（动物学专业论文）黄鼬（mustelia+siberica）气味对黑线姬鼠（apodemus+agrarius）雄雄竞争的影响.pdf

摘要 y 吝躲囊嬲 本研究以分布于鲁中南山地丘陵的黑线姬鼠( 4 p d 如坍淞铭阳r f 淞) 为研 究对象，利用黄鼬九，据妇5 舾e r f ) 肛腺模拟田鼠天敌的气味源，系统研究 了雄性黑线姬鼠在长期黄鼬气味影响下社会冲突的改变。主要研究结论如 下： 1 利用新型荧光试剂1 ，2 苯并3 ，4 二氢咔唑- 9 乙基肼基甲酸酯( b c e c ) 作柱前衍生化试剂，在h y p e r s i lb d sc 1 8 ( 4 6 2 0 0 m m ，5 “m ) 色谱柱上，采 用梯度洗脱对皮质醇、皮质酮、睾酮、孕酮四种类固醇荧光衍生物进行了优 化分离。6 5 下在乙腈溶剂中以三氯乙酸作催化剂，衍生反应2 小时后获得稳 定的荧光产物。激发和发射波长分别为九。= 一3 3 3 姗，九。= 3 9 0 咖。采用大气 压化学电离源( a p c d 正离子模式，实现了黑线姬鼠粪便中四种类固醇化合物 的定性及定量测定。线性回归系数均在o 9 9 9 9 以上，检测限为4 7 3 7 1 2 6 n o l 。 2 胁迫之后攻击行为频次的升高认为是由肾上腺激素调节的一种积极适 应策略。雄性黑线姬鼠在第l 天的攻击行为频次比对照组显著升高 ( z = 2 2 1 ，p = o 0 2 8 ) 。第1 天实验组攻击行为比对照组显著升高 ( z = 2 2 1 ，p = o 0 2 8 ) ，而在第2 1 天和第2 8 天实验组攻击行为显著下降( d a y 2 1 ， z = 2 2 6 ，p = o 0 2 ；d a y 2 8 ，z = 2 1 ，p = 0 0 3 7 ) 。说明，短期( 6 小时) 气味 处理能促进雄性黑线姬鼠攻击行为的发生，而长期气味影响下显著抑制雄性 黑线姬鼠攻击行为的发生。 3 实验组在第2 1 天和第2 8 天攻击潜伏期显著升高说明长期暴露在黄鼬 气味下，雄性黑线姬鼠攻击潜伏期显著上升；对攻击行为与攻击潜伏期的相 关线性分析结果表明，攻击强度随攻击潜伏期的增加而显著降低。说明在社 会冲突中攻击行为发生的越早攻击的强度越大。 4 黄鼬气味对雄性黑线姬鼠的脾脏、肾上腺、生殖器官及精子数量没有 影响。实验结果支持天敌气味对鼠类的生殖生理器官影响不显著。 5 雄性黑线姬鼠在应对不同的胁迫处理中内分泌反应调节机制不同。2 8 天内5 次社会冲突后对照组中胜利鼠和失败鼠皮质酮水平没有显著变化。说 明，皮质酮不受社会冲突胁迫过程影响。捕食风险条件下，社会冲突中胜利 鼠和失败鼠皮质酮水平都升高，失败鼠和胜利鼠都受胁迫。 在长期社会冲突中，胜利者长期处在高皮质醇水平，因而受到的胁迫更 大。在捕食风险下，失败鼠皮质醇没有发现显著变化，胜利鼠皮质醇的分泌 受到抑制。 对照组中胜利鼠和失败鼠在后三次的社会冲突中睾酮水平均高于前几 次水平，睾酮分泌量的增加是在未来的冲突中取得获胜的机会。实验组中胜 利鼠在第7 天社会冲突中睾酮水平高于处理前水平，第2 1 天和第2 8 天没有 显著变化，说明捕食风险加速睾酮的分泌并且在长时间内( 1 4 天后) 会抑制 睾酮的分泌。 关键词：高效液相色谱一质谱，荧光检测，社会冲突，天敌气 味，皮质醇，皮质酮，睾酮 e f f e c to f p r e d a t i o no d o r o nm a l e m a l e c o n n i c t i o no fs t r i p e d 置i e l dm i c e ( a p o d e m h s 口g r n r i l l s ) a b s t r a c t p r e d a t i o ni s0 n eo ft l l es 仃o n g e s ts e l e c t i v ep r e s s u r c s m u s t e l i do d o r sh a v e b e e ns h o w nt os u p p r e s sb r e e d 抽gi nv o l e s 日l em e c h a n i s mb e h j n dm e s u p p r c s s i o i su i l k n o w n - s o c i a l n f h c ti sn e c e s s a r yf o rs u c c e s s 如lr 印r o d u c t i o n ， a n df o r 也ed e f b n s eo fr e s o u r c e s e n g a g i n gi ns o c i a lc o i l f l i c ti sn e c e s s a r yf o r 也e 内嘞a t i o no fs o c i a ls 仃u c t l l r e s o c i a lb e h a v i o ri n t e r a c t sw i t l lt h eh o n n o n e sa n d i i i m l u n en m c t i o r ri l lac o 瑚l e xb i d i r e c t i o n a lf 嬲l l i o n h o n n o n e sc a na c td i r e c t l y o nt h en e u r a jc i 试t st l l a tr e g u l a t es p e c i f i cb e h a v i o r st oc h a n g et h e 如n c t i o n i l l go f m o s ec i r c u i t sa n dt 1 1 e r e b yc h a n g e 也ee x p r e s s i o no f b e h 州o r ；s o c i a le n c o u n t e r s c 趿r c g i l la _ t et h ek v e l so f v a r i o l l sh o r n l o n e sa n d i l l f l u e n c ei m m u n e 血n 嘶o no f 也e i n d h i d u a l s m e a s 砸n gs t e r o i dh o 珊o n ei i l e t a b o l i t c s i i lf a ls a m p l e sh a sb e c o m ea 谢d e l ya p p r c c i 8 t e dt e c h i l i q u e ，b e c a u s ei th a sb e e np r o v e dt ob eap o w e r f i l l n 0 1 1 i n v a s i v et o o lm a tp r o v i d e si i n p o r t a mi 墒衄a t i o na b o u t 锄a n i m a l se n d o c r i n e s t a _ m s ( a d r e n o c o r t i c a la c 垃v i t ya n dr e p m d u c t i v es t a t u s ) m e a s u r c m e mo ft h e s e h o m o n e si n 慨a le x 仃a c t sb yl l i g h - p e r f o m a n c el i q l l i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) 、棚v a l i d 融e du s i n gc h e m i c a ld 喇v a t i z a t i o n ，m a s ss p e c 廿o m e 缸y 1 1 1 i ss t u d yi n v e s t i ga _ t e d ：1 ) t od e v e l o par n e 出o df o ra s s e s s m e n to ff e c a l 出u c o c o r t i c o i d s ( s p e c i f i c a l l yc o r t i s o l 如dc o m c o s t c r o n 船a m e a s u r eo fs t r e s si n r o d e n t s ，s p e c i f i c a l l ys 仃i p e df i e l dm i c e 和d 出埘淞q g r 甜f 淞，2 ) t h ee 彘c to fs o c i a l c o n n i c to nt h eb e h a v i o r ，p h y s i o l o g ya 1 1 de n d o c r i n cr e s p o n s eo fm a l es t r i p e df i e l d m i c e ，3 ) e x a m 砸e dt h ee f r e c 乜o fp r e d 酏0 ro d o ro nm ei n c i d e n c eo fa g g r e s s i v e b e h a v i o r sb e c 、v e e nm a l es 埘d e d 丘e l dm i c er e l a t i v et ou n s t r e s s e dc o m m l s t h e 3 m a i nr e s u l t so f n l i sa r ea sf b l l o w 1 as i m p l ea n ds e n s i t i v em e m o df o rm ed e t e n i n a t i o no fs t e r o i dc o i n p o 吼d s e x 订a c t e d 矗o mm i c ef e c c su s i n g 1 ，2 - b e n z o 一3 ，4 - d i h y 出o c a r b a z 0 1 e 9 一e 也y 1 - c a r b o n y l h y d a z i i l e( b c e c )a sp r e - c o l u m d e r i v a t i z a t i o n r e a g e n tb yh i 鲈- p e r f o 肋a n c el i q u i dc l l l o m a t o f 印h yi nc o m b i n a t i o n 、i mag r a d i e me l u t i o n 讯t h n u o r e s c e n c ed 酏e c t i o na j l dm a s ss p e c 仃o m e t r i ci d e n t i f i c a t i o nh a sb e e d e v e l o p e d s t i l d i e so nd e r i v a t i z a t i o nc o n d i t i o n si n d i c a t et h a ts t e r o i dc o m d o u n d sr e a c tw i t l l b c e ca t6 5 w i t h i nat w o - h o u rp e r i o di nm ep r e s e n c eo ft r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) c a t a l y s tw i 血a c e 幻工l i t r i l ea sr e 枷o nc o s o l v e n tt og i v em ec o r r c s p o 蹦n g s e n s i t i v en u o r e s c e n c ed e r i v a t i v e s t h ef l u o r e s c e n c ee x c i t a t i o na n de m i s s i o n w a v e l e n g t l l sa r es e ta tk x3 3 3a n d 九c m 3 9 0 n m ，r e s p e c t i v e l y t h ei d c m i f i c a t i o no f s t c r o i dd e r i v a t i v e si sp 曲n n e d 皿d e ra p c is o u l _ c ei n p o s i t i v e i o nm o d c c 0 l t e l a t i o nc o e m c i e n t sf o rs t e r o i dd e r i v a d v e sa r e o 9 9 9 9 ，a n dd e t e c t i o nl i m i t s ( a ts i 盟a l - t o n o i s er a t i oo f3 ：1 ) 勰4 7 3 7 1 _ 2f b l 0 1 1 札e s t a b l i s h e dm e t l l o di s s e n s i d v ea n dr c 翟r o d u c i b l ef o r 也ed e t 锄i n 鲥彻o fs 删dc o m p o u n d s 丘d mr e a i s 鼬p l e sw i ms a t i s f a c t o f yr e s u l t s 2 o u rd a t a 妯d i c a t et 1 1 a t 也e r ca r ce 丘b c t so fb o 血s h o r t t e 珊a n dl o n 足t e m p r e d a t o ro d o rs t r e s so n 廿l ei n c i d e n c eo fa g 目e s s i v ec o i l f l i c t s ，a ne f l 爸c tt h a ti s c o 玎e l a t e d 谢mt h e ) aa 越sr e s p o n s e s h o n _ t e n l ls t r e s se x p o s u r es i 鲥f i c a n t l y e l e v a t e dt l l ei i l c i d e n c eo fa g 掣e s s i o n 锄o n gs 仃e s sm i c er e l a t i v et ol l i l s 仃e s s e d c o m m l s ( d a y l ，z = 2 2 1 ，p = o 0 2 8 ) a l t e m a t i v e l y ，l o n g - t e n ns t r e s ss i 印湎c a n n y l o w c r c da g g r e s s i o na l o n gs 讹s s ( d a y 2 l ，z = 2 2 6 ，p = o 0 2 ；d a y 2 8 ，z = 2 1 ， p = o ，0 3 7 、 3 l o n g t e m lp r e d 【t o ro d o rs b c s ss i 嘶f i c a n t l y1 0 w e r e da t t a c kl a t e n c y 锄o n gs 时e s sm i c e ，a r l dt l l e r ew 船as i g n i f i c a mr e l a t i o n s h i pb e t w e e na t t a c k 1 a t e n c ya i l dt o t a la g g r e s s i v eb e h a v i o lm a l e st h a t 甜a c k e de a r l i e rd i s p l a y e dm o r e a g g r e s s i v eb e h a v i o ro v e r a l l 4 l o n g - t e r n lp r c d a t o ro d o r 仃e s sd i dn o ts i g i l m c a n t l ya l t e r 廿1 el i v e r ，s p l c c n ， a 蛔a l ，t 妇t i s ，e p i d i d ) 忸i sa 1 1 ds p e 彻c o u n t a si no t h e rr o d e n ts p e c i e s ， 4 p r e d a t o ro d o rd i dn o ta 腩c tt h er e p r o d u c t i v eo r g a i l sa i l da d r c n a ls i z ei na d u l t m i c e 5 t h em a l em i c ea c t i v a t em e 扛p aa x i sr e 印o n s e st oc o p ew “hd i f f e r e n t s 缸弓s s f u ls o c i a le n 啊啪m e n t a m o n gc o n 仃o li n i c e ，c o m c o s t e r o n el e v e l so ft h e w i 皿e ra i l dl o s e rd i dn o ts i g n i f i c a m l ya l t e lw l l i l eu n d 盯r 印e a t e dp r e d a t o ro d o r ， c o r t i c o s t e n e l e v e l so ft h ew i n i 地ra n dl o s e rw e r es i g n i f i e a n t 时k g h e r 也a n b a s e l i n e p r e d a t o ro d o ri sm o r es 仕e s s f i l lt 1 1 a ns o c i a lc o n t a c tf o rm a l em i c e p r e s u m a b l y ，1 h ep o s i t i v es o c i a li n t e r a c t i o ns u p p r e s s e st h eh p aa x i s 跚d d e c r c a s e sb a s a lc o r t i s 0 1c o n c e n 廿a t i o n st oe i i i n i n a t e 恤ep r e d 砒o ro d o re 疏c t a m o n gc o m r o lm i c e ，c o n i s o l l e v e l so ft l l ew 岫e rw e r e 1 i g h e rm 姐也a to f 血e l o s e r w i i l l l i n g 丘g h t se l e v a t e st e s t o s t e r o n el e v e l si nm a l e m i c ea n de i l l l a i l c e 如n l r e c h a n c et ow i n 丘g h t s 锄o n gc o n 仃_ 0 1 t b s t o s t e r o n el e v e l so ft h ew i r u l e ri n c r c a s e d 诵血p r i o r 汹ge x p e r i e n c e ，w l l i l ep r c d a t o ro d o rc a ne n h 肋c et 1 1 et e s t o s t e r o n e s c c r c 廿o na n d1 0 n 争t e r i ne x p o s u r cc a i li 眦i ts e c r c t i o n k e yw o r d s ：s n p e df i e l di n i c ef ：妒d c 如m z 岱q g ，( 矿f z 叫， l c m s ， n u o r c s c e n c ed e r i v a t i z a t i o n ，s o c i a lc o n n i c t ，p r e d a t o ro d o r ，c o n i s o l ， c o r t i c o s t e r o n e t e s t o s t e r o n e 黄鼬门溉s 纠积s 汤f c 砂气味对黑线姬鼠 d 锄淞删加) 雄雄竞争的影响 绪论 1 前言 黑线姬鼠( 4 即如m 淞昭阳r f 淞p a l l a s1 7 7 1 ) 又名田姬鼠、黑线鼠。属于 鼠科( m 面d a e ) 。体背面黄褐色，通常有一显著黑色纵纹，故称为黑线姬鼠。 黑线姬鼠生态值高，繁殖力强，故分布范围较广，西从中欧东欧俄罗斯至中 亚南西伯利亚乌苏里至朝鲜及中国大部和台湾都有其踪迹。在我国北纬2 5 5 度以北地区广泛分布【1 】。洞道较简单，通常有2 3 个洞口，隧道不深，亦不 甚长，一般i 2 m ，分支不多，通常有3 4 条。每一洞穴大多有2 5 鼠。 此外，有时还筑有很短的临时洞，作为摄食和暂时隐蔽的地方。主要以豆类、 麦类和稻谷为食物，也吃昆虫、蚯蚓、蝌蚪等1 2 。 黑线姬鼠繁殖力强。繁殖期因地区而有所不同。黑线姬鼠每年可生3 6 胎，每胎4 6 仔，有时多至1 0 仔。孕期2 1 2 3 天。3 1 1 月是主要繁殖期， 期间有两次妊娠高潮。第一次4 6 峰尖出现在4 月；第二次7 1 0 月【3 】。 黑线姬鼠最严重危害是传播疫病。已知由黑线姬鼠传播的疾病多达1 7 种【4 】。对农业有害，同时由于与水域关系密切，在血吸虫病流行区内又是血 吸虫的主要宿主之一。此外，还能传播钩端螺旋体、病流行性出血热、土拉 伦斯病、丹毒等传染病【4 】。捕捉地点地处鲁中南山地丘陵区【5 】，由于东南暖 湿气流受山丘拾生，降水较多，年降水较多，年降水6 8 0 9 6 0 毫米，气候 较湿润，为华北亚种( 夏武平) 【。 黄鼬( 肘淞把胁s f 6 p ， 删是农区鼠类的主要天敌1 6 】，在鲁中南山地丘陵区 广泛分布【5 】。黄鼬肛腺是其重要的气味源，肛腺气味的主要挥发性成分对鼠 类有很强的驱避作用【7 8 】。目前对黑线姬鼠的研究主要集中在肥满度【3 j 、繁殖 特性【4 、体外寄生虫【3 】等。研究黄鼬气味对黑线姬鼠的胁迫作用，可以揭示 天敌对猎物的非致死影响的特点，有助于理解天敌对鼠类种群的调节作用和 天敌与猎物的协同进化关系雕”。 社会冲突是动物社会关系稳定和最佳空间利用的形成和维持及资源守 卫的必要手段：个体问的社会冲突是社会结构形成必要条件i l “，因此，对个 体而言，在社会冲突中取得胜利具有重要的意义。 紧张行为( a g o i s t i cb e h a “o r ) 是指同种个体间社会冲突相关的所有行 为包括攻击行为( 如恐吓、攻击、追逐等发生在高水平社会相互作用期间的 行为) 和防御行为( 逃跑和顺从) 等各种形式的通讯。 天敌气味可以传递天敌存在的信息，鼠类借此可以评估危险程度，并且 这种反应是本能的【玎1 “。天敌气味对鼠类的胁迫作用和生殖抑制已经被广泛 用作胁迫因素对动物影响研究的模型【l o ，”1 q 。天敌气味使雄性成年大仓鼠的 攻击行为降低，l 肾上腺膨大，对生殖器官没有影响1 1 4 】；天敌气味对雄性成年 根田鼠的攻击行为未产生影响，但却显著影响其体重【l “。目前，关于天敌的 胁迫对鼠类生殖的影响还有争论。雄性鼠类对天敌气味的反应可能存在种属 间的差异。 胁迫会对动物的行为和生理会产生很大的影响【l ”。研究人员一直在探寻 皮质激素( g c s ) 和性腺激素是如何帮助动物来应对胁迫因子如捕食者、社 群冲突、极端环境以及人类干扰对它们的影响【1 8 ，”。动物暴露在胁迫因子后， 动物的下丘脑垂体肾上腺( 玎) a ) 轴被激活，肾上腺皮质层分泌糖皮质激 素( g c s ) ，糖皮质激素受垂体分泌的促肾上腺皮质激素调节1 2 0 川。在胁迫处 理下雄性动物可能抑制皋酮的分泌【2 ”，s e l y e 认为长期胁迫下动物的下丘脑 垂体肾上腺轴活性增加，相应的是下丘脑垂体性腺( h p g ) 轴的活性下降 田】。急性和慢性胁迫会对生物产生有害的影响。急性胁迫处理后动物的体重 下降，探究行为减少【2 4 j 等。长期胁迫下高的糖皮质激素水平可以导致沮丧、 过度紧张、胃肠溃疡、钙丢失、繁殖抑制和生长受到抑制等【1 7 l 。 有关啮齿动物社会结构和社会行为之间以及与之相关的生理和内分泌 水平变化的研究很多，研究对象多为啮齿动物【1 习和灵长类动物【1 9 】，以社会地 位为主线，综合探讨其行为、生理以及内分泌的相互关系的研究十分缺乏， 而且由于方法和手段以及物种间差异存在，使得结果差异较大，相互难以印 证。 2 本项研究旨在探讨在捕食风险( 黄鼬气味) 对黑线姬鼠雄一雄竞争的影响。 对雄性黑线姬鼠社会冲突进行研究不仅有助于了解种群调节机制，而且更有 助于探讨社会冲突与个体的生理和内分泌的相互作用模式及这种作用对个 体深层次的影响。我们分别对雄性黑线姬鼠的攻击行为、生理和内分泌进行 了较为系统的研究，主要内容为： 1 ) 利用高效液相色谱( 1 珏，l c ) 对黑线姬鼠粪便提取物进行荧光检测分 析的可行性及应用； 2 ) 黄鼬气味对雄性黑线姬鼠社会冲突影响，通过对黑线姬鼠社会冲突 间行为、生理和内分泌表现的分析，力图阐明社会冲突在黑线姬鼠获胜者一 失败者关系形成和维持中豹作用及其生理和内分泌特点，进而了解黑线姬鼠 社会关系形成机制和种群调节机制。 2 动物处在胁迫状态下应激反应 胁迫( g t r e s s ) 一般是指对个体具有不良影响的一种环境状态并可通过肾 上腺度质的活性得到表达阱1 。动物在自然界中受到的胁迫是多方面的但由胁 迫导致的生理反应是相似的。d a l l m a n 【l7 j 认为，胁追可激话动物胁迫反应中 心网络( 促肾上腺皮质激素释放因子一c r f ，含儿茶酚胺的神经元她) 反应， 从而引起动物在行为、节律、神经内分泌和免疫的改变。( 1 ) 急性和适度的 胁迫：促肾上腺皮质激素释放因子和含儿茶酚胺的神经元短暂激活，适当调 节反应系统快速消除胁迫。( 2 ) 较强的或较长的胁迫：促肾上腺皮质激素释 放因子和含儿茶酚胺的神经元持续激活来维持皮质酮( c o r t ) 水平，胁迫 被反应系统慢慢的消除掉。( 3 ) 过度胁迫：促肾上腺皮质激素释放因子和含 儿茶酚胺的神经元激活，但反应系统不能完全应付，中心网络处在紧张的状 态。 海马、下丘脑垂体一肾上腺( h p a ) 轴和糖皮质激素( g c ) 是哺乳动物 应对胁迫的主要调节过程。海马调节下丘脑垂体肾上腺轴所有的功能。胁 迫因子刺激下丘脑室旁核( p v n ) 释放促肾上腺皮质激素释放激素( c r h ) 和精氨酸加压素( a 、，p ) ，这两种激素刺激垂体前叶释放促肾上腺皮质激素 ( a c r i h ) 。促肾上腺皮质激素促使肾上腺皮质合成和释放皮质激素( 某些啮 齿类的皮质酮，其它的皮质醇) 。皮质激素维持身体的内稳态，由于过量的 皮质激素对身体有害，下丘脑垂体- 肾上腺轴通过作用于皮质激素受体准确 的反馈调节( 间接抑制) 来抑制下丘脑垂体肾上腺轴的活性。皮质醇反馈 于下丘脑和垂体导致促肾上腺皮质激素释放因子的释放的快速抑制。在急性 胁迫因子的条件下，反馈调节机制迅速启动，系统快速回到正常状态，对身 体的作用只是短期影响。在慢性胁迫因子条件下，反馈调节信号微弱，系统 长期处于激活状态，导致对身体长期的有害的影响。短期对身体的伤害是消 极的，长期则是抑制过程。糖皮质激素受体和盐皮质激素受体( m r ) 发生 在海马和齿纹核的边缘系统，糖皮质激素受体还发生在下丘脑室旁核和垂体 前叶。在脑部，盐皮质激素受体对皮质激素的亲和力比糖皮质激素高，皮质 醇浓度处于基线水平时，全为盐皮质激素受体所占，糖皮质激素受体大部分 以自由基存在。在胁迫期和血液中高皮质激素时，糖皮质激素受体大量结合 皮质激素。海马区盐皮质激素受体主要是基线水平的反馈调节，当皮质激素 分泌增加时糖皮质激素受体发挥重要作用【1 8 ，1 9 j 如下图。 个体间的社会冲突是很多物种经历的最为普遍的胁迫形式。这些冲突主 要用来占有潜在的配偶，领域竞争或占据有限的食物资源，对生理的影响是 激活个体的珈) a 轴，导致各种生理反应，包括肾上腺糖皮质激素的分泌增 加及免疫功能的抑制等。 获胜者失败者关系是以从事社会冲突的双方反复争斗为为前提达成的 一致格局，特征是结果有利于一方，同时减缓对手的敌对状态或者迫使其弃 权。获胜者处于优势地位，失败者则处于从属地位。优势作为与交配成功有 关的个体属性，经过同性竞争和雌性选择。大多数哺乳动物中，优势雄性个 体赢得配偶的机会较高，导致种群中雄性个体间悬殊的繁殖成功【2 6 ，2 。”。连续 相遇期间紧张行为的显著变化与优势从属关系的形成相关 2 ”。 社会冲突对各种激素水平的调节很重要，激素可改变体重，而体重可增 加个体在社会冲突中获胜的可能性。激素可以通过许多方式影响动物的紧张 行为，直接作用于特定行为的神经通路( n e 眦lc i r c u i t s ) 以改变这些通路的 功能，进而影响行为的表达【2 9 】，如在社会冲突中失败者的血清睾酮水平低于 获胜者【3 0 】，雌二醇、孕酮和皮质激素，研究表明，性激素可显著影响攻击行 为的一些指标( 例如潜伏期) 。有研究则发现去势后加入外源性激素未能影 响动物的任何行为参数口9 1 。简言之，社会行为与内分泌系统相互作用是复杂 的双向模式。 下丘脑垂体肾上腺( 狐) 轴在调节紧张行为具有重要的影响，其作 用机制尚未完全清楚【3 0 】，一种观点认为，社会失败或处于从属地位与动物的 垂体肾上腺皮质激素相关【2 9 】，a c t h 促进从属个体的顺从或防御行为，进 而降低激烈攻击行为的数量；而另一种观点则认为，促肾上腺激素( a c t h ) 不是从属个体产生顺从及防御行为所必需的，并不改变雌体及雄体的紧张行 为。造成这种差异的原因可能是由于其它激素水平的改变使碍检验肾上腺皮 质激素或促肾上腺皮质激素很困难，并且这种改变也可能会使大脑内促肾上 腺释放激素( c r h ) 产生变化。如实验可改变个体的性激素水平，因而影响 垂体肾上腺皮质激素的分泌。 性激素的季节性变化对某些物种紧张行为具有重要的影响，但这些激素 在调节此类行为中并未起到普遍作用，且研究证据很少。雌体动情周期雌二 醇波动对攻击行为的影响较小，连续注射雌二醇和孕酮可抑制雌体的攻击行 为【3 ”。仓鼠攻击行为与睾酮的季节变化相反，睾酮水平最低是攻击水平最 高【3 1 】。也有研究表明攻击行为似乎和睾酮的季节变化无关p 2 1 。 激素对紧张行为的影响受到社会经历的控制。社会关系不稳定时，雄 雄相互作用增加，攻击行为和睾酮增加p “。睾酮水平增加无法激活攻击行为， 但可使已有的攻击行为保持很高的水平【l ”。但某些类型社会经历的缺失可导 致性激素对雄性大白鼠攻击行为激活实效【l 孙。雄性大白鼠与雌体同居或者竞 争有限的资源时，睾酮可促进其攻击水平增加【3 2 】。 特 臻c r 者皮质激素受俄m r 磕皮质激素受体 p v n 一下丘脑室旁核c r h - 促肾上腺皮囊傲素释放散紊 v p 一精氟醢加j 玉素 c t h 一促肾上腺皮质激素 图哺乳动物应对胁迫的主要调节过程 f i gt h es 仃e s si m p a c t so nt i l e 曾u c o c o n i c o i d ( g c ) f e e d b a c ki n 吐l em a r n m a l i a nb r a i n 6 脚删 、 制 删函疑 r 卸 穆 长 转 生 量 3 非损伤方法的应用 胁迫会对动物的行为和生理会产生很大的影响i ”j 。研究人员一直在探寻 糖皮质激素( g c s ) 和性腺激素是如何帮助动物来应对胁迫因子如捕食者、 社群冲突、极端环境以及人类干扰对它们的影响【l e ”j 。动物暴露在胁迫因子 后，动物的下丘脑垂体一肾上腺( i 丑) a ) 轴被激活，肾上腺皮质层分泌糖皮 质激素( g c s ) ，糖皮质激素受垂体分泌的促肾上腺皮质激素调节1 1 9 舶】。在 胁迫处理下雄性动物可能抑制睾酮的分泌【2 “，s e l y e 认为长期胁迫下动物的 下丘脑垂体肾上腺轴活性增加，相应的是下丘脑垂体性腺( h p g ) 轴的活 性下降。急性和慢性胁迫会对生物产生有害的影响。急性胁迫处理后动物的 体重下降，探究行为减少等。长期胁迫下高的糖皮质激素水平可以导致沮丧、 过度紧张、胃肠溃疡、钙丢失、繁殖抑制和生长受到抑制等【1 ”。 测量糖皮质激素的浓度有几种方法。血液中类固醇的量反映个体内分泌 的状态，因此，利用血液中糖皮质激素和性腺激素的浓度可以分析不同物种 的胁追反应【3 4 1 。但是。采集血液样本的困难以及血液采集过程中对动物负 面影响使这种方法的应用受到很大限制，特别是测量对动物长期胁迫的反 应。因为血液类固醇的量仅反映动物个体在一点时间上的状态，因此，由于 环境的急剧改变或对动物的急性胁迫引起快速的或短时间的糖皮质激素和 性腺激素浓度的改变，最好利用血液样本来测量【3 5 j 。 利用测量动物唾液、尿液和粪便中类固醇的含量可以克服测量血液带来 的不足陬”j 。但是，虽然唾液或尿液样本的采集比血液样本的采集对动物的 干扰减少，由于获得的样本量有限以及在取样过程中需要对动物进行处理， 所以实际应用受到限制。因此，分析粪便中类固醇的代谢物是一种最佳的非 损伤检测方测3 6 ，3 7 ，3 8 1 。 利用分析粪便中类固醇代谢物有很多优点口”。粪便样本可以在不打扰 动物的情况下收集。因此，在不影响动物内分泌状态下可以重复对同一个体 取样。这就可以检测动物对特殊环境或特定处理下短期激素的改变，同样可 以检测内分泌长期的变化。另外，粪便中激素水平是一段时间内总的激素量， 并不是像血液样本仅代表动物一点时间上的状态，受激素分泌的波动影响很 小。因此，粪便样本可以很精确的代表动物激素的状态。 测定粪便中激素代谢物主要利用放射性免疫测定( r i a ) 和酶免疫测定 ( e n ) 技术口8 j 9 】。但是这些方法有一定的局限性，一些研究表明利用皮质 醇或皮质酮的特殊抗体产生的结果可能和实际含量不一致【3 8 3 。最重要的 是，这些方法不能在一个样本中同时检测到所有的类固醇代谢物( 例如，皮 质醇、皮质酮和睾酮或雌二醇) 。在近几年，利用化学衍生技术来检测自然 界中痕量物质逐渐发展起来 3 9 l 。利用高效液相色谱( h p l c ) 可以用一个提 取物来测量粪便中所有的激素【3 9 l 。 实验一：利用高效液相色谱( h p l c ) 进行荧光检测分 析黑线姬鼠粪便提取物的可行性 1 引言 鉴于非损伤方法在生物领域的广泛应用以及存在缺陷，本实验将利用 a g i l e n t l l 0 0 型高效液相色谱质谱联用仪，荧光检测分析黑线姬鼠粪便提取 物中皮质激素和性腺激素，并进行可行性分析。 2 材料与方法 2 ，1 实验动物 于2 0 0 4 年5 月在济南野生动物世界捕捉黑线姬鼠，在实验室繁殖饲养， 饲养2 个月后用于实验。标准饲养笼( 4 6 m 3 l c m x 2 0 c m ，1 p x _ c p - 4 聚丙烯不 锈钢网罩透明饲养笼) 单只鼠饲养供给充足的兔颗粒饲料并辅加花生、玉米、 小麦、胡萝h 等，自由取食和饮水逆转的光照周期( 1 6 l ：8 d ，光照时间1 7 ：0 0 至次日9 ：0 0 ) ，室温为2 0 士2 。 2 2 粪样的收集和提取 参照t o u m a 等卅的实验方法收集黑线姬鼠粪便。主要为：单只鼠放入 不锈钢铁丝笼中，然后放到标准饲养笼中，所有的粪便从铁丝笼网格掉下， 标准饲养笼下铺吸水纸，以吸取水分。粪便收集后重新换吸水纸，以避免上 一次粪便的干扰。实验处理前3 天把黑线姬鼠放入不锈钢铁丝笼中以消除新 环境的影响。实验过程中，收集实验前一天的粪便作为激素的基线水平和实 验后的每7 天粪便，粪便收集间隔2 4 h ，放入小试管中， 3 0 保存待测。 粪便的提取方法参照t o u i n a 等队3 7 和t i l r n e r 等 3 9 。每一个粪样用碾钵 和碾皿充分磨碎，准确称取1 0 0 m g 粉末，加入离心管中，加l m l 双蒸馏水， 2 m l 二氯甲烷，振荡，超声5 m i n ，蜗旋振荡1 h ，4 0 0 0 r p m 离心3 0 m i n ，抽 取二氯甲烷层置入试管中，氮气吹干，一3 ) 保存待测。另称取1 0 0 m g 烘干 测量含水量。 2 3 仪器与试剂 a 百l e n t l l 0 0 型高效液相色谱质谱联用仪( a g i l e n t 公司) ，配备四元梯度 a g i l e n t l l 。0 型高效液相色谱质谱联用仪( a g i l t 公司) ，配备四元梯度 泵，1 0 0 位自动进样器，荧光检测器，在线真空脱气机，大气压化学电离源 ( a p c d ；h y p e r s i lb d sc 1 8 色谱柱( 4 6 2 0 0 l i l i l l ，5 “m ，大连依利特公司) 。1 ，2 - 苯并3 ，4 二氢咔唑9 乙基肼基甲酸酯( 自制，见文献【4 叫) 。类固醇标准样品 ( 购自s i g m a 公司) ，无水乙腈( 购自禹城化学试剂厂) 用p 2 0 5 干燥后蒸馏处理， 三氯乙酸、三氟乙酸等均为分析纯，纯水由m i l l i o 超纯水系统制备。类固 醇包括：孕酮、睾酮、皮质醇和皮质酮的结构见图1 c 咖ip r o g i 图1 四种类固醇化合物的结构式 2 4 标准溶液的配制 准确称取定量类固醇标准品，用乙腈配成1 0 1 0 五m o n 。的溶液，相应 低浓度的标准溶液( 1 o 1 0 4 m o 儿) 用乙腈稀释而成。称取1 6 0 5 m g 的1 ，2 苯并一3 ，4 一二氢咔唑一9 - 乙基肼基甲酸酯( b c e c ) 无水乙腈定容至1 0 m l ，浓度为 5 0 1 0 3i n o l l 。 2 5 标准品的衍生过程 向安培瓶中依次加入1 2 0ul 衍生试剂溶液，3 0ul 混合类固醇标准液， 3 0ul1 c 1 3 c c 0 0 h 的乙腈溶液，封口后于6 5 恒温水浴下振荡反应2 h 。 取出放冷冲稀l o 倍后进样分析。衍生反应概况见图2 。 1 0 瞄n h n h 2 o - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 c 1 3 c c o o h 一一- _ j m 詹= 2 6 4 1 图21 ，2 苯并3 ，4 二氢咔唑9 ，乙基肼基甲酸酯与类固醇衍生反应概况 f i g 2 ，d e r i v a t i z a t i o ns c h e m eo f1 ，2 - b e n z o 一3 ，4 一d i h y d r o c a r b a z o l e 一9 一e t h y l 一c a r b o n y l h y d r a z i n e w i t l ls t e m i dc o m p o u n d s ( m i s 也em 0 1 e c u l a rw e i g h to f s t e r 0 dc o m p o u n d s ) 2 6 色谱条件 色谱柱：h ”e r s i lb d sc 1 3 色谱柱( 4 6 2 0 0 m m ，5um ) 。流动相a ：3 0 乙腈水溶液( 含有3 0 pm m 的h c 0 0 n h 4 ，p h _ - 3 5 ) ，b ：1 0 0 的乙腈。梯度洗 脱程序：由3 0 b 经3 5 m i i l 线性梯度到1 0 0 b 。每次进样前用流动相b 平 衡柱子l o m i l l 。流速为1 o m i 。，瑚i n ，柱温3 0 。荧光激发和发射波长分别为： “= 3 3 3 n m ，九m = 3 9 0 n m 。 2 7 质谱条件 大气压化学电离源( a p c d ，正离子模式，喷雾压力 6 0 p s - i ( 1 p i s i = 6 8 9 4 7 6 p a ) ，干燥气流量为5 l m i n ，干燥气温度3 5 0 ，气化温 度4 5 0 ，毛细管电压3 5 0 0 v ，电晕电流4 0 0 0 n a ( p o s ) 。 3 结果与讨论 3 1 衍生条件的优化 实验中对b c e c 与类固醇化合物的衍生化条件进行了优化选择，结果表 明不同的溶剂、催化剂、衍生温度及衍生试剂量都将导致衍生化产率的显著 差异。 溶剂的选择：以二甲基亚砜( d m s o ) 、n n - 二甲基甲酰胺( d m f ) 、四氢 呋喃( t h f ) 、1 ，4 二氧六环、甲醇、乙腈等作为衍生化溶剂，对衍生产率进行 了考察。结果表明在相同的衍生条件下，乙腈具有最大的衍生化产率。催化 剂的选择：以硫酸、甲酸、冰醋酸、三氯乙酸和三氟乙酸作催化剂，对衍生 产率进行了考察。结果表明三氯乙酸具有最高的衍生化产率，见图2 。对衍 生化反应温度的考察表明，产率随温度升高而增加，反应速率随温度升高而 加快。6 5 衍生反应2 h 后，衍生产物恒定。进一步提高衍生化温度，将会 引