（动物学专业论文）aiia蛋白在苏云金杆菌中的表达及其对植物病原菌的影响.pdf

薛清华a i i a 蛋自在苏云金杆菌中的表达及其对植物病原苗的影响 a i i a a h b a m p b c b i s b p b s b t d d h 2 0 ec o l i e d 1 1 a e r l - n g e n h i p t g k a n k b k d p - m e m l n n c o d o r f o n p b s p c r r p m t e t s d s d s s d s p a g e s e c 缩略词 a u t o i n d u c e ri n a c t i v a t i o ng e n e n a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e s a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b a d l 胁sc e r e u s 蜡状芽孢杆菌 n ，n m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d en ，n - 亚甲双丙烯酰胺 b a s ep a i r 碱基对 b a c i l l u ss u b t i l i s 枯草芽孢杆菌 b a c i l l u st h u r i n g i e h 5 打苏云金芽孢杆菌 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e r y t h r o m y c i n 红霉素 g e n t a m i c i n 庆大霉素 h o u r 小时 i s o p r o p h y lt h i o b d - g a l a c t o s i d e 异丙基硫代b d 半乳糖苷 k a n a m y c i n 卡那霉素 k i l o b a s e 千碱基对 k i l o d a l t o n 千道尔顿 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o lb 一巯基乙醇 m i n u t e 分钟 n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e 硝酸纤维素膜 o p i t i c a ld e n s i t y 光密度值 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放阅读框 o r i g i no fr e p l i c a t i o n 复制原点 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链式反应 r e v o l u t i o np e rm i n u t e 每分钟转数 t e t r a c y c l i n e 四环素 s h i n e d a l g a m os d 序列 s o d i u md o d e c y ls u l p a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 s e c o n d 秒 3 薛清华 a i 认蛋白在苏云金杆菌中的表达及其对植物病原菌的影响 加认蛋白在苏云金杆菌中的表达及其对植物病原菌的影响 摘要 a i i a 蛋白是一种能降解n 一乙酰高丝氨酸内酯( n a c y l h o m o s e r i n e l a c t o n e s ， a h l s ) 的蛋白，后者是一类数量感知( q u o r u ms e n s i n g ) 系统中的信号分子，它 参与诱导调控多种植物病原菌致病基因的表达。因而a i 认蛋白可减弱因病原菌 致病基因表达而产生的植物病害。越i a 类蛋白广泛存在于在苏云金芽孢杆菌 ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 各亚种中，但其表达量低，对a h l s 信号分子的降 解活力不高。本文报道a i i a 基因在大肠杆菌及b t 中表达的研究结果。 将f “基因克隆到表达载体p o e 3 0 ，并转化大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) m 1 5 进行诱导表达。结果表明诱导表达m 认蛋白的m 1 5 菌株对植物病原菌胡萝 h 软腐欧文氏菌( e r w i n i ac a r a t o v o r a ) s c g l 在马铃薯上引发的病害有抑制作用。 对出发菌株b t 一1 0 的加认蛋白表达情况进行分析后，发现菌株b t 一1 0 中础认 蛋白是在早期表达。氨基酸序列分析表明菌株b t 1 0 中a i i a 蛋白仅第1 5 4 位和 第2 3 3 位氨基酸与最接近的其它b t 菌株中的不同。w e s t e r nb l o t 分析得到的蛋白 大小为4 5 k d 左右，与序列分析的预期结果2 8 k d 不符，估计可能是糖基化或结 合了某种小分子物质所致。b t 1 0 与过夜培养的植物病原菌胡萝p 软腐欧文氏菌 e c a r a t o v o r as c g l 混合作用1 h ，能明显抑制软腐现象的发生。 为了提高a i 认蛋白在b f 中的表达量，我们尝试了将a i m 基因的o r f 置于 c y t l a b 基因的启动予和c r y 3 a a 基因的s t a b s d 序列下游，在b t 无晶体突变株 4 q 7 中表达。w e s t e r nb l o t 分析显示重组菌株中有分子量为2 8 k d 的创认蛋白 的表达，且其表达时问延长，表达量增加。与过夜培养的植物病原菌胡萝h 软腐 欧文氏菌e c a r a t o v o r as c g l 混合作用1 h ，发现重组菌株对植物病原菌胡萝h 软 腐欧文氏菌e c a r a t o v o r as c g l 在马铃薯上引起的病害的抑制作用明显高于没有 转化重组质粒的4 0 7 ，同时其抑病作用也略高于出发菌株b t 1 0 。 关键同：苏云金芽孢杆菌，加认蛋白，n 一乙酰高丝氨酸内酯( a h b ) 中山人学硕士学位论文 e x p r e s s i o no f a i i ap r o t e i ni nb a c i l l u st h u r i n g i e n s i sa n d i t se f f e c to nb a c t e r i a lp l a n tp a t h o g e n x u eq i n g h u a a b s t r a c t a r a n g eo fg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ls p e c i e su s en a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e ( a h l ) m o l e c u l e sa s q u o r u m s e n s i n gs i g n a l st or e g u l a t e d i f f e r e n tb i o l o g i c a lf u n c t i o n s ， i n c l u d i n gp r o d u c t i o no fv i r u l e n c ef a c t o r s a r i a - l i k ep r o t e i n ，w h i c hw i d e l ye x i s t si n b a c i l l u ss p e c i e s ，c a ni n a c t i v a t et h ea h l sb yh y d r o l y z i n gt h el a c t o n eb o n do fa h l s ， t h u sa t t e n u a t e st h ed i s e a s e sc a u s e db yt h ee x p r e s s i o no fv i r u l e n c eg e n e so fb a c t e r i a l p a t h o g e n s h o w e v e r , a i i ap r o t e i nh a sal o we x p r e s s i o na m o u n ti nb tt h a tm a k e si t u n a b l et od e g r a d et h ea h l se f f e c t i v e l y t h i sp r e s e n t a t i o nr e p o r t sr e s u l t so fa i i ag e n e e x p r e s s i o ni ne s c h e r i c h i ac o l ia n db a c i l l u st h u r i n g i e n s i s a i i ag e n ef r o mb t 1 0w a sc l o n e di n t ot h ev e c t o rp q e 3 0 ，a n de x p r e s s e di n e s c h e r i c h i ac o l im 1 5 t h ee x p r e s s e dp r o t e i ne x h i b i t e dt h ea b i l i t yo fi n h i b i t i n gt h e p o t a t o ss o f tr o td i s e a s ec a u s e db ye r w i n i ac a r a t o v o r a s e q u e n c ea l i g n m e n to fa i i ap r o t e i nf r o ms t r a i nb t 一1 0w i t ht h er e p o r t e do n e s s h o w e do n l yt w oa m i n oa c i dd i f f e r e n c et ot h em o s ts i m i l a ro n e w e s t e r nb l o ta n a l y s i s i n d i c a t e dt h a ta j 认p r o t e i nw i t ham o l e c u l a rw e i g h to f4 5 k d i n s t e a do ft h ee x p e c t e d m o l e c u l a rw e i g h to f2 8 k d ，w a se x p r e s s e di nt h ee a r l yp h a s ei nb t - 1 0s t r a i n t oe n h a n c et h ee x p r e s s i o nl e v e lo fa i i ap r o t e i ni nb t ，a i i ag e n ef r o ms t r a i n b t 一1 0w a sp l a c e di nt h ed o w n s t r e a mp o s i t i o no ft h ep r o m o t e ro fc y t l a bg e n ea n d s t a b s ds e q u e n c eo fc r y 3 a bg e n e ，a n de x p r e s s e di nb ta c r y s t a l l i f e r o u ss t r a i n4 q 7 r e s u l t ss h o w e dt h a ta l i ap r o t e i nw a se x p r e s s e dw i t hah i g h e ra n dm o r es t a b l el e v e li n t h er e c o m b i n a n ts t r a i n4 q 7 ( p p p s l o a i i ) t h a ni nb t 一1 0 c o m p a r e dt os t r a i n4 q 7 ，t h e r e c o m b i n a n ts t r a i n4 q 7 ( p p p s l o a i i ) s h o w e das t r o n g e ri n a c t i v a t i o nt oa h l sa n da m u c hm o r ee f f e c t i v er e s t r a i n tt ot h ep o t a t o ss o f tr o td i s e a s ec a u s e db ye , c a r a t o v o r a s c g l t h er e c o m b i n a n ts t r a i na l s os h o w e ds l i g l l t l yb e t t e rr e s u l t st h a nb t 一1 0i n r e s t r a i n tt ot h ep o t a t o ss o f tr o td i s e a s ec a u s e db ye c a r a t o v o r as c g l k e y w o r d s ： b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s a j i a p r o t e i nn a c y l h o m o s e r i n c l a c t o n e s ( a h l s ) 2 中山大学硕_ l 学位论文 2 1 材料 2 材料与方法 2 1 1 质粒、菌株、供试昆虫 1 1 质粒 p m d l 8 一t 载体( 图2 - 1 ) 购自大连宝生物有限公司 胁d i l l s p h i 黝l l l i n e l i a l s 破l e c o r v 一 渤i b u m h i s t r h t l 舳f l a i j 细h i s a c l e c o r i 图2 - - 1 ：质粒p m d l 8 - - t 的物理图谱 f i 9 2 1 ：p h y s i c a lm a po f p m d l 8 - - t v e c t o r p q e 3 0 载体( 图2 2 ) 购自q i a g e n 公司 图2 - - 2 ：质粒p q e 3 0 的物理图谱 f i 9 2 - - 2 ：p h y s i c a lm a po f p q e 3 0v e c t o r 6 薛清华 a i i a 蛋白神苏云金杆菌中的表达及其对植物病原菌的影响 抗性 p r e p - - 4 质粒( 图2 3 ) 购自q i a g e n 公司，p r e p 一4 质粒，并具有卡那霉素 c l a lc 3 7 3 6 ) x b a l1 3 6 4 1 ) h m i l l 聊l ( 3 2 1 ) b a a l 5 6 7 n c a l1 9 17 ) 图2 3 ：质粒p r e p 一4 的物理图谱 f i 9 2 3 ：p h y s i c a lm a p o fp r e p 一4 b t 一e c o l i 穿梭载体p h t 3 1 0 1 ( 图2 4 ) 购自i n v i t r o g e n 公司 ( s s p l b e t l ) i i 蓦热蓦量晏i o r ib l h ( 2 9 k b p ) 瓦一1 ，一i 孔。 ( 1 k b p ) ( p u c l 0 ：2 7 k b p ) p h t 3 1 0 1 ( 6 6 k b p ) 图2 - - 4 ：质粒p h t 3 1 0 1 的物理图谱 f i 9 2 - - 4 ：p h y s i c a lm a p o ft h ev e c ( o rp l a s m i dp h t 3 1 0 i 质粒p h t p 3 a a p ，为本室保存，含有c r y 3 a 基因的启动子和s d 序列，用于 7 中山大学硕i - 学位论史 克隆c r y 3 a 的s t a b s d 序列。 质粒p u c l 8 购自华美公司 2 ) 菌株 b t 标准菌株h d 一1 、 1 3 6 由本室保存 用作电激感受态的晶体缺陷型菌株b t i 4 q 7 由本室保存 用作感受态细胞的大肠杆菌t g l 由本室保存，基因型为：s u p eh s d a 5 咖f ( 1 a c - p r o a b ) f t r a d 3 6 p r o a b + 缸一l a c z a m l 5 表达宿主大肠杆菌m 1 5 购自q i a g e n 公司 胡萝h 软腐欧文氏菌胡萝h 软腐亚种( e r w i n i 口c a r o t o v o r as u b s p c 口r o t o v o r a ) s c g l ，植物病原菌，用于检测加认蛋白对病原菌的抑制作用 e c o l id h 5 。( p j z 3 6 5 ) ( 含t r a i 基因，庆大霉素抗性，可以大量合成a h l s 分 子) 根癌农杆菌a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sw c f 4 7 ( p c f 3 7 2 p c f 2 1 8 ，含有 p t r a l - l a c z 融合基因和t r a r 基因，卡那霉素抗性、壮观霉素抗性、四环素抗性， 其中质粒p c f 3 7 2 含有t r a i l a c z 融合基因，但自身缺失t r a i 基因；质粒p c f 2 1 8 含 有t r a r 基因，其编码蛋白t r a r 受趾分子诱导后可激活p t r a l - l a c z 融合基因的 表达) ( z h u ，e tn f ，1 9 9 8 ) 3 ) 供试昆虫 甜菜夜蛾( s p o d o p t e r ae x i g u a ) 、斜纹夜蛾( sl i t u r a ) 和棉铃虫( h e l i c o v e r p a a r m i g e r a ) 由本实验室提供，为人工饲养的健康幼虫。人工饲料配方参考陈其津 等( 2 0 0 0 ) ，饲养温度为2 7 2 8 。 2 1 2 培养基 1 ) l b 液体培养基：0 5 y e a s te x t r a c t ，1 t r y p t o n e ，i n a c i ，p h 7 0 2 ) l b 固体培养基：于l b 液体培养基中加入1 8 a g a r p o w d e r ，p h 7 0 3 ) 过夜培养基( l b + 培养基) ：3 t r y p t o n ，o 1 y e a s te x t r a c t ，o 1 n a c l ，p h 7 5 4 ) y e b 培养基：o 5 酵母膏，1 酪素水解物，0 5 n a c i ，o 5 蔗糖 0 5 o m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 5 ) m m 培养基：3 0 9 lk 2 h p 0 4 ，1 0 9 ln a h 2 p 0 4 ，1 0 9 l n h 4 c l ， 0 3 9 l m g s 0 4 。7 h 2 0 ，o 1 5 9 l k c l ，0 0 1 9 l c a c l 2 - 2 h 2 0 ，0 0 0 2 5 9 l f e s 0 4 7 1 4 2 0 薛清华a i 认蛋白在荪云余杆菌【 | 的表达及其对植物病原茼的影响 2 1 3 限制性核酸内切酶及其他工具酶 限制性核酸内切酶均购自t a k a r a 公司；、t 4d n a 连接酶购自p r o m e g a 及 t a k a r a 公司；t a qd n a 聚合酶购自上海申能博采生物科技公司；溶菌酶购自 b o e h i n g e rm a n n h e i m 公司。 2 1 4 试剂盒 1 ) 质粒纯化试剂盒购自o m e g a 公司 2 ) d n a 胶回收试剂盒购自o m e g a 公司 2 1 5 碱法提取质粒d n a 所用溶液 1 ) 溶液i ：5 0 r a mg l u c o s e ，2 5 m m t r i s c l ( p h 8 0 ) ，1 0 r a me d t a ( p h 8 0 ) 2 ) 溶液i i ：0 2 nn a o h ，i s d s 3 ) 溶液h i ：5 mn a a c6 0 m l ，冰乙酸1 1 5 m l ，d d h 2 02 8 5 m l 混匀 4 ) t e 缓冲液：1 0 m mt f i s c 1 ( p h 8 o ) ，l m me d t a ( p h 8 0 ) 2 1 6d n a 琼脂糖凝胶电泳缓冲液 1 ) 5 0 x t a e ( 1 0 0 0 m 1 ) ：2 4 2 9 t r i s ，5 7 1 m l 冰乙酸，1 0 m lo 5 m o l le d t a ( p h 8 o ) ， 电泳时稀释为i x t a e 2 1 7 蛋白电泳所用溶液 1 ) 2 x s d s 一上样缓冲液( 煮沸法) ：l o o m mt r i s c l ( p h 6 8 ) ，2 0 0 m m 二硫苏糖醇， 4 s d s ，0 2 溴酚兰，2 0 甘油 2 ) 分离胶1 5 m o l l t r i s 缓冲液( p h 8 8 ) ：3 6 3 9 t r i s ，4 8 m l1 n h c l ，补水至1 0 0 m l 3 ) 浓缩胶1 0 m o l l t r i s 缓冲液( p h 6 _ 8 ) ：5 9 8 9 t r i s ，4 8 m l1 nh c l ，补水至1 0 0 m l 4 ) 3 0 n 烯酰胺母液：将2 9 9 丙烯酰胺和1 9 n ，n - 亚甲叉双丙烯酰胺溶于6 0 m l 双蒸水，可置于3 7 。c 水浴待溶质完全溶解后，定容至1 0 0 m l ，再以滤纸过滤， 4 。c 保存 5 ) 电泳缓冲液：o _ 3 t r i s ，1 4 4 甘氨酸，i s d s 6 ) 染色液：5 0 甲醇，1 0 冰醋酸，4 0 双蒸水，0 2 考马斯亮蓝r 一2 5 0 7 ) 脱色液i ：5 0 甲醇，1 0 冰醋酸，4 0 双蒸水 8 ) 脱色液i i ：5 甲醇，7 冰醋酸，8 8 刃2 蒸水 9 ) 上层浓缩胶及各种浓度下层分离胶的配方按照分予克隆实验指南的规定 中山大学硕 学位论文 配置 2 1 8w e s t e r n 杂交所用溶液和试剂 1 ) 4 蛋白电泳缓冲液：6 9 t r i s ，2 8 8 9 甘氨酸( 氨基乙酸) ，以d d h 2 0 溶解最后 定容至5 0 0 m l 2 ) 转印缓冲液：将2 5 0 m l4 蛋白电泳缓冲液，和7 5 0 m ld d h 2 0 混匀，得终溶液 1 0 0 0 m l 3 ) 马来酸( m a l e c ia c i d ) 溶液：1 0 0 m m o l l 马来酸( 顺一丁烯二酸) ，1 5 0 m m o l l n a c l ，用固体n a o h 调节p h 值至7 5 4 ) 1 封闭液( b l o c k i n gs o l u t i o n ) ：l g 封闭粉( b l o c k i n gr e a g e n t ) ，用马来( m a l e c i a c i d ) 溶液定容至l o o m l ，2 0 。c 保存备用 5 ) 洗膜液t b s ( t r i sb u f f e rs a l i n e ) 或t b s t ( t r i sb u f f e rs a l i n et w e e n ) ：t b s 的配方：于8 0 0 m ld d h 2 0 中加入6 0 5 9 t r i s ( 终浓度为5 0 m m o l l ) ：t f t l8 7 6 9 n a c i ( 终浓度为1 5 0 m m o l l ) ，再用1 mh c l 调节p h 值至7 5 ，定容至1 0 0 0 m l 。 t b s t 的配方：以t b s ：t w e e n 2 0 = 1 0 0 ：0 1 的体积比于预先配好的t b s 中加 入t w e e n 2 0 即可。以上两种洗膜液在2 8 。c 均可以稳定保存3 个月。 6 ) 显色液( c o l o r - s u b s t r a t es o l u t i o n ) ：分别将n b ts o l u t i o n 和b c i ps o l u f i o n 以 1 ：5 0 加到检测液中，其中b c i p n b t 和检测液购自华美生物工程公司。 7 ) a p - 标记的第二抗体：羊抗兔i g g 购自华美生物工程公司。 8 ) 硝酸纤维素膜( n c ) 为p a l l g e l m a n 公司产品。 2 1 9 其他溶液和试剂 1 1 氨苄青霉素储存液：以无菌双蒸水配成浓度为l o o m g m l 的溶液，分装，一2 0 。c 保存。使用时每l o o m l 培养基加入1 0 0 h 1 ，终浓度为1 0 0 * g m l 红霉素储存液；以无菌双蒸水配成浓度为2 5 m g , m l 的溶液，分装，一2 0 。c 保 存。使用时每1 0 0 m l 培养基加入1 0 0 b d ，终浓度为2 5 b g m l 3 1 卡那霉素储存液：以无菌双蒸水配成浓度为2 5 m g m l 的溶液，分装，2 0 保存。使用时每1 0 0 m l 培养基加入1 0 0 p l ，终浓度为2 瓢g m l 4 ) 庆大霉素储存液：以无菌双蒸水配成浓度为3 0 m g m l 的溶液，分装，一2 0 。c 保存。使用时每l o o m l 培养基加入1 0 0 “1 ，终浓度为3 0 p g m l 5 1 四环素储存液：以无菌双蒸水配成浓度为2 0 m g m l 的溶液，分装，一2 0 保 薛清华 a i i a 蛋白在苏云金杆菌中的表达及其对植物病原苗的影响 存。使用时每1 0 0 m l 培养基加入1 0 毗l ，终浓度为2 叻g m l 6 ) i p t g 储存液：将8 9i p t g 粉末( s i g m a 公司产品) 溶于1 0 m l 双蒸水中，过 滤除菌后分装，一2 0 。c 保存备用 7 ) x - g a l 储存液：x g a l 粉末( s i g m a 公司产品) 以二甲基甲酰胺溶解配成溶液 ( 浓度为2 0 m g m 1 ) ，分装，一2 0 。c 保存备用 2 1 1 0 免疫家兔和免疫佐剂 免疫用新西兰大白兔，购自动物实验中心。完全弗氏佐剂和不完全弗式佐剂 为s i g m a 公司产品。 p b s ：在8 0 0 m ld d h 2 0 中溶解8 9n a c l 、0 2 9k c l 、1 4 4 9n a 2 h p 0 4 和0 2 4 9 k h 2 p 0 4 ，用h c l 调节溶液的p h 值至7 4 ，加d d h 2 0 定容至1 l ，高压灭菌，保 存于室温。 2 2 方法 2 2 1 菌种的保存 1 ) 大肠杆菌的菌种保藏：将单菌落接种于5 - 1 0 m ll b 液体培养基，在3 7 。c 下 培养1 6 一一1 8 小时，取o 8 5 m l 培养物置于盛有o 5 m l 无菌甘油的指管式有盖塑 料小瓶中，摇匀，将其置于一7 0 。c 长期贮存，使用时用无菌接种环刮取冷 冻结构表面便可获得活菌。 2 ) 苏云金杆菌的菌种保藏：在l b 固体斜面培养基上将菌种划线培养3 - 4 天后， 用封口胶封好，置于4 。c 可短期保存三个月至半年。 2 2 2 苏云金芽孢杆菌新菌株的分离 主要通过热水浴和抗生素的双重作用来进行筛选，具体步骤如下： 1 ) 在从未使用过生物农药的地方采集土壤样品： 2 ) 取o 5 9 土壤，加适量无菌水，剧烈充分振荡5 r a i n ： 3 ) 静置1 0 m i n 至完全澄清，取上清于6 5 。c 水浴3 0 r a i n ，可杀死一些真菌，无芽 孢杆菌等； 4 ) 取2 0 0 p l 涂布于固体培养基上( 含氨苄青霉素a m p l 0 0 , u g m 1 ) ，于2 8 。c 培养； 5 ) 待有菌落生长出时，挑少许涂片，用碱性复红染色，油镜下观察，选出类似 苏云金芽孢杆菌的菌落； 6 ) 将选出的菌落划线纯化，待生长4 5 天后，观察是否有芽孢及晶体的脱落。 中山大学碗+ 学位论文 筛选出的菌株可通过p c r 的方法鉴定其所含有的杀虫蛋白的种类。 2 2 3 大肠杆菌质粒d n a 的提取 1 ) 碱裂解法：参照分子克隆实验指南f 科学出版社1 9 9 5 ) 将单菌落接种于3 m ll b 培养基( a m p + ) 中，3 7 。c 振荡培养过夜，然后按 1 ：1 0 0 体积将菌液接种至适量l b 培养基中，3 7 。c 培养约8 小时，取1 5 m l 菌液 于e p p e n d o r f 管中，离心，去上清，用1 0 q “l 溶液i 涡旋混匀，加入2 0 0 t l 溶液 i i ，颠倒混匀后冰浴5 m i n ，然后加入1 5 叽1 溶液i i i ，颠倒混匀立即冰浴l o m i n ， 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清，等体积酚氯仿抽提两次，两倍体积9 5 7 , 醇沉 淀，再用7 0 7 , 醇洗一次，干燥后用t e 溶解，2 0 。c 保存备用。 2 ) 快速酚抽法： 取1 5 m l 菌液于e p p e n d o f f 管中，离心，去上清，再加入适量t n e 溶液( 1 5 - 5 叫1 ) 及等量酚氯仿，涡旋振荡，1 2 ，0 0 0 r p m 离心，取少量上清( 5 1 叻1 ) 作电泳检测。 3 ) 试剂盒法： 质粒纯化步骤主要参照o m e g a 公司提供的k i t 所述方法：离心收集菌 体，加入2 5 0 i ，t ls o l u t i o ni ，混匀；再加入2 5 0 1s o l u t i o ni i ，轻轻混匀，在室温下 放置2 m i n ；再加入3 5 0 1s o l u t i o ni i i ，混合3 6 次，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ；将过 滤管放入收集管中，将离心后的上清液加入过滤管内，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 6 0 s e c ； 弃去管中液体，加入5 0 0 t x ls o l u t i o nh b ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 - 6 0 s e c ；弃去管中液体， 加入7 5 0p z lw a s hb u f f e r ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 6 0 s e c ；弃去管中液体，再离心1 次， 去除过滤管残留液体；去除收集管，换成1 5 m le p p e n d o r f 管；在过滤管中加入 5 0 一l o o p lt e ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i m 弃过滤管，e p p e n d o f f 管中的d n a 备用。 2 2 4 苏云金芽胞杆菌质粒d n a 的提取 少量提取酶碱法： 主要参考s a m b r o o k ( 1 9 8 9 ) 方法进行，并适当修改即在碱裂解法中，加终浓 度为5 m g m l 的溶菌酶于溶液i 中，3 7 。c 作用2 小时，其余步骤同碱裂解法。 2 2 5 d n a 的回收与连接 1 ) 质粒d n a 的酶切回收与连接 经相应的限制性核酸内切酶3 7 。c 酶切1 h 后，取1 2 0 体积的酶切反应液进 行电泳，检测酶切效果，其余放回3 7 。c 继续反应，待电泳结果表明酶切反应完 全时，于6 5 0 c 灭活酶后进行电泳。 薛清毕 a i i a 蛋白在苏云金杆菌中的表达及其对植物病原菌的影响 酶切片段回收的方法：试剂盒回收，在适当浓度的凝胶上电泳分离目的d n a 片段，在长波紫外灯下观察，将目的片断切下，加入3 - 4 倍凝胶体积的b a n d i n g b u f f e r ，在5 5 6 5 。c 的水浴中7 分钟，每隔两分钟轻轻震荡一次，直至胶完全溶 解。 连接反应：按载体d n a 与外源片段d n a 摩尔比为1 ：1 0 的比例混匀，加 入无菌d d h 2 0 至即l ，4 5 。c 作用5 m i n ，然后加入m l 连接缓冲液和i # i t 4 d n a 连接酶，离心，1 6 。c 连接过夜，次日吸取3 靴l 连接产物进行转化。 2 ) p c r 产物的回收与连接 取适量p c r 产物进行凝胶电泳，试剂盒回收目的d n a 片断( 方法如上) ， 最后溶解于1 即l t e 中，取4 靴l ，混匀，离心，于1 6 。c 放置过夜。次日吸取半 量连接产物进行转化，挑取白色菌斑。 2 2 6 感受态细胞的制备 1 ) c a c l 2 法制备大肠杆菌感受态细胞： 挑取受体菌( d h 5 c t 或t g l ) 单菌落于l b 液体培养基中，3 7 。c ，2 0 0 r p m 振 荡培养过夜。次e t 按1 ：1 0 0 体积比接种，3 7 。c ，2 0 0 r p m 振荡培养2 3 小时，至 o d 6 0 0 值为0 6 左右。将培养物冰浴1 0 m i n ，然后于1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃尽 上清，加原体积1 2 的预冷的0 t mc a c l 2 重悬沉淀，于1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃 尽上清，重复3 次，最后以原体积1 2 5 的预冷的o 1 mc a c l 2 重悬沉淀，分装成 若干管，每管1 0 叻l ，冰浴保存4 8 小时之内使用。 2 ) b t 感受态细胞制备： 参照w u 等人( 1 9 9 4 ) 和l e r e c l u s 等人( 1 9 8 9 ) 的方法制备苏云金杆菌感受 态细胞。具体操作过程如下：在过夜培养基中过夜培养的细胞按1 ：1 0 0 的比例转 接于1 0 0 m ll b 培养基中，在3 0 。c 摇床振荡培养至o d 6 0 0 。至0 6 0 8 ，离心；沉 淀用预冷无菌水洗3 次，最后悬浮在l m l1 0 甘油。制备好的感受态细胞可立即 使用，也可冻存在一7 0 中备用。 2 ，2 7 转化 1 ) 大肠杆菌转化方法： 耿两管制备好的感受态细胞，一管加入1 l 待转化的质粒d n a 或3 - 5 a 连 接产物，冰浴3 0 r a i n ，4 2 。c ，9 0 s 后冰浴2 m i n ，加入l m li b 培养基，3 7 。c 培养 中山大学硕+ 学位论文 5 0 m i n ，取2 0 0 “l 涂布于a m p + 的l b 固体培养基平板。另一管作阴性对照，除不 加d n a 外，其它处理相同。3 7 0 c 倒置培养1 2 1 6 小时，观察菌落生长情况。 2 ) b t 电激转化方法： 采用碱裂解法提取质粒d n a ( s a m b r o o k e t a l ，1 9 8 9 ) ，最后溶解于1 0 甘油。 在2 0 0 p 1b t 感受态细胞中加入1 - 5 嵋质粒d n a ，充分混匀，冰浴3 0 r a i n ；移入 预冷的0 2 c m 电激杯( b i o r a d 公司) ，b i o r a d 公司的电激仪，参数设定为：电 阻4 0 0 8 0 0 f 2 ，电容2 5 i t f ，电压1 5 1 7 s k v , 电激时间为7 - 9 m s ；电激后立即移入 冰浴5 m i n ，加入8 0 0 9 ll b 液体培养基，3 7 。c 静置培养2 3 h ，然后涂布于四环素 或红霉素抗性平板上，置于2 8 。c 培养，2 4 h 内观察菌落生长情况。 2 2 8 重组质粒的筛选与鉴定 用无菌牙签挑取转化出的白色菌落接至另一l b ( a m p + ) 平板上后，再接入l m l l b ( a m p + ) 液体培养基中，对应编号( 即每个单菌落由同一根牙签操作，同时得 到两份扩增培养物) 。平板置3 7 。c 温箱培养1 2 h 作为菌种暂时性保种。液体培养 物置3 7 。c 摇床振荡培养1 0 h ，若外源片段的大小远远小于载体，则用快速酚抽 法提取质粒d n a ，电泳检测，以空载为对照，根据迁移率初步筛选重组子；若 两者大小相近，则用碱裂解法提取质粒，酶切后电泳检测，直接可以筛选出阳性 重组子。 2 2 9b td n a 模板的制各 使用的是快速菌裂解法，将b t 单菌落划线于l b 平板上，2 8 。c 培养过夜， 次日用接种环挑取一环菌体于2 0 叻l 无菌d d h 2 0 中，涡旋打散后沸水中煮1 0 m i n ， 1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ，吸取上清作为模板。 2 2 1 0 引物设计及聚合酶链式反应 根据g e n b a n k 中已经发表的a i m 基因序列( 序列号：a f 3 5 0 9 2 7 ) 设计引物 对p 1 和p 2 ，用于从b t 菌株h d l 中扩增a l i a 基因，引物对p 7 和p 2 用于扩增从 b t 一1 0 中扩增a i i a 基因。根据c y t l a b l 基因( 序列号：x 0 4 3 3 8 ) 的启动子区序列 设计引物对p 3 和p 4 ，用于扩增c y t l a b l 的启动子序列：根据c r y 3 a 1 基因( 序列 号：l 0 3 3 9 3 ) 的s t a b s d 序列设计引物对p 5 和p 6 ，用于扩增c r y 3 a 1 基因的 s t a b s d 序列。 1 4 薛清华a l i a 蛋白靠苏云金杆菌中的表达及j e 对植物病原菌的影响 表2 1p c r 扩增所使用的引物 p r i m e r s o o s l t l o n s e q u e n c e s p 11 6 9 1 9 4 +g ( 淑c c a r g a c a g t a a a g a a a c r r i = c 蛔仃t c a p 21 0 4 2 。1 0 6 6 c t g c a g c t c a a c a a g a i a c t c c t aa t g a t g p 31 - 2 4 * + g a a t t c t t t c g a t i t c a a a t t t t c c a a a c p 44 8 6 5 0 8 * 4g ( m c c 鸟鸟鸟= i = 鸟aac a a c t c c t i a a g t t a a p 51 4 0 1 1 4 2 1 7 1 g g t a c c a t a a a t t a t i t a t c 丌g a a a g p 61 5 2 3 。1 5 4 2 n c t g c a g t i t r c t i c c t c c c t i t c t t p 71 6 9 1 9 4 g a a t t c a t g a c a g t a a a g a a a c r r i = c 蜘_ i t c a t a b l e 2 1p c rp r i m e r su s e df o ra n a p l i t i o n s ， + r e f e r st ot h en u c l e o t i d es e q u e n c ef o rt h ea i mg e n ed e p o s i t e di nt h eg e n b a n k d a t au n d e rt h ea c c e s s i o nn u m b e ra f 3 5 0 9 2 7 。4r e a r s t ot h en u c l e o t i d es e q u e n c e f o rt h ec y t l a b lg e n ed e p o s i t e di nt h eg e n b a n kd a t au n d e rt h ea c c e s s i o nn u m b e r x 0 4 3 3 8 1 1r e f e r st ot h en u c l e o t i d es e q u e n c ef o rt h ec r y 3 a a lg e n ed e p o s i t e di n t h eg e n b a n kd a t au n d e rt h ea c c e s s i o nn u m b e rl 0 3 3 9 3 g g a t c c 、c t g c a g 、 g a a t t c 、g a a x t c 、g g t a c c 、c t g c a g 、g g t a c ci n