（法医学专业论文）小鼠皮肤切创愈合过程中mgl表达及分布的研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语6 三、论文 前言l d i d o 0 00 7翮吾 ” “”“。7 材料与方法8 实验结果1 3 讨论一2 4 结论2 6 四、本研究创新性的自我评价2 7 五、参考文献2 8 六、附录 综述3 0 在学期间科研成绩4 0 致谢”一4 1 个人简介4 2 中文论著摘要 小鼠皮肤切创愈合过程中m g i _ 表达及分布的研究 目的 皮肤损伤愈合是一个连续而又复杂的生理过程，其大致可分为三个阶段：急 性渗出期、纤维增生期和组织重建期。在急性渗出期，各种类型的炎症细胞，例 如中性粒细胞和巨噬细胞，浸润到损伤区域参与清除损伤坏死组织、异物及入侵 的病原体等。在纤维增生期，肌纤维母细胞主要参与损伤组织的修复。许多实验 证实，在皮肤损伤愈合过程中有各种各样的细胞因子、生长因子和趋化因子的参 与。研究表明内源性大麻素系统广泛参与炎症反应。内源性大麻素水解酶主要有 两种，即脂肪酸酰胺水解酶( f a a h ) 和单酰基甘油脂肪酶( m g l ) 。m g l 是一 种重要的内源性大麻素水解酶，其主要作用是水解花生四烯酸甘油酯( 2 a g ) 。 有研究证实，m g l 在啮齿类动物的脑组织中高度表达，并且在维持内源性大麻素 水平方面起到重要作用。到目前为止，尚未发现有关m g l 在皮肤损伤愈合过程 中的研究。本实验首次研究小鼠皮肤切创愈合过程中不同损伤时间段m g l 的表 达和分布情况，探讨m g l 在皮肤损伤愈合过程中的作用及其应用于损伤时间推 断的可能性。 实验材料与方法 健康成年雄性b a l b c 小鼠4 5 只，体质量3 5 、, 4 0 9 ，随机分为9 组。其中8 组为皮肤切创组，另1 组为对照组。腹腔注射戊巴比妥钠，背部剪毛处理后，常 规手术消毒，在背部中央做一纵行长1 5 c m 皮肤全层切口，深达筋膜。伤后每只 小鼠单独饲养，防止感染，保持1 2 h 的昼夜交替生活节律。分别于伤后6 h 、1 2 h 、 1 d 、3 d 、5 d 、7 d 、1 0 d 和1 4 d 将小鼠麻醉后脱颈椎处死，取伤口处1 5 c r u x l 0 c m 皮肤组织。各组5 只小鼠的皮肤样本均分为两部分，一部分用于h e 染色和免疫 荧光染色，另一部分用于w e s t e r nb l o t 和r e a l t i m ep c r 检测。对照组5 只小鼠麻 醉后背部剪毛，不做切创，取相同部位同等大小皮肤。应用免疫荧光，w e s t e r nb l o t 及r e a l t i m ep c r 技术检n d , 鼠皮肤切创后不同时间m g l 表达变化情况，以非切 创小鼠皮肤组织作对照，显微镜x 4 0 0 倍下，在损伤区及损伤周边区随机选取1 0 个视野，计数细胞总数、阳性细胞数及阳性细胞率。应用s c i o ni m a g e 软件测各片 段的平均光密度值，测得数据用均数标准差( 孑j ) 表示。用s p s s l 3 0f o r w i n d o w s 进行单因素方差分析，以p 0 0 5 为差异有统计学意义。 结果 正常小鼠皮肤的表皮、毛囊及皮脂腺均表达m g l 。皮肤切创后6 - - 1 2 h ，在 皮肤损伤区及其周边区可见大量中性粒细胞表达m g l ；伤后1 - - 一5 d , m g l 阳性细 胞主要以巨噬细胞为主；伤后7 - - - 1 4 d ，m g l 主要表达在肌纤维母细胞中。m g l 阳性细胞率于5 d 达高峰。中性粒细胞表达m g l 的阳性率于1 2 h 达高峰；巨噬细 胞表达m g l 的阳性率于5 d 达高峰；肌纤维母细胞表达m g l 的阳性率于7 d 达高 峰。经w e s t e r nb l o t 检测显示，对照组及各个损伤时间段小鼠皮肤都有m g l 阳性 条带，其中5 d 为m g l 蛋白表达高峰。r e a l t i m ep c r 结果显示，对照组及各个损 伤时间段小鼠皮肤都有m g l m r n a 表达，其中5 d 为表达高峰。 结论 1 、正常小鼠皮肤的表皮、毛囊及皮脂腺均表达m g l 。 2 、小鼠皮肤切创愈合过程中，中性粒细胞、巨噬细胞和肌纤维母细胞均表 达m g l 。 3 、小鼠皮肤切创愈合过程中，m g l 在不同细胞内的表达以及m g l 蛋白和 基因的表达均具有一定的时间变化规律性，可作为推断皮肤切创损伤时间的依据。 关键词 损伤时间推断；皮肤损伤；单酰基甘油脂肪酶；中性粒细胞；巨噬细胞； 肌纤维母细胞； 2 英文论著摘要 as t u d yo nt h e e x p r e s s i o n a n dd i s t r i b u t i o no f m o n o a c y l g l y c e r o ll i p a s ed u r i n g t h es k i ni n c i s e d w o u n d h e a l i n gi nm i c e o b j e c t i v e s k i nw o u n dh e a l i n gi sac o m p l i c a t e db u tw e l l c o n t r o l l e ds e q u e n t i a lb i o l o g i c a l p r o c e s s ，w h i c hc a n b et e m p o r a l l yd i v i d e di n t ot h r e ep h a s e s ，t h ee a r l ya c u t ee x u d a t i v e ， f i b r o p r o l i f e r a t i v ea n dt i s s u er e m o d e l i n gp h a s e d u r i n gt h ee a r l ya c u t ee x u d a t i v ep h a s e ， v a r i o u st y p e so fi n f l a m m a t o r yc e l l ss u c ha sn e u t r o p h i l sa n dm a c r o p h a g e sa x er e c r u i t e d a tt h ew o u n ds i t e t h e s ec e l l se r a d i c a t en e c r o t i cm a t e r i a l ，f o r e i g nm a t t e ra n di n v a d i n g p a t h o g e n s s u b s e q u e n t l y ，i nt h ep r o l i f e r a t i v ep h a s e ，m y o f i b r o b l a s t sm i g r a t et o t h e w o u n da r e aa n dp r o l i f e r a t et o r e p a i rt i s s u e d e s t r u c t i o n i na l lp h a s e s ，av a r i e t yo f c y t o k i n e s ，g r o w t hf a c t o r sa n dc h e m o k i n e sa r ei n v o l v e di ns k i nw o u n dh e a l i n gp r o c e s s i ti sg e n e r a l l ya c k n o w l e d g e dt h a te n d o g e n o u sc a n n a b i n o i ds y s t e mi si n v o l v e di naw i d e s p e c t r u mo fi n f l a m m a t i o ne v e n t s t h i ss y s t e mm a i n l yi n c l u d e st w oh y d r o l a s e s ：f a t t y a c i da m i d eh y d r o l a s e ( f a a h 9a n dm o n o a c y l g l y c e r o ll i p a s e ( i o l ) m g li sn o w c o n s i d e r e da so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n d o c a n n a b i n o i dh y d r o l a s e s ，w h i c hi st h e p r i m a r ye n z y m em e t a b o l i z i n g2 - a r a c h i d o n o y l g l y c e r o l ( 2 一a g ) i th a sd o c u m e n t e dt h a t m g li se x p r e s s e da th i g hl e v e l si nt h er o d e n tb r a i na n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h e h o m e o s t a s i so fe n d o c a n n a b i n o i d s h i t h e r t o ，t h e r ei sn or e s e a r c hr e p o r t e do nm g l d u r i n g t h es k i ni n c i s e dw o u n dh e a l i n g i nt h e p r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t e d t h e e x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no fm g l a td i f f e r e n tp o s t t r a u m a t i ci n t e r v a l sd u r i n gt h es k i n i n c i s e dw o u n dh e a l i n gi nm i c ea n da i m e da te x p l o r i n gt h ep o s s i b l er o l eo fm g li ns k i n w o u n d h e a l i n ga n di t sa p p l i c a b i l i t yt ot h ew o u n da g e e s t i m a t i o n 3 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s at o t a lo f4 5m a l ea d u l th e a l t h yb a l b cm i c e ，e a c hw e i g h i n g3 5 4 0 9 ，w e r e d i v i d e di n t on i n eg r o u p sr a n d o m l y , o n ec o n t r o lg r o u pa n d e i g h ts k i ni n c i s i o ng r o u p s a 1 5 - c m l o n gf u l l - - t h i c k n e s si n c i s i o nd e e pt ot h ef a s c i aw a sm a d ew i t has c a l p e li nt h e s k i nl a y e ro nt h ec e n t r a ld o r s u mo fe a c hm o u s eu n d e rs t e r i l et e c h n i q u ea f t e rt h em o u s e w a sa n e s t h e t i z e db yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o nw i t hs o d i u mp e n t o b a r b i t a l a f t e ri n c i s i o n w a sm a d e ，e a c hm o u s ew a si n d i v i d u a l l yh o u s e di nac a g ea n df e dw i t hc o m m e r c i a l m o u s ec h o wa n dd i s t i l l e dw a t e rt op r e v e n tb a c t e r i a li n f e c t i o n a l lm i c ew e 他k e p tu n d e r a1 2 hl i g h t - d a r kc y c l ew i t hs p e c i f i cp a t h o g e n f r e ec o n d i t i o n sd u r i n gt h ee x p e r i m e n t s a f t e rt h ea n i m a l sw e r es a c r i f i c e db yc e r v i c a ld i s l o c a t i o na f t e ra n a e s t h e t i z a t i o na t6 h ， 1 2 h ，l d ，3 d ，5 d ，7 d ，1 0 da n d1 4 dp o s t - i n j u r y , 1 5 c m x l 0 c ms p e c i m e n sw e r et a k e nf r o m w o u n d e ds i t e s o n eh a l fo fe a c hs p e c i m e nw a su s e df o rh ea n di m m u n o f l u o r e s c e n t p r o c e d u r e ，a n da n o t h e rw a su s e df o rw e s t e r nb l o ta n dr e a l - t i m ep c r t h er e m a i n i n g5 m i c ew e r ea n e s t h e t i z e dw i t h o u ti n c i s i o na sc o n t r o l s t h el e v e lo fm g li nm o u s es k i n i n c i s e dw o u n dw a sd e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n g ，w e s t e r nb l o ta n dr e a l - t i m e p c r ，a n dt h en o n - i n c i s e dm o u s es k i nw a su s e d 嬲c o n t r 0 1 t h en u m b e ra n dr a t i oo f m g l p o s i t i v ec e l l sw e r ec o u n t e da n da n a l y z e db ym i c r o s c o p e t h eb a n do p t i c a lv a l u e w a sa n a l y z e db ys o f t w a r eo fs c i o ni m a g e d a t aw e r ea n a l y z e db yt h eo n e - w a y a n o v au s i n gs p s sf o rw i n d o w s1 3 0 p 0 0 5w a s c o n s i d e r e d 弱s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t 1 k s u i t s m g l i m m u n o r e a c t i v i t yw a sd e t e c t e di ne p i d e r m i s ，h a i rf o l l i c l ea n ds e b a c e o u s g l a n di nn o r m a lm o u s es k i n ；m g li m m u n o s t a i n i n gw a sd e t e c t e di nn e u t r o p h i l si nt h e w o u n da n dp e r i p h e r a lr e g i o ni n a g e d6 1 2 h ；al a r g en u m b e ro fm g l - p o s i t i v e m a c r o p h a g e sw e r ei d e n t i f i e df r o ml dt o5 d ；a f t e r w a r d s ，t h em g l - p o s i t i v ec e l l sw e r e m o s t l ym y o f i b r o b l a s t s a t7 - 1 4 dp o s t - i n j u r y t h er a t i oo ft h em g l - p o s i t i v ec e l l s m a x i m i z e da t5 d t h er a t i oo f m g l - p o s i t i v en e u t r o p h i l s ，m a c r o p h a g e s o r m y o f i b r o b l a s t sw a sh i g h e s ta t1 2 h ，5 do r7 d ，r e s p e c t i v e l y t h eb a n d so fm g l e x p r e s s i o nw e r eo b s e r v e dt h r o u g h o u tt h ew o u n dh e a l i n gs t a g e sb yw e s t e r nb l o t ，a n d m a x i m i z e da t5 d a sar e s u l to fr e a l t i m ep c r ，m g l m r n ae x p r e s s i o nw a sn o t e d d u r i n ga l lt h ew o u n dh e a l i n gs t a g e s ，w h i c hw a sh i g h e s ta t5 dp o s t i n j u r y 4 c o n c l u s i o n s 1 m g li sd e t e c t e di ne p i d e r m i s ，h a i rf o l l i c l ea n ds e b a c e o u sg l a n do fc o n t r o l m o u s es k i n 2 t h e e x p r e s s i o n o fm g li so b s e r v e di n n e u t r o p h i l s ，m a c r o p h a g e s a n d m y o f i b r o b l a s t sd u r i n gs k i nw o u n dh e a l i n gi nm i c e 3 t h et i m e - d e p e n d e n te x p r e s s i o no fm g li nd i f f e r e n tc e l l sa n dm g l p r o t e i n a n dg e n em a yb eu s e df o r t h ew o u n d a g ed e t e r m i n a t i o no ft h ei n c i s e ds k i n k e y w o r d s w o u n da g ed e t e r m i n a t i o n ；s k i n w o u n d ；m g l ；n e u t r o p h i l ；m a c r o p h a g e ； m y o f i b r o b l a s t 5 英文缩略语 6 生理、病理过程【2 ，3 1 。 起初，在脂肪组织中，m g l 是一种用于催化脂肪转变为游离的三酸甘油脂的 酶。1 9 9 7 年，人们从小鼠脂肪组织中克隆出m g l 。2 0 0 2 年，d i n h 等人克隆出大鼠 和人脑组织中的m g l ，并证明m g l 水解花生四烯酸甘油酯( 2 - a g ) ，同时也证 实了m g l 是调节中枢神经系统中内源性大麻素水平非常重要的酶【4 1 。近些年来研 究证实，m g l 是一种重要的内源性大麻素水解酶，主要作用是水解2 a g ，并可维 持内源性大麻素内环境的稳态。w a l t e r 等研究表明，在中枢神经系统损伤时，损伤 的神经组织中星形胶质细胞表达m g l , 其不但能够水解2 - a g 而且还能够精确的 调节2 a g 的产生，起到保护损伤周围正常神经细胞的作用【5 1 。目前，尚未发现有 关m g 眩皮肤损伤愈合过程中的研究。 本研究在建立小鼠皮肤切创模型的基础上，首次应用免疫荧光染色技术检测 小鼠皮肤切创愈合过程中m g 雌中性粒细胞、巨噬细胞和肌纤维母细胞中的表达 情况及其表达的变化规律。并应用w e s t e r nb l o t 和r e a l t i m ep c r 技术检测正常及切 7 创后小鼠皮肤中m g l 蛋白和基因的表达情况以及表达的时间变化规律。探讨m g l 在皮肤损伤愈合过程中的表达及其表达随时间的变化规律，为进一步研究应用 m g l ( g 为推断损伤时间的依据以及其在组织损伤中的作用机制奠定良好的基础。 实验材料与方法 一、实验材料 ( 一) 主要试剂和材料 兔抗小鼠m g l 多克隆抗体( a b 2 4 7 0 1 )a b c a m 公司，英国 兔抗小鼠m p o 多克隆抗体( s o 3 3 5 9 6 ) s a n t ac r u z 公司，美国 大鼠抗小鼠f 4 8 0 单克隆抗体( s c 5 2 6 6 4 )s a n t ac r u z 公司，美国 兔抗小鼠a s m a 多克隆抗体( a b 5 6 9 4 )a b e a m 公司，英国 小鼠抗小鼠b - a c t i n 单克隆抗体( a 0 3 6 0 b m )s i g n a l c h e m 公司，加拿大 6 条带预染蛋白m a r k e rf e r m e n t a s 公司，立陶宛 w e s t e r nb l o t i p 细胞裂解液 碧云天生物技术研究所 硝酸纤维素膜( p v d f ) 膜 m i l l i p o r e 公司，美国 乙二胺四乙酸二钠广州化学试剂厂 三羟甲基氨基甲烷( 1 h s )a m r e s c o 公司，美国 甘氨酸( g l y c i n e )a m r e s c o 公司，美国 过硫酸铵( a p s )a m r e s c o 公司，美国 十二烷基磺酸钠( s d s )a m r e s c o 公司，美国 t e m e da m r e s c o 公司，美国 丙烯酰胺( a c r )b b i 公司，美国 e c l 发光试剂盒s a n t ac r u z 公司，美国 兔s p 检测试剂盒( s p 9 0 0 1 )北京中杉金桥生物有限公司 3 氨丙基3 乙氧基甲硅烷( a p e s )北京中杉金桥生物有限公司 罗丹明标记山羊抗兔i g g ( z f 0 3 1 6 )北京中杉金桥生物有限公司 f i t c 标记山羊抗兔i g g ( z f 0 3 1 1 ) 北京中杉金桥生物有限公司 山羊抗兔i g g 辣根酶标记( z b 2 3 0 1 ) 北京中杉金桥生物有限公司 山羊抗小鼠i g g 辣根酶标记( z b 2 3 0 5 )北京中杉金桥生物有限公司 8 r n a i s op l u s p r i m e s c f i p t t mr tr e a g e n tk i t s y b r p r i m e s c r i p t t mr t - p c rk i t ( 二) 主要实验仪器 冰冻切片机 普通光学显微镜 荧光显微镜 匀浆仪 冰箱 载玻片 烧杯、量筒 调速多用振荡器 电泳仪和转印仪 b i o p h o t o m e t e r 分光光度计 计算机显微图像分析系统 台式高速离心机 二、实验方法 ( 一) 动物模型的制作及分组 t a k a r a 公司，日本 t a k a r a 公司，日本 t a k a r a 公司，日本 l e i c a 公司，德国 o l y m p u s 公司，日本 o l y m p u s 公司，日本 i k a 公司，德国 美菱公司 上海跃进医疗器械厂 天津玻璃仪器厂 s o n i c sa n dm a t e r i a l s b 1 0 r a d e p p e n d o r f 公司，德国 m e t a m o r p hi m a g i n gs y s t e m 上海安亭科学仪器厂 健康成年雄性b a l b e 小鼠4 5 只，体质量3 5 - - 一4 0 9 ，随机分为9 组。其中皮 肤切创分为8 个时间段组，另一组为对照组，每组均为5 只小鼠。腹腔注射戊巴 比妥钠，背部剪毛处理后，常规手术消毒，在背部中央做一纵行长1 5 c m 皮肤全 层切口，深达筋膜。伤后每只单独饲养，避免细菌感染。分别于伤后6 h 、1 2 h 、 1 d 、3 d 、5 d 、7 d 、1 0 d 和1 4 d 将小鼠脱颈椎处死，取伤口处1 5 c m x l 0 c r a 皮肤组 织，对照组5 只小鼠麻醉后背部剪毛，不做切创，脱颈椎处死，取相同部位同等 大小皮肤。各组皮肤样本被均分为两部分，一部分用于h e 染色和免疫荧光染色， 另一部分用于w e s t e r nb l o t 和r e a l t i m ep c r 检测。 ( 二) h e 染色 9 1 、冰冻切片制备 标本经多聚甲醛固定1 2 h ，自来水冲洗4 h ，梯度蔗糖( 1 0 、2 0 、3 0 ) 脱 水，o c t 包埋，制作5 # m 厚度连续切片，贴于经a p e s 处理的载玻片上，待用。 2 、染色步骤 ( 1 ) 蒸馏水洗涤切片； ( 2 ) 苏木素染色5 m i n ； ( 3 ) 在1 盐酸酒精中分化后，自来水中返蓝3 0 m i n ； ( 4 ) 1 伊红染色l m i n ； ( 5 ) 室温晾干，二甲苯透明，中性树胶封片。 ( 三) 免疫荧光染色 l 、染色步骤 ( 1 ) p b s ( p h7 2 彳4 ) 洗涤切片，滴加正常山羊非免疫血清，室温下保湿 盒内封闭6 0 m i r a ( 2 ) 滴加用抗体稀释液1 ：1 0 0 倍稀释的兔抗小鼠m g l 多克隆抗体，保湿盒 内4 0 c 孵育过夜； ( 3 ) p b s 洗涤切片5 m i n x 3 次，滴加相应的荧光二抗，保湿盒内孵育1 2 0 m i r a ( 4 ) p b s 洗涤切片后，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察； ( 5 ) 染色过程中以p b s 或非免疫血清替代一抗作为阴性对照； 2 、阳性细胞计数 显微镜x 4 0 0 倍下，损伤区及损伤周边区每张切片中随机选择l o 个视野，计 数相邻切片包括多形核粒细胞、单个核细胞及纤维细胞的细胞总数和阳性细胞数。 计算每个视野中阳性细胞数与细胞总数的百分比。采用s p s s l 3 0f o rw i n d o w s 软 件，计量资料用均数标准差( i s ) 表示，进行单因素方差分析。 ( 四) 双重免疫荧光染色 1 、染色步骤 ( 1 ) p b s ( p h7 2 7 4 ) 洗涤切片，滴加5 b s a ，室温下保湿盒内封闭6 0 m i n ； ( 2 ) 滴加用抗体稀释液1 ：1 0 0 倍稀释的兔抗小鼠m g l 多克隆抗体和m p o 1 0 ( 1 ：1 0 0 ) 或f 4 8 0 ( 1 ：5 0 ) 或a s m a ( 1 ：5 0 ) ，保湿盒内4 0 c 孵育过夜； ( 3 ) p b s 洗涤切片5 m i n x 3 次，滴加相应的荧光二抗，保湿盒内孵育1 2 0 m i r a ( 4 ) p b s 洗涤切片后，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察； ( 5 ) 染色过程中以p b s 或非免疫血清替代一抗作为阴性对照； 2 、阳性细胞计数 显微镜x4 0 0 倍下，损伤区及损伤周边区每张切片中随机选择1 0 个视野，分 别计数中性粒细胞、巨噬细胞及肌纤维母细胞的细胞总数及其这三种细胞表达m g l 的细胞数。分别计算每个视野中m g l 阳性细胞数与该种细胞总数的百分比。采用 s p s s l 3 0f o rw i n d o w s 软件，计量资料用均数标准差( i s ) 表示，进行单因 素方差分析。 ( 五) w e s t e r nb l o t 技术检测 1 、蛋白样品制备 ( 1 ) 将剪碎的皮肤组织检材放入2 m le p 管中，加入裂解液和苯甲基磺酰氟 化物( p m s f ) ； ( 2 ) 冰上匀浆，超声破碎； ( 3 ) 4 0 c 条件下1 2 0 0 0 r m i n ( 离心半径9 3 5 c m ) 离心3 0 m i n ，提取上清液； ( 4 ) b c a 法【6 】进行蛋白定量： ( 5 ) 计算每个损伤时间组含5 0 t g 总蛋白所需样品体积，一2 0 。c 保存。 2 、实验步骤 ( 1 ) 灌胶：灌注1 2 分离胶，待分离胶凝固后，再灌注5 浓缩胶； ( 2 ) 蛋白变性：样品加适量比例上样缓冲液，混匀置于1 0 0 。c 金属浴中加热 5 m i n ，离心3 0 0 0 r m i n ，l m i m ( 3 ) 上样：向泳道内加入样品( 含5 0 弘t g 总蛋白) 及分子量m a r k e r ； ( 4 ) 1 2 s d s p a g e 凝胶电泳，浓缩胶电压设置为4 0 v ，时间3 0 m i n ，分离 胶电压设置为1 0 0 v ，时间1 2 0 m i r a ( 5 ) 剥胶后把胶置于转印缓冲液中，摇床中浸湿1 5 r a i n 后将滤纸浸入转印缓 冲液中浸泡；将p v d f 膜放在甲醇中浸泡5 r a i n 后，放入转印缓冲液中浸湿3 0 m i r a ( 6 ) 湿转法，转印电流设置为2 5 0 m a ，转印时间2 h ； ( 7 ) t r b s 中洗膜，5 m i n x 2 次，将p v d f 膜浸入5 脱脂奶粉中，封闭2 h ， 室温摇床上进行； ( 8 ) 加入一抗( 兔抗小鼠m g l 多克隆抗体，1 ：3 0 0 稀释；或小鼠抗小鼠b - a c t i n 多克隆抗体，1 ：1 0 0 0 稀释) ，塑料薄膜密封，4 。c 孵育过夜； ( 9 ) 洗膜t h 3 s 中5 m i n x 2 次，t b s 中5 m i n x l 次。然后加入二抗( 羊抗兔 i g g ，1 ：3 0 0 0 稀释；或山羊抗小鼠i g g ，1 ：5 0 0 0 稀释) 5 m l ，塑料薄膜密封，室温 孵育2 h ； ( 1 0 ) 洗膜t i b s 中5 m i n x 2 次，t b s 中5 m i n x l 次，e c l 发光。 3 、判断标准 以标准分子量m a r k e r 作指示，m g l 在3 5 k d 附近显示阳性谱带。利用s c i o n i m a g e 软件分别检测m g l 和b - a c t i n 蛋白表达的平均光密度值，二者之比作为 m g l 蛋白表达相对量。对各组的m g l 蛋白表达相对水平进行单因素方差分析。 ( 六) r e a l t i m ep c r 技术检测 1 、r n a 提取 ( 1 ) 将剪碎的皮肤组织( 1 0 0 m g ) 检材放x , 2 m le p 管中，加入l m lr n a i s op l u s ， 1 2 0 0 0 x g ，4 0 c 离心5 m i n ； ( 2 ) 取上清液，加入2 0 0 d 氯仿，1 2 0 0 0 x g ，4 。c 离心1 5 m i n ； ( 3 ) 取上清液，加入等体积的异丙醇，1 2 0 0 0 x g ，4 。c 离心l o m i n ； ( 4 ) 弃上清，保留沉淀，加入l m l 的7 5 乙醇清洗沉淀； ( 5 ) 弃上清，保留沉淀，干燥，溶解于3 跏l 的d e p c 水中； ( 6 ) 测r n a 的o d 值( a 2 6 0 a 2 8 0 ) 。 2 、逆转录和r e a l - t i m ep c r 过程 ( 1 ) 按p r i m e s c r i p t t mr tr e a g e n t sk i t 说明，配制2 0 a 反应体系，置p c r 仪 中，3 7 0 c 孵育1 5 m i n ，将m r n a 逆转录成c d n a ； ( 2 ) 反应所需特异性引物见表1 。应用a p p l i e db i o s y s t e m s7 5 0 0r e a l t i m e p c r s y s t e m 进行扩增。2 0 p l 反应体系组成如下：6 跏ld h 2 0 ，l o a ls y b r p r e m i x 实验结果 一、小鼠皮肤切创的宏观所见 小鼠皮肤切创后创口哆开伴明显出血及渗液。伤后6 h ，创口稍干燥。伤后1 2 h ， 可见创口已少量结痂( 照片l a ) 。伤后l d ，创口已无渗血、渗液，创口皮肤干燥， 可见完整痂皮。伤后3 d ，创缘皮肤收缩、平整，红肿消退( 照片l b ) 。伤后5 7 d ，痂皮与创缘皮肤分离，部分已剥脱，创口表面由增生的上皮覆盖，可见皮下 红色肉芽组织( 照片l c ) 。伤后l o d ，创口已呈线形愈合，无渗出，并明显短缩。 伤后1 4 d ，创口已完全愈合，仅留线状瘢痕，部分小鼠创口皮肤稍隆起，质地较 韧( 照片l d ) 。 二、小鼠皮肤切创的病理组织学改变 伤后6 h ，可见创缘有部分上皮胞浆均质化，胞核消失，真皮内多核粒细胞浸 润增多。伤后1 2 h ，见皮下组织内有大量渗出的多核粒细胞及单个核细胞( 照片 2 a 、2 b ) 。伤后1 d ，可见大量炎性细胞浸润，以单个核细胞为主。伤后3 d ，创口 结痂，肉芽组织形成，多形核粒细胞明显减少，梭形成纤维细胞开始增生( 照片 2 c 、2 d ) 。伤后5 d ，可见单个核细胞和大量的梭形成纤维细胞，肉芽组织向创腔内 机化。伤后7 d ，肉芽组织内可见大量梭形成纤维细胞和新生毛细血管( 照片3 a 、 1 3 3 b ) 。伤后1 0 1 4 d ，创口基本愈合，损伤区及损伤周边区内的单个核细胞逐渐减 少，间质增多，肉芽组织向瘢痕组织转变，表皮完全覆盖创口( 照片3 c 、3 d ) 。 三、m g l 免疫荧光染色 对照组小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺均有m g l 的表达( 照片4 a ) 。以p b s 代替一抗，无m g l 表达。皮肤切创伤后6 - - 1 2 h ，m g l 主要在多形核粒细胞中表 达( 照片4 b ) 。随着损伤时间的延长，阳性多形核粒细胞逐渐消失。伤后l 5 d ， 大量单个核细胞和成纤维样细胞显示m g l 的阳性反应( 照片4 c ) 。伤后7 - - 1 4 d ， 创口基本愈合，损伤区及损伤周边区m g l 阳性染色主要以成纤维细胞为主( 照 片4 d ) 。伤后1 4 d 仍然可见一些阳性的成纤维样细胞和少量的单核细胞。小鼠皮 肤切创后各时间段的m g l 阳性细胞百分率参见图1 ，统计学分析参见表2 。 四、双重免疫荧光染色 皮肤切创伤后6 1 2 h ，m g l 在中性粒细胞中呈现阳性反应( 照片5 ) 。伤后 l 5 d ，大量巨噬细胞显示m g l 的阳性反应( 照片6 ) 。伤后7 1 4 d ，创口基本 愈合，损伤区及损伤周边区m g l 阳性染色主要以肌纤维母细胞为主( 照片7 ) 。 中性粒细胞表达m g l 从6 h 开始增高，到1 2 h 达高峰，3 d 开始逐渐减少；巨噬细 胞表达m g l 5 d 达高峰；肌纤维母细胞从3 d 开始出现，其表达m g l 7 d 达高峰。 小鼠皮肤切创后不同细胞不同时间段表达m g l 阳性细胞百分率参见图2 。 五、w e s t e r nb i o t 检测分析 以6 - a c t i n 为内参( 分子量约为4 2 k d ) ，m g l 在对照组和实验组均有阳性条带， 位于3 5 k d ，各实验组的m g l 蛋白的表达强度呈现一定的时间规律性，从6 h 开始 增高，于5 d 达到高峰，随后开始降低( 照片8 ) 。m g l 蛋白相对表达水平( 孑j ) 参见图3 ，统计学分析结果参见表3 。 六、r e ai - tim ep c r 检测分析 以6 - a c t i n 为内参，对照组和实验组均有m g l 基因表达，且b a c t i n 和m g l 基因的融解曲线呈单峰，融解温度分别为8 7 0 c 和8 6 0 c ( 图4 ) 。采用c t 法 比较，各实验组的m g l 基因的表达强度呈现一定的时间规律，即5 d 为表达的高 峰期。m g l 基因相对表达水平( 孑s ) 参见图5 ，统计学分析结果参见表4 。 1 4 表1 ，m g l 和b - a c t i n 特异性引物序列和产物长度 损伤时间细胞总数阳性细胞率( ) c o n t r o l 3 0 6 3 1 ”9 1 7 + _ 0 7 5 ” 6 h 5 9 7 3 6 3 0 7 9 2 1 8 1 2 h 9 9 9 5 3 。4 2 2 7 + _ 1 8 1 。 1 d8 5 4 + 4 7 3 2 1 6 _ + 2 2 7 。 3 d8 4 9 6 64 0 2 1 1 3 6 5 d9 0 i 1 5 55 4 7 2 1 6 4 7 d1 1 6 7 7 5 51 9 2 2 0 2 。 1 0 d1 3 2 3 7 2 3 1 5 8 2 1 2 1 4 d 1 0 9 5 4 7 1 9 9 3 _ + 1 0 5 幸宰与对照组比较，p 0 0 1 ；书与相邻上组比较，p 0 0 5 。 表3 ，小鼠皮肤切创后各时间段m g l 蛋白表达相对水平( n = 5 ，i - i - s ) 损伤时间蛋白表达相对水平 c o n t r o l0 7 4 _ + 0 0 3 ” 6 h 2 0 0 + _ 0 1 1 1 2 h 2 1 3 + _ 0 1 2 1 d 2 0 7 o 1 1 3 d 1 9 9 0 0 7 5 d 2 4 5 _ + 0 1 4 7 d1 7 5 0 0 8 1 0 d1 6 8 _ + 0 0 6 1 4 d1 0 0 _ + 0 0 2 幸宰与对照组比较，p o 0 1 ；拳与相邻上组比较，p 0 0 5 。 1 5 表4 ，小鼠皮肤切创后各时间段m g l 基因表达相对水平( n = 5 ，i s ) 事与对照组比较，尸 0 0 1 ；宰与相邻上组比较，p o 0 5 。 j 、 邑 得 霉 舞 趔 盛 6 0 4 0 2 0 o 1 母 、_ ， 褥 熏 掣约 医 o i i n i j t i c o n t r o l6 h1 2 hl d3 d5 d7 d1 0 d1 4 d 损伤时间 图1 ，小鼠皮肤切创后各时间段m g l 的阳性细胞率 口中性粒细胞 口巨噬细胞 肌纤维母细胞 c o n t r o l6 h1 2 h