i t y h u mm u t a t ，19 9 8 ， 1l ( 2 ) ：1 3 5 - 1 4 4 8 m e y e re ，w i e g a n dp ，r a n ds p , e ta 1 m i c r o s a t e l l i t ep o l y m o r p h i s m s r e v e a lp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p si np r i m a t e s jm o le v o l ，1 9 9 5 ， 4 1 ( 1 ) ：1 0 1 4 9 张霁，侯一平，吴谨，等中国人群9 号染色体1 0 个s t r 基因座的遗 传多态性及其在法医学中的应用中华医学遗传学杂 志，2 0 0 0 ，1 7 ( 6 ) ：4 1 7 4 2 1 1 0 b a rw ，b r i n k m a n nb ，l i n c o l np ，e ta 1 d n ar e c o m m e n d a t i o n s - 1 9 9 4 r e p e a tc o n c e r n i n g f u r t h e rr e c o m m e n d a t i o n s o ft h ed n a i 四jj l 大学硕士学位论文张伟娟 c o m m i s s i o no ft h ei s f hr e g a r d i n gp c r b a s e dp o l y m o r p h i s m si n s t r ( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ) s y s t e m s i n tjl e g a lm e d ，1 9 9 4 ，1 0 7 ： 1 5 9 1 6 6 11 b a rw ，b r i n k m a n nb ，b u d o w l eb ，e ta 1 d n ar e c o m m e n d a t i o n s f u r t h e rr e p o r to ft h ed n ac o m m i s s i o no ft h ei s f hr e g a r d i n gt h e u s eo fs h o r tt a n d e mr e p e a ts y s t e m s i n t e r n a t i o n a ls o c i e t yf o r f o r e n s i ch a e m o g e n e t i c s i n tjl e g a lm e d ，1 9 9 7 ，1 1 0 ( 4 ) ：1 7 5 - 1 7 6 1 2 h o uy ，p r i n zm ，s t a a km c o m p a r i s o no fd i f f e r e n tt e s t sf o r d e v i a t i o nf r o mh a r d y - w e i n b e r ge q u i l i b r i u mo fa m p f l pp o p u l a t i o n d a t a a d v a n c e si nf o r e n s i c h a e m o g e n e t i c s 5 b e r l