（运动人体科学专业论文）中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的差异性表达.pdf

摘要目的：本研究用比较蛋白质组学的理论与方法，探讨中等强度有氧运动条件下右室肌蛋白质组差异性表达的动态变化及其规律，筛选出运动应激条件下对心脏重塑有意义的右心室肌目标蛋白质，希望能为了解中等强度有氧运动引起心脏变化的机制，为深入研究学生、国民体质健康干预推荐和普遍采用的运动强度与形式提供依据。方法：以5 4 只雄性s d 大鼠为研究对象，按照体重随机分为6组( 对照组3 组和实验组3 组，每组n = 9 ) 。实验组进行中等强度的有氧运动( 7 0 8 0 v 0 2 m a x ) ，于运动的第4 、8 、1 2 周后分别与其平行对照组同时称取体重、麻痹处死、称取心脏重量，提取右心室肌的全蛋白，对样品蛋白用双向凝胶电泳技术分离、后固定染色。运用b i op dq u e s t 图像分析软件对双向凝胶电泳图谱进行分析，选取运动后差异表达量1 0 倍的蛋白点，用串联飞行时间质谱蛋白质仪( u l g r a f l f l e x t o f t o f ) 进行质谱鉴定。结果：经过4 、8 、1 2 周运动后，运动组大鼠心脏重量分别增加1 7 、3 7 与3 8 ，心重指数分别增加1 8 5 、3 4 5 与3 6 6 ( p o 0 5 ) 。此次实验获得了重复性和分辨率较好的双像凝胶电泳图谱，进行软件分析共获得运动组与对照组相比2 倍量以上差异点2 6 7个，1 0 倍以上差异点5 5 个，其中4 周1 1 个( 含“缺失”1 个，上调3 个，下调7 个) ，8 周1 3 个( 上调2 个，下调1 1 个) ，1 2 周31 个( 上调7 个，下调2 4 个) 。质谱分析并鉴定了其中5 个表达差异蛋白点，包括：丙酮酸脱氢酶e 1q1 ( 在运动4 周后表现为消失，1 2 周后下调) ，s b p l ( 在运动4 周后表达量明显上升，8 周及1 2 周后无明显变化) ，s p a l ( 在运动4 周后上调) ，s c a f l ( 在运动4 周后下调)和一个分子量为1 1 6 k d a 的未知蛋白。结论：1 2 周中等强度有氧运动( 7 0 8 0 v 0 2 m a x ) 后，大鼠心脏增大。在整个运动过程中，大鼠右心室肌蛋白质组在4 周、8 周运动后发生了显著性差异表达，8 周后继续运动蛋白质组出现适应性变化。鉴定的目标蛋白质点：丙酮酸脱氢酶e 1q1 、s b p l 、信号感应增殖相关蛋白1 ( s p a 1 ) 、前体m r n a 剪接及剪接调节因子s r 蛋白以及搜库发现的蛋白质点：c x 4 3 、a t p 合酶0 【亚基、氧化氢酶等，这些蛋白质的变化表明，采用中等强度有氧运动模型，可使心肌能量代谢水平提高、心肌应激反应与适应能力增强、抗氧化能力增强，运动大鼠心脏出现良好的适应性变化。关键词：中等强度运动；右心室肌；蛋白质组；差异表达；运动心脏a b s t r a c ti n t r o d u c t i o n ：b yu s eo ft h en e wt h e o r ya i l dm et e c h n i q u eo fp r o t e o l l l i c s ，w ea i mt od e l v et h ed i f f e r e l l t i a le x p r e s s i o na n dm e c h a i l i s mo fm er i g h t v e n t r i c u l a rh m s c l ep r o t e o m ew h i c hi so fb i 0 1 0 9 ym e a n i n gd l l r i n gt h ep r o c e s so ff o 加缸n gt h ea t h l e t i ch e a r t ，h o p et ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mm e d i u m - i n t e n s i t ya e r o b i ce x e r c i s e - i n d u c e dc h a n g ei nt h eh e a r t ，a i mt op r o v i d ear e f e r e n c et os t u d ym er e c o m m e n d e di n t e r v e n t i o no fs t l l d e n t sa n dn a t i o n a lh e a l t h ，a n dt op r o v i d eab a s i sf o rc h l o n i cc a r d i o v a s c u l a re x e r c i s er e h a l b i l i t a t i o n m e t h o d s ：f i 埘- f o u rm a l es dr a t sw e r ec h o s e na st h er e s e a r c hs u b je c ta n dd i 讥d e di n t os i x 伊吼l p s ：t h ec o n 仃0 1g r o u p ( 3g r o u p s ) a n dt h ee x e r c i s eg r o u p ( 3g r o u p s ) a c c o r d i n gt om e i ra t h l e t i ca b i l i t i e sa n dw e i g h t s t 1 1 ee x e r c i s e 伊o u pw a sm a d et ot a k eo na e r o b i c se x e r c i s e ( m e d i u mi n t e n s i v e ：7 0 - 8 0 v 0 2m a x ) a r e r4 ，8 ，12w e e k s ，t h er a t si nb o t h o ft h ee x e r c i s eg r o u pa n dm ec o n t r 0 1 铲o u pw e r ew e i g h t e 也a n e s m e t i z e dt od e a m ；t h e i rh e a i t sw e r ew e i g h t e d ，a n dm ew h 0 1 ep r o t e i n so fm e 打g h t v e n t r i c u l a rm u s c l ei nm er a t sw e r ee x 仃a c t e d ，a f t e rt h a t ，t h ep r o t e i n sw e r es e p a r a t e db y 觚o - d i m e n s i o n a lg e l se l e c 仃o g h o r e s i s ，s t a i n e d b yc o o m a s s i eb 栅i a n tb l u ed y e t h eg e l sm a p sw e r ea n a l y z e dw i mt h eb i op dq u e s ti m a g ea n a l y s i ss o r w a r et oc h o o s ev a r i a b l ep r o t e i n sa n dt h ec h o s e np r o t e i n si l iw e r ei d e n t i f i e db yu l g r a f l - f l e x t o f t o f r e s u l t s ：a r e r4 ，8 ，12w e e k s t r a i n i n g ，t h eh e a r tw e i g h to ft h ee x e r c i s eg r o u pi n c r e a s e d1 7 、3 7 a n d3 8 r e s p e c t i v e l yc o m p a r e dw i t hm a to fm ec o n 仃0 1g r o u p ，a n dt h ei n d e xo fh e a r tw e i g h tw a s18 5 ，3 4 5 a n d36 6 r e s p e c t i v e l yh i g h e rm a nm a to fm ec o n 仃0 1g r o u p t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n ti ns t a t i s t i c s i ti n d i c a t e da e r o b i ct r a i n i n gh a da r o u s e dc a r d i a cr e l n o d e l i n g 锄dt h eh e 缸h a dc h a n g e dm o 印h 0 1 0 9 i c a l l y g o o d2 - d eg e l sw e r eo b t a i n e d 疳o mt h i se x p e r i m e n tw i mh i 曲m a t c h i n gr a t ea n dh i g hr e s o l u t i o n a n a l y z e dw i mb i o - r a dp dq u e s t ，m ep r o t e i ns p o t so v e r1ot i m e si nm e 、沛o l e2 6 7s p o t sw h i c hw e r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e da r e r 仃a i n i n gi e a c h e dt h ea n l o u n to f55 a n d11s p o t se x p r e s s e do v e r1ot i m e sa r e r4w e e k s 仃a i n i n g ( i n c l u d i n gad i s 印p e a r e dp r o t e i n ，3u p - i e g u l a t e d ，7d o 、n - r e g u l a t e d )，s od i d13s p o t sa r e r8w e e k s ( i n c l u d i n g2u p - r e g u l a t e d ，1 1d o 、釉- r e g u l a t e d ) ，a i l da n o t h e r31s p o t sh a dm es i m i l a re x p r e s s i o na r e rl2w e e k s ( i n c l u d i n g7u p - r e g u l a t e d ，2 4d o 、釉- r e g u l a t e d ) f o u rs i 印i f i c a n tp r o t e i n s仔o mm ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e ds p o t sw e r ec h o s e nt oi d e n t i 矽b yu l g r a f l f l e x - t o f t o f ，t h e yw e r e ：p y r u v a t ed e h y d r o g e n a s ee1a l p h a1 ( d i s a p p e a r e da r e r4w e e k s 仃a i n i n ga n dd o 、m r e g u l a t e da n e r12w e e k s 仃a i n i n g ) ，s b pl( u p - r e g u l a t e da r e r4w e e k s t r a i n i n 曲，s p a l ( u p - r e g u l a t e da r e r4w e e k s t i a i n i n g ) ，s c a f1 ( d o 、7 m - r e g u l a t e da r e r4w e e k s t r a i n i n g ) t h e s ep r o t e i n sw e r ec l o s e l yr e l a t e dt oe n e r g ym e t a b 0 1 i s mo rt h es e l p r o t e c t i v em e c h a n i s m ，a n dp l a y e da ni h 巾o r t a n tr 0 1 ed 嘶n gt h ec a l d i a cr e m o d e l i n g i n c l u s i o n ：a r e rl2w e e k s 仃a i n i l l g ，t h er a th e a r to fm et e s t 舒o u pb e c a n 媳l a r g e r a r e rt h em e d i u mi n t e n s i t y 仃a i n i n g ，m ep r o t e o m eo fm en g mv e n t r i c u l a rm u s c l ei nt e s t 伊o u pr a t sh a dan o t a b l ed i f r e r e n t i a le x p r e s s i o nc h a n g ea r e r4a 1 1 d8w e e k s 仃a i n i n g ，a 1 1 da r e r8w e e k s 仃a i n i n g ，t h ep r o t e o m eh a da l la d 印t a b l ec h a n g e w es u c c e e d e di nf i l 仃a t i n gt h eo b je c t i v ep r o t e i n s ：p y n j v a t ed e h y d r o g e n a s ee1a l p h a1 ，s b p l ，s p a l ，s c a f l ，a n dt h eo t h e rp r o t e i n s ：c x 4 3 ，a t ps y n t h a s es u b 吼i ta l p h aa n dc a ta n ds oo n t h ec h a n g eo ft h o s ep r o t e i n s e x p r e s s i o nm e a n st h em e d i u mi n t e n s i t ) rt r a i n i n gc a i li n d u c em e 仃a i n i n gr a th e a r t sh a daw e l la d 印t i v ec h a n g e s i tc o u l di m p r o v em el e v e lo fc 砌i a cm u s c l ee n e r g ym e t a b 0 1 i s h l ，s t r e n g m e nt h ea _ b i l i t yo fc 裥i a c 枷s c l es 仃e s sr e a c t i o na n da d a p t a t i o n ，a n dm e l i o r a t em eb l o o dp r e s s u r ea d ju s t n l e n ta b i l i t i e s k e yw o r d s ：m e d i 啪i n t e n s 毋t r a i n i n g ；r i g h tv e n t r i c u l a rm u s c l e ；p r o t e o m e ；d i f r e r e n t i a le ) 【p r e s s i o n ；a t h l e t i ch e a r t v缩略词表( 中英文对照)a c n乙腈( a c e t o n i t r i l e )a c r丙烯酰胺( a c r y l 锄i d e )a - p s过硫酸铵( 雅皿o i l i u mp e r s u l f a t e )b i s甲叉丙烯酰胺 n ，n m e t h y l e n e b i s - ( a r y l a m i d e ) 】b s a牛血清白蛋白( b o v i r l es e n l ma 1 b 啪i n )c h a p s3 一 ( 3 胆酰胺丙基) 一乙二胺】一1 一丙磺酸d d h 2 0双蒸水( d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r )2 一d e双向凝胶电泳( 押。叫d i m e l l s i o n a lg e le l e c 缸0 p h o 他s i s )d t t二硫苏糖醇( d i t m o t l 珊i t 0 1 )e d t a乙二胺四乙酸( e i l t h y l e n e d i 锄i n e t e t r a - a c e t i c a c i d )l 认碘乙酰胺( i o d o a c e t 锄i d e )f等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g )口g固相p h 梯度( i m m o b i l i z e dp h 鲥i e n t )m r相对分子量( r e l a t i v em 0 1 e c u l a rw e i 曲t )n p 4 0非离子去垢剂( n o l l i d e tp 4 0 )p a g e聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l 锄i d eg e le l e c t r c i p h o r e s i s )p m f肽指纹图谱( p 印t i d em a s s 丘n g e 印r i n t )p m s f蛋白酶抑制剂( p h e n yl e m t h a n s u l f o n y ln u o d d e )p i等电点( i s o e l e c t r i cp o i n t )s d s十二烷基硫酸钠( s o d i 啪d o d e c y ls u l f a t e )s s p标准点编号( s t a n d a r ds p o tn 硼曲e r )t e m e d四甲基乙二胺( n ，n ，n ，n ；一t e t r 锄e m y l e m l e n ed i 锄i n e )t r i s三羟甲基氨基甲烷( t r i s 一( h y d r o x y m e t h y l ) 锄i n o m e t h a n e )m a i d i t o f t o f m s基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱( m 删x a s s i s t e dl a s e r铆o - s t a g ed e s o 巾t i o n i o n i z a t i o nt i m e o f n i 曲tt a n d e mm a s ss p e c t r d m e 缸y )5 3湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：皂3 ，压妒7 年j 月；j 日湖南师范大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1 、保密口，在年解密后适用本授权书。2 、不保密瓯( 请在以上相应方框内打“ )作者签名：皂孑善导师签名：了鼍彬扎，y日期：叩年j 月；日日期：z 尹厂月弓7 日z )j乡7中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的差异性表达1 前言2 0 0 6 年9 月1 8 日国家体育总局和教育部在京联合公布了“全国第二次国民体质监测公报”，监测结果显示“成年人体质除优秀率比2 0 0 0 年增加了2 7 个百分点外，良好率和合格率比2 0 0 0 年减少了3 5，不合格率比2 0 0 0 年增加了0 9 ”。监测结果说明，成年男女的体质健康的整体趋势在下降乜1 。而青少年中，学生身高、体重、胸围增长的同时，超重与肥胖检出率继续增加。与2 0 0 0 年相比，大、中、小学学生视力不良率均有所上升。学生各年龄组的肺活量水平继续下降，速度、爆发力、力量耐力素质水平进一步下降。这一结果已经引起了党中央的高度重视，2 0 0 7 年4 月2 9 日，启动了“全国亿万学生阳光体育运动”，旨在积极提高学生体质健康水平，增强青少年体质。要对这一健康状况进行干预，尤其是对心肺功能持续下降这一状况进行干预，有氧运动是首选。众多研究表明：有氧运动可以增强体质，促进心脏功能吲。有氧运动可以使心脏发生形态结构和功能的变化，表现为心腔扩大，心壁增厚，心肌收缩力增加，长时间中等强度有氧运动可以形成运动心脏。而且，中小强度有氧运动训练更是可以对一些心血管疾病起到康复作用，如冠心病，急性心肌梗塞等睁1 0 1 。关于运动能诱导心肌发生改变从而影响心肌功能改变的机制，常芸等学者提出：这一机制可能是运动促使心肌收缩时收缩结构钙可获得量增多，从而促进心肌收缩硕士学位论文力、氧化代谢及分泌功能。但这一说法未得到确证。到目前为止，这一机制都未能明确。蛋白质作为生命活动的直接执行者，是生物体中最重要的组成成分与功能执行者。心肌蛋白质是心脏结构和功能的基础。心肌结构和功能的改变，必然导致心肌蛋白质的表达量和质发生变化。右心室作为整个心脏重要的结构和功能单位，有着其独特的作用。临床医学显示：右心室与多种疾病相关，如肺动脉高压、心肌病、心力衰竭等。而且，有研究表明：长期有规律的耐力训练可使右室发生与左室一样的重塑【1 l 】。另有研究表明，右心室的功能能够对左心室造成影响【1 2 ，1 3 1 。而在运动医学界，有关蛋白质的研究以往均借鉴于临床医学等领域的成果，无法筛选区别于病理应激、在运动心脏重塑中发挥重要作用的目标蛋白质，而采用蛋白质组学技术可达到这一目标。n a n l r e 、s c i e n c e 在2 0 0 1 年2 月公布人类基因组序列草图的同时，分别发表r a n dn o wf o rm ep r o t e o m e ( 蛋白质组) ( n a t u r e ，2 0 0 1 ，4 0 9 ：7 4 7 ) 、“p r o t e o 武c s( 蛋白质组学) i ng e n o m e1 a n d ( s c i e n c e ，2 0 0 1 ，2 9 l ：1 2 2 1 ) 。几年来，国内外医学生物学领域有关重大疾病的蛋白质组学研究蓬勃兴起，p e n n i n 西o n 与d l l n n ( 2 0 0 1 ) 特别在p r o t e o m i c s ：仔o mp r o t e i ns e q u e n c et of u n c t i o n 中分析了大量开展蛋白质组学研究的多种优势。s c o b i o a l a ( 2 0 0 4 ) 在“p r o t e o i l l i c s ：s t a t eo ft h e 矾a n di t s印p l i c a t i o ni nc a r d i o v a s c u l a rr e s e a r c h 一文中指出，心血管系统中的病理变化源于蛋白的改变，这些蛋白包括药物靶点、疾病生物标志，以及理疗蛋白和肽( 为基因理疗提供设计基础) ；蛋白质组学技术不仅中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的差异性表达能鉴别蛋白，而且可以鉴别蛋白转录后修饰，揭示其参与的信号传导路径，以及在病理条件下路径的调控、蛋白质组的变化和心血管失调的关系等1 4 】。v i v a l l c o 在c a r d i o v a s c u l a rp r o t e o m i c sm e m o d sa n dp r o t o c o l s 中，介绍了进行心肌组织、细胞与亚细胞水平蛋白质组学研究的各种技术与方法，为进行运动心脏的蛋白质组学研究奠定了理论与方法学基础【1 5 】。m c q e g g o r 与j u n 曲1 u t 等人运用蛋白质组学技术先后鉴定了1 0 0 种心脏的特异性蛋白质，且发现病理性心肌肥大组织中缺失的蛋白质增加n 引。这一研究结果与我们前期实验结果：发现在持续大强度、力竭运动大鼠心肌中分别出现多个“缺失”的蛋白质点一致，而中等强度有氧运动组的左心室和心房肌中8 、1 2 周后未见；提示从蛋白质组的表达特征分析，运动心脏的重塑性质与负荷强度密切相关，这些缺失点具有的生理意义，无论是对运动健康、运动康复，还是对竞技运动训练而言，无疑都是非常重要的，应予以充分地重视；并提示采用中等、中小强度有氧运动进行的心脏重塑，更适应于体质健康的运动干预、慢性心血管疾病的运动辅助治疗与康复。在运动医学领域中，国内外有关蛋白质组学的研究才刚刚起步。国外，r o g e r s等对安静和运动大鼠左心室肌蛋白进行了差异蛋白质组的研究，发现热休克蛋白和3q 羟基类固醇脱氢酶等2 6 个蛋白质点的表达量发生显著性变化，1 2 个新增的点【用。国内目前只有本院的史绍蓉教授及其指导下的学生刘田、龚丽等对力竭运动和递增负荷运动大鼠心室肌和心房肌蛋白质组进行了研列1 8 。2 2 】；袁爱国、刘建荣对长时间中等强度运动心脏重塑过程中左心室和心房进行了蛋白质组学的研究，筛选硕十学位论文出了2 0 余个具有运动应激的目标蛋白质点，但尚未专门对右心室进行研究【2 3 ，2 4 1 。对运动引起心脏发生改变的相关研究中，国内以常芸等为代表的科研工作者们发表了不少综述和研究论文【2 5 。2 9 1 。从细胞学和分子生物学角度，对运动与心脏、运动员心脏和高血压等病理心脏在结构、功能和代谢方面的变化和异同进行了新的探索，更多的集中在了运动对心脏微细结构的影响。国外的研究更多的集中在运动心脏与病理心脏的区别，从诊断上及诊断方法上进行了更多的研究。认识到运动心脏的心肌肥大是对心脏的保护作用，有学者已经在研究其机制并结合临床医学一起进行研究。其中，m c m u l l e nj r ，r e i l i l i l l g sg l 等正在寻找引起运动心脏发生的信号分子和分子通路，希望为治疗临床上病理性心肌肥大服务。他们通过试验证实，运动与p h o s p h o i n o s i t i d e3 k i n a s e q l l o a l p h a ) 信号都能导致心肌肥大，对心肌肥大具有保护措施，而p h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e q l l o a l p h a ) 的增加能延迟扩张型心肌病d c m 的存活时间。并指出：运动心脏肥大的基因确定将会为治疗心力衰竭提供新的手段。而且，他们已有研究表明，有几种信号分子在调节病理和生理心肌肥大中起到重要的作用，正在研究用运动心脏的目标心肌保护信号途径和基因激活来治疗或阻止心力衰竭【3 0 3 2 1 。到目前为止，本试验小组已经取得一些初步成果。在动物运动模型中，建立了力竭运动、递增负荷运动和中等强度运动多个刺激下的动物模型，确定了运动后的最佳取材时间( 运动后6 小时取材，此时4中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的差异性表达间蛋白质表达数目及表达量最多) ，并在此基础上分别对心肌( 分心房肌和心室肌) 进行蛋白质组学研究，并用质谱分析仪共鉴定了2 0余个有意义的目标蛋白点。但是，还缺乏对右心室肌的研究。本研究在前期工作的基础上，用比较蛋白质组学的理论与方法，探讨中等强度有氧运动过程中右心室肌蛋白质组差异性表达的动态变化及其规律，筛选出运动应激条件下对心脏重塑有意义的右心室肌目标蛋白质，希望能为了解中等强度有氧运动引起心脏变化的机制，为深入研究学生、国民体质健康干预推荐和普遍采用的运动强度与形式提供理论与实验依据，也为慢性心血管疾病的运动康复提供参考。硕士学位论文2 材料与方法2 1 实验对象与分组5 4 只2 月龄雄性s p r a g u e d a w l e y 大鼠( 购于湖南农业大学实验动物部) ，体重为2 3 6 土8 6 9 ，i i 级实验动物。室温2 0 2 5 ，相对湿度4 5 5 5 ，光照时间7 ：o o 1 9 ：o o ，按国家标准啮齿类动物饲料分笼喂养，自由进食和饮水自由进食和饮水，适应性喂养一周。将s d 大鼠按体重配伍随机分为6 组，每组9 只，运动实验组3组( 4 周、8 周和1 2 周运动实验组) 和对照组3 组( 4 周、8 周、1 2周平行对照组) 。2 2 实验动物模型运动方案实验动物模型参考常芸的运动心脏动物模型【3 3 】。s d 大鼠购入后，采用18 m m i n 一，1 5 n l i n d 。的运动方案，进行跑台适应性运动3 天。此后，对照组大鼠正常笼中生活状态，不施加运动负荷。运动实验组大鼠适应性运动3 天后，隔天增加负荷3 m - m i n ，1 0 1 1 1 i n d 1 至跑速达3 0m 1 1 1 i n ，6 0 1 n i n - d 。维持该中等强度负荷的有氧运动1 2 周，负荷强度相当于7 0 8 0 v 0 2 m a x 。整个运动过程中，每周运动6 天，周日休息1 天。2 3 仪器设备与试剂2 3 1 仪器设备p t 动物电动跑台( 购白杭州立泰科技有限公司) ，电子天平，自中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的差异性表达动取液器( 2 0 肛l ，1 0 0 “l ，2 0 0 肛l ，1 0 0 0 “l ) ，冷冻离心机，7 2 2 分光光度计，i p g p h o r 等电聚焦电泳系统( 购白a m e r s h a np h a m a c i a 公司) ，聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直平板电泳槽( 购自b i o r a d 公司) ，脱色小摇床，循环水浴箱，图像扫描仪( 购自中晶科技) ，u l g r a f l f l e x t o ft o f 质谱仪( 购自美国布鲁克道尔顿公司) ，切胶仪和自动酶解仪( 均购自美国p e 公司) 。2 3 2 试剂b r a d f o r d 试剂盒，固相p h 梯度等电聚焦干胶条( i m m o b i l i z e dd 巧s t r i pp h 3 l o 、长度1 8 c m ，购自加n e r s h 锄公司) ，尿素、n p 一4 0 、载体两性电解质( p a r n 】a l y t e3 1 0 ) 、p m s f 、c h a p s 、s d s 、溴酚蓝、丙烯酰胺、b i s 均为a m e r s h a mp h 撇c i a 公司；t e m e d 、胰蛋白酶、i a a 、d t t 、硫脲、b 巯基乙醇、乙腈购自s i g 撇公司；硫代硫酸钠购自f l u k a 公司；a p s 、标准蛋白混合物( p 一半乳糖苷酶1 1 6 ok d a ，牛血清白蛋白6 6 2k d a ，卵白蛋白4 5 o1 ( d a ，乳酸脱氢酶3 5 0k d a ，r e a s eb s p 9 8 12 5 o k d a ，p 乳球蛋白18 4k d a ，溶解酵素1 4 4k d a ) 购自b i o r a d公司；考马斯亮蓝g 2 5 0 、甘氨酸、碳酸氢铵、甲醇、硫酸铵、磷酸、乙酸来自国产。2 4 样品制备2 4 1 取材各运动实验组分别于训练第4 、第8 和第1 2 周末次运动6 小时后与其平行对照组同时做麻醉处理后，固定于手术板上，打开胸腔，暴露心脏，在主动脉升部进行插管，用o 8 5 的生理盐水对心脏进行硕士学位论文灌流，待心脏颜色由深红逐渐变白后，迅速摘取心脏放入4 生理盐水中进行冲洗，小心地剔除心外膜，然后用滤纸小心的吸干水分，从心尖部位剪开后发现室间隔，区分左右心室后，用小剪刀剪取右心室组织，剪碎后，置液氮中贮存备用。2 4 2 称重取材前用台式秤称取各周训练后两组大鼠( 实验组和对照组) 的体重；取材后，先用滤纸吸干心脏水分，然后在电子天平上称整个心脏重量。2 4 2 蛋白提取从液氮中取出右心室肌组织，用小剪刀剪碎后，放入碾钵中并加入液氮碾成粉末状，之后每组的9 个样品等量混合，再按质量与体积比1 ：4 ( m g ：u 1 ) 加入组织裂解液( 8m o l lu r e a 、2 m 0 1 lt h i o u r e a 、4 c h a p s 、1 n p 4 0 、6 5 m o l ld t t 、o 5 m m o l lp m s f 、o 5 ( v 佃)p h a 珊a l a t e ( p h 3 1 0 ) ，4 振匀3 0 m i n ，使组织充分裂解后，组织悬液1 2 0 0 0 r m i n 一，4 离心3 0 i i l i n ，取出样品，小心的避开上层漂浮的脂质层，吸取上清液后，组内合并上清。用b r a d f i o r d 法b 钔对样品进行蛋白定量，依蛋白浓度按1 m g 每管分装后，- 7 0 冰箱保存待用。2 4 3 蛋白含量测定用b r a d f o r d 法对样品蛋白含量进行定量【3 4 1 ，测得的蛋白浓度为：4 周对照组为3 2 2u ul ，实验组为2 6 8u ul ；8 周对照组为l8 6p ul ，实验组为19 7p u1 ；1 2 周对照组为3 0 ou ul ，实验组为2 6 6u u1 。蛋白浓度按每管l m g 分装，- 7 0 冰箱保存待用。中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的差异性表达2 5 固相p h 梯度一s d s 双向凝胶电泳方法与图像分析主要参考g o 玛等【3 5 】的方法和i p g h o r t m 等电聚焦系统操作指南进行。具体操作步骤如下：2 5 1 试齐l j 配韦0水化液：u r e a1 2 9 ( 终浓度为8m 0 1 l 。1 ) ，c h a p so 5 9 ，i p gb u f f e r( p h 3 o 一1 0 ol ) 5 0 0ul ，1 的溴酚蓝5 0ul ，加双蒸水至2 5 m l 。每管7 5 0ul 分装后，2 0 保存。平衡储液：t h s - h c l 缓冲液( p h6 8 ) l o m l ，u r e a3 6 9 ，甘油3 0 r i l l ，s d s1 9 ，加双蒸水定容至1 0 0 r n l ，避光保存。平衡液a ：取平衡储液2 0 m 1 ，加入d t t4 0 m g 。平衡液b ：取平衡储液2 0 n 1 1 ，加入碘代乙酰胺6 0 0 m g 。3 0 凝胶储液：丙烯酰胺( 心c ) 7 3 9 ，甲叉双丙烯酰胺( b i s )2 9 ，加双蒸水定容至2 5 0 m l ，避光保存。分离胶b u f f e r ：s h c l 缓冲液( p h8 8 ) 4 5 4 2 7 5 h 1 1 ，s d s1 9 ，加双蒸水定容至2 5 0m l 。浓缩胶b u 腩r ：嘶s h c l 缓冲液( p h6 8 ) 6 0 5 7 n 1 1 ，s d s1 9 ，加双蒸水定容至1 0 0i i l l 。8 分离胶( 7 0 m 1 ) ：3 0 凝胶储液1 8 7 砷，分离胶b u 位r 1 7 5 h 1 1 ，双蒸水3 3 8 n 1 1 ，1 0 过硫酸铵( a p s ) 2 0 0pl ，t e m e d5 0ul 。4 8 浓缩胶( 8 i t l l ) ：3 0 凝胶储液1 2 8i i l l ，浓缩胶b u 脓2i n l ，双蒸水4 6 6 4r n l ，1 0 过硫酸铵( a p s ) 4 8ul ，t e m e d8ul 。电极缓冲液：t h s9 9 ，s d s3 9 ，甘氨酸4 3 2 9 ，双蒸水定容至3 l 。9硕士学位论文o 5 琼脂糖溶液：低熔点琼脂糖o 5 9 ，加电极缓冲液定容至1 0 0 m l 。考马斯亮蓝g 2 5 0 染色溶液：( 1 ) 固定液：乙酸6 0 r n l ，甲醇2 4 0 m 1 ，加双蒸水定容至6 0 0 n 1 1 。( 2 ) 染色液：硫酸铵6 0 9 ，考马斯亮蓝g 2 5 0o 7 2 9 ，磷酸6 9 6 m 1 ，甲醇1 2 0 i n l ( 用时再加入甲醇) ，加双蒸水定容至6 0 0 m l 。2 5 2 固相p h 梯度等电聚焦( 第一向)具体操作步骤如下：( 1 ) 用酒精清洗i p gp h o r 等电聚焦仪的平板电极，除去覆盖液及氧化层，自然晾干或吹干。( 2 ) 准备胶条盒：用专用洗涤剂清洗胶条盒，用水冲洗干净后，再用双蒸水漂洗，然后用滤纸吸干，用电吹风将水分充分吹干。( 3 ) 取事先配制好的，储存于2 0 的水化液7 5 0 山，室温下溶解；取出干胶条，在室温下平衡半小时后使用。( 4 ) 准备d t t 水化液：在称好的2 m gd t t 中加入7 0 0ul 水化液，充分混匀后，1 2 0 0 0 r 1 1 1 i n 1 离心5 l n i n ，以除去不溶物。( 5 ) 准备样品液：取出事先分装好的样品液a ( 实验组) 和样品液b( 对照组) ，每管加入准备好的水化液，至总体积为3 5 0u1 ，振荡混匀，样品管1 2 0 0 0r m i n 。1 离心1 0 m i n 。( 6 ) 把胶条盒放在i p gp h o r 的平板电极上，将处理好的样品均匀地加入到胶盒中，取平衡好的胶条，揭去干胶条的保护膜，胶面向下放入胶条盒中，胶条的酸性端接触胶条盒的正极，然后慢慢的后压，中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的筹异性表达把胶条放入胶条盒中，防止胶条与样品液之间出现气泡，并与胶条盒的电极紧密接触，来回慢慢的拖动胶条，使样品在胶条盒中均匀分布，加上覆盖油，盖上胶条盒盖。最后检查胶条盒下端的电极是否与i p gp h o r 的平板电极接触紧密。( 7 ) 设置程序：按i p gp h o r 操作说明连接电源，并按以下程序设置水化及聚焦有关参数：s t 印p r o c e s sc h 2 u r a c t e rv 0 1 t a g et i m e v 1 1 rs1a c t i v er e h v d r a t i o ns t e p5 01 2 hs 2d e s a l ts t e p2 0 01 hs 3d e s a l ts t e p5 0 01 hs 4d e s a l ts t e p1 0 0 01 hs 5v 0 1 t a g e对a d8 0 0 0o 5 hs 6f o c u s i n 2s t e p8 0 0 04 0 0 0 0 v l l r2 5 3 平衡( 1 ) 配制胶条平衡缓冲液a ( 平衡储液2 0 m 1 ，用时现加d t t 4 0 m g ，d t t 的主要作用是打开蛋白质的二硫键) 。( 2 ) 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上，将另一份厚滤纸用m i l l i q 水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。( 3 ) 将胶条转移至平衡管中，每根管中放一根胶条( 标记好对应的组别) ，在有胶条的平衡管中加入1 0 m 1 胶条平衡缓冲液a ，将平衡管放在水平摇床上缓慢摇晃1 5 m i n ，注意1 5 面n 要精确。平衡时间过短，会出现高分子量蛋白纹理现象，时间过长会导致蛋白质的丢失。( 4 ) 配制胶条平衡缓冲液b ( 平衡储液2 0 m 1 ，现用时加碘代乙酰胺6 0 0 m g ，i a a 的主要作用是封闭蛋白质的二硫键) 。在平衡液b 中1 1硕士学位论文加入碘乙酰胺，可以排除非蛋白相关点的纹理现象。( 5 ) 第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡管中的胶条平衡缓冲液a ，并用滤纸吸干多余的平衡液a ( 将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面) 。再加入胶条平衡缓冲液b ，继续在水平摇床上缓慢摇晃1 5 m i n ，注意1 5 r n j n 要精确。2 5 4 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) ( 第二向)平衡后的胶条进行第二向电泳。具体操作步骤如下：( 1 ) 清洗、干燥并安装玻璃板。( 2 ) 灌胶及凝胶：将配置好的8 的分离胶用玻璃棒引流，沿长玻璃板的内面缓缓倒入，胶液面距玻璃板上缘约4 5 c m 时停止，轻轻在胶面上加上一层约o 5 c m 厚的水饱和正丁醇，以隔绝空气，并使胶面平整。约3 0 4 0 m i n 后，当正丁醇和凝胶面出现明显界面时，即表示凝胶已经聚合完全。用注射器将正丁醇吸掉，并以滤纸吸干多余液体，用双蒸水冲洗几次胶面。然后沿玻璃夹缝加入浓缩胶。当浓缩胶加到距短玻璃板上缘l c m 处停止，轻轻覆盖一层水饱和正丁醇，等待聚合。( 3 ) 浓缩胶完全聚合后，吸掉胶面覆盖的正丁醇，用双蒸水冲洗胶面数次，用滤纸吸干水分。( 4 ) 用滤纸吸去s d s p a g e 聚丙烯酸胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶项部对自己。将琼脂糖进行加热熔化，并把m a r k e r 用水煮沸5 分钟。将煮沸的m a r k e r 用专用滤纸吸附后，从两玻璃板的最中等强度有氧运动大鼠右心室肌蛋白质组的差异性表达左侧加入，靠近隔条并紧贴胶面。( 5 ) 将i p g 胶条从样品平衡管中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在电泳缓冲液中，然后将胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。在凝胶的上方先加入一层低熔点琼脂糖，琼脂糖的温度不能太高，热的琼脂糖会加速平衡缓冲液中尿素的分解。( 6 ) 用镊子、压舌板或是平针的针头，轻轻将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完