（微生物学专业论文）米曲霉蛋白酶基因的克隆表达.pdf

摘要 摘要 l i l ll l ii ii ii i 1 1i i i i i y 17 4 7 0 8 1 米曲霉是一种重要的工业微生物，它具有丰富的酶系，能产生多种稳定 性高，能耐较高温度蛋白酶和糖酶。到目前为止，还没有在米曲霉中发现真 菌毒素。因为其安全性高，广泛应用于食品，医药及饲料等工业中。提高米 曲霉的蛋白酶活力成为工业生产的迫切需求。 本论文从米曲霉固态发酵产物中提取出米曲霉总r n a ，通过r t - p c r 扩 增出中性蛋白酶基因和碱性蛋白酶基因，并分别以大肠杆菌和毕赤酵母为宿 主菌进行表达。主要研究内容如下： 1 采取异硫氰酸胍法从固态发酵的米曲霉中提取总r n a ，并克隆出中性 蛋白酶基因和碱性蛋白酶基因； 2 以质粒6 h i s t p r x 2 为表达载体，构建重组质粒6 h i s t p r x 2 n i p 和 6 h i s t p r x 2 a l p ，转化e c o l ib l 2 1 ；分别以i p t g 和乳糖为诱导剂诱导蛋白 酶基因表达，通过s d s p a g e 鉴定重组蛋白在e c o l ib l 2 1 中的表达及其 表达形式； 3 采用n i - n t ah i s b i n dr e s i n 层析纯化带有6 h i s t a g 的重组中性蛋 白酶；采用福林芬法蛋白酶活力测定方法测定法得出纯化后重组中性蛋白酶 活力为3 0 4 u g ： 4 以p p i c 9 k 为表达载体，构建重组质粒p p i c 9 k a l p z t ，p p i c 9 k n i p j t ， 转化酵母菌g s l l 5 中；以甲醇为诱导剂诱导蛋白酶基因的表达，比较自身信 号肽和酵母信号肽两种不同外分泌信号肽对米曲蛋白酶基因表达的影响。 关键词：米曲霉，中性蛋白酶，碱性蛋白酶，表达 i i f a b s t r a c t a b s t r a c t a s p e r g i l l u so r y z a ei s a l li m p o r t a n ti n d u s t r i a lm i c r o - o r g a n i s m s i ti sr i c hi n e n z y m e s w h i c hh a v eh i g hs t a b i l i t y , h i g l lt e m p e r a t u r ec a p a b i l i t yp r o t e a s ea n d c a r b o h y 妇s o 缸i t h a v en o tf o u n dt h ef u n g u sa s p e r g i l l u st o x i n s s oi ti sw i d e l y u s e di nf o o da n df e e di n d u s t r i e sb e c a u s eo fi t sh i 曲s e c u r i t yp h a r m a c e u t i c a l i ti s t h ed u t yt oi m p r o v et h e i ra c t i v i t yt ot h eb i o l o g i c a lw o r k e r si np r o d u c t i o n i nt h i sp a p e r , t o t a lr n aw a ss u c c e s s f u l l ye x t r a c t e df r o ma s p e r g i l l u so r y z a e f e r m e n t a t i o np r o d u c t t h ea l k a l i n ea n dn e u t r a lp r o t e a s eg e n e sw e r ea m p l i f i e db y r t - p c r a l s ot h ep r o t e a s eg e n e sa r ee x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ia n dp i c h i a p a s t o r i sr e s p e c t i v e l y t h em a i nc o n t e n ta r ei l l u s t r a t e da sf o l l o w i n g ： 1 。t h et o t a lr n ae x t r a c t e ds u c c e s s f u l l yf r o mt h es o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o no f a s p e r g i l l u so r 弦a e ，c l o n e dt h en e u t r a la n da l k a l i n ep r o t e a s eg e n e ； 2 t h eg e n e sw e r ei n s e r t e di n t oae x p r e s s i o nv e c t o r6 h i s t - p r x 2t og e tt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d6 h i s t - p r x 2 - n i pa n d6 h i s t - p r x 2 - a l p t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dt r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1a n di n d u c er e s p e c t i v e l yb yl a c t o s ea n dm t g ； 3t h er e c o m b i n a n tn e u t r a lp r o t e a s e 、析廿l6 h i s 。t a gw a sp u r i f yb yn i - n t a h i s b i n dr e s i n ；t h er e c o m b i n a n tn e u t r a lp r o t e a s e sa c t i v i t yi s3 0 4 u g b yf ul i n f e n m e t h o d ； 4t h eg e n e sw e r ei n s e r t e di n t oae x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kt og e tt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 k - n i p j t , p p i c 9 k a l p z t , t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d t r a n s f o r m e di n t oy e a s tg sll5a n di n d u c eb ym e t h a n 0 1 c o m p a r et h ed i f f e r e n ts i g n a l p e p t i d e si m p a c t i o no ft h eo w ns i g n a lp e p t i d ea s p e r g i l l u so r y z a ea n dt h ey e a s t so w n s i g n a lp e p t i d e k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u so r y z a e , n e u t r a lp r o t e a s e ，a l k a l i n ep r o t e a s e ，e x p r e s s i l l 缩略语 缩略语 n i p a l p e c o l i p c r i p t g g l y s d s p a g e k t r i s o d m m e d t a l b a c r b i s 姆 b p b d n t p t b e r p m p b s 英文名 缩略语表 n e u t r a lp r o t e a s e a l k a l i n ep r o t e a s e e s c h e r i c h i a c o l i p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n i s o p b o p y p d - t l a i o g a l a c t o s i d e g l y c i n s o d i u md o d e e y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e t h i s o a y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e o p t i c a ld e n s i t y m m o l l e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d l u r i ab e r t a n im e d i u m a c r y l a m i d e b i s a c r y l a m i d e a m m o n i u mp e r s u l f a t e b r o m o p h e n o lb l u e d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ir i s o r i ca c i d e d t ab u f f e r r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e i v 中文名 中性蛋白酶 碱性蛋白酶 大肠杆菌 聚合酶链式反应 异丙基p d 硫代半乳糖苷 甘氨酸 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 三磷酸腺苷 三羟基氨基甲烷 光密度 毫摩尔每升 乙二胺四乙酸 l b 培养基 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 过硫酸铵 溴酚兰 脱氧核苷三磷酸 t r i s 硼酸缓冲液 每分钟转数 磷酸盐缓冲液 堕堕至 一 一一一 k b b p d t t d n a d e p c k d a 王m p c r 州 b s a k i l o b a s ep a i r s b a s ep a i r d i t h i o t h r e i t o l d e o x y r i o n u c l e i ca c i d d i e t h y lp h o s p h o r y lc y a n i d e k i l o d a l t o n r e v e r s et r a n s c d p t a s ep c r “m o f l b o v i n es e r u ma l u m i n v 千碱基对 碱基 二硫苏糖醇 脱氧核糖核酸 焦碳酸二乙酯 千道尔顿 逆转录酶p c r 微摩尔每升 牛血清白蛋白 目录 目录 第一章前言1 1 1 米曲霉：1 1 2 米曲霉蛋白酶研究进展1 1 2 1 米曲霉的基因组小1 1 2 2 蛋白水解酶2 1 3 蛋白酶改造的方法2 1 3 1 蛋白酶改造的传统方法4 1 3 2 蛋白质的体外进化4 1 3 3 展望8 1 4 研究的目的、内容和意义9 第二章米曲霉蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆表达1 0 2 1 材料、仪器与试剂l o 2 1 1 材料1 0 2 1 2 主要仪器一1 1 2 1 3 主要试剂1 1 2 2 方法1 3 2 2 1 从米曲霉固态发酵物中提取总r n a l 4 9 1 1 3 2 2 2 引物设计。1 4 2 2 3e d n a 第一链合成1 4 2 2 4 米曲霉蛋白酶基因p c r 扩增1 4 2 2 5e 吁妣片断的纯化1 5 2 2 6 基因的t a 克隆16 2 2 7 表达载体6 h i s t - p r x 2 质粒提取( c h 3 c o o n h 4 法) l6 2 2 8 表达载体6 h i s t - p r x 2 和目的基因双酶切l7 2 2 9 目的基因与原核表达载体6 h i s t - p r x 2 连接1 7 2 2 1 0 大肠杆菌d h 5 c t 感受态细胞的制备1 8 2 2 1 l 转化e c o l id h 5 0 t 感受态细胞1 8 v i 目录 2 2 1 2 阳性克隆的筛选与鉴定1 8 2 2 1 3 重组质粒转化e c o l ib l 2 1 1 9 2 2 1 4 6 h i s t - p r x 2 n i p 和6 h i s t - p r x 2 a l p 融合蛋白的诱导表达1 9 2 2 15 表达蛋白的s d s p a g e 分析2 0 2 2 1 6 重组蛋白的纯化2 1 2 2 17n i - n t ah i s b i n dr e s i n 再生2 1 2 2 1 8 蛋白酶活力的测定2 l 2 3结果2 3 2 3 1r n a 提取结果2 3 2 3 2p c r 扩增结果2 3 2 3 3t a 克隆质粒测序结果2 4 2 3 4 表达载体的构建2 4 2 3 5 重组质粒在大肠杆菌中诱导表达及可溶性分析2 6 2 3 6 重组蛋白的活力测定和纯化2 7 2 4 讨论与结论2 9 2 4 1 讨论。2 9 2 4 2 结j 沧。3 0 第三章米曲霉蛋白酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达3 2 3 1 材料3 2 3 1 1 菌种和质粒一3 2 3 1 2 主要试剂及溶液3 2 3 2 方法3 3 3 2 1 引物设计。3 3 3 2 2 表达载体p p i c 9 k - n i p j t ，和p p i c 9 k - a l p z t 的构建3 4 3 2 3 毕赤酵母g s l l 5 的电转法转化与鉴定。3 4 3 2 4 酵母重组子的摇瓶诱导表达与分析3 5 3 3 结果3 6 3 3 1 口勿基因信号肽序列连接p c r 结果3 6 3 3 2n p 基因，口勿基因毕赤酵母表达载体的构建3 7 v i i 目录 3 3 3 毕赤酵母重组子的诱导表达及活力测定4 1 3 4 4s d s p a g e 电泳分析4 2 3 4 讨论与结论4 4 3 4 1 讨论。4 4 3 4 2 结论。4 5 第四章结论与展望4 6 4 1 结论4 6 4 2 展望：4 6 参考文献一4 7 攻读学位期间的研究成果5l 致 射5 2 v l i i 第一章前言 1 1 米曲霉 第一章前言 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 属于需氧型丝状真菌，是一种重要的工业微 生物，其主要特征是菌丝体具有横隔。在土豆天然培养基上培养开始为白色 的菌丝体，两天后即开始产孢子变绿；从平板反面看成同心圆，内圈颜色较 深，外圈颜色很浅成白色。生长p h 6 5 - 6 8 ，最适温度3 2 - 3 5 ，产酶温度 2 8 - 3 0 i l 】。米曲霉具有丰富的酶系，能产生多种蛋白酶和糖酶，是工业上三 大酶制剂生产微生物之一。到目前为止，米曲霉中还没有发现真菌毒素，是 一种安全的食品微生物，广泛应用于食品，医药及饲料等工业中。 1 2 米曲霉蛋白酶研究进展 1 2 i 米曲霉的基因组 目前米曲霉的全基因组序列已经测出，它是以菌株r i b 4 0 为样本测的， 它的完成使我们对米曲霉有更深入的认识。 ( 1 ) 总体结构 米曲霉有8 条染色【2 】，按其大小排序为i - v i i i ，大小分别是：6 3 m b 、 6 2 m b 、5 0 m b 、4 8 m b 、4 4 m b 、4 1 m b 、3 4 m b 、3 1 m b 共计3 7 6 m b ，线粒 体d n a为 2 8 9 k b ，端粒序列为t t a g g g t c a a c a ( w w w i o ，n i t g o j p d o g a n t o p ) 。米曲霉的染色体全长与黑曲霉翻n i g e r ) 和 黄曲霉似f l a v u s ) 相当，而比构巢曲霉似n i d u l a n s ) 和烟曲霉似f u m i g a t u s ) 大2 0 - - 3 0 左右，米曲霉基因组中超过1 0 0 个氨基酸残基的蛋白质基因数为 1 20 7 4 ，基因的平均密度为2 8 k b ，为酿酒酵母假c e r e v i s i a e ) 的1 4 倍( 酿 酒酵母为2 k b ) 。 ( 2 ) 米曲霉基因的特性 虽然米曲霉与酿酒酵母在进化树上相距很近，但米曲霉的基因组大小是 第一章前言 后者的2 5 倍，而且基因组中的基因数是后者的2 倍，这种差别主要是基因 扩增的结果。 与酿酒酵母相比，米曲霉中代谢相关基因都有明显的扩增，这些代谢相 关基因中，次代谢基因是最重要的，一些非代谢基因也有扩增：核结构基因， 防御机制基因和信号传递基斟引。这种基因扩增在构巢曲霉和烟曲霉也可观 察到，后者的基因都比米曲霉的基因小，这与以前的假设：代谢的灵活多样 性取决于基因组的大小相一致【4 j 。代谢基因的扩增使米曲霉有几种特有的代 谢途径。扩增最多的基因是有关甲苯酚，异丙( 基) 甲苯分解基因，疏水性 氨基酸合成和分解的基因【3 j 。 1 2 2 蛋白水解酶 经过对基因及蛋白序列分析发现：米曲霉中有外肽酶基因6 9 种，内肽酶 基因6 5 种，而报道的已知蛋白质序列的和核酸序列的只有1 8 种。米曲霉的 蛋白酶基因数量之多大大超过了其它的霉菌，占全部基因数的1 ，值得注 意的是米曲霉基因组中有大量的酸性蛋白酶基因如天冬氨酸型蛋白酶，胃蛋 白酶同源基因，可能是它适合在酸性条件下生长。米曲霉中有1 2 种丝氨酸型 外切羧肽蛋白酶，但缺乏木瓜蛋白酶同源基因，同时米曲霉中有大量的金属酶 基因。米曲霉中各种预测的蛋白酶基因的数量见表1 - 1 。 1 3 蛋白酶改造的方法 蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，在工业上有广泛的用途，能催化蛋 白质和多肽肽键水解。各种生物体都能合成各自的蛋白酶，但具有工业生产 价值唯有微生物蛋白酶1 4 。蛋白酶也是研究的比较深入的一种酶，已阐明不 少酶的一级结构以及立体结构【5 1 。 蛋白酶的商品生产始于2 0 世纪初，但天然获得的菌株产生的蛋白酶往往 满足不了工业生产的要求，这就要求我们对菌株进行改造。1 9 5 6 年以来，研 究人员陆续选育了一批优良的蛋白酶菌株，包括酸性蛋白酶生产菌宇佐美曲 霉变异株5 3 7 、黑曲霉3 3 5 0 、肉桂色曲霉n o 8 1 和碱性蛋白酶生产菌株酱油 工业用的米曲霉3 0 4 2 ，以及中性蛋白酶生产菌如枯草杆菌1 3 9 8 、栖土曲霉 2 第一章前言 s 1 1 4 、3 9 2 4 等。 表1 - 1米曲霉基因组中预测的蛋白酶基因数量【4 】 t a b l e1 - 1p r o t e a s eg e n eo f a s p e r g i l l u so r y z a e 内肽酶 丝氨酸型 半胱氨酸型 天冬氨酸型 金属酶型 未知 总数 3 4 2 1 3 4 2 2 3 4 2 3 3 4 2 4 总数 1 3 4 3 n 挖 m 埔 加 鲒 第一章前言 1 3 1 蛋白酶改造的传统方法 传统的改造方法主要是诱变育种。原理是物种的突变，它是继选择育种 和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。突变包括自发突变和诱发突 变。诱发突变突变频率高，一般为1 0 7 - 1 0 一，而自发突变一般为1 0 - 1 0 4 ，速 度慢、时间长突变频率低。因此，工农业生产上进行微生物的菌种选育常常 采用前者。 1 3 2 蛋白质的体外进化 蛋白质的体外进化又称蛋白质的定向进化或实验室进化，用来描述建立 蛋白质突变库，并对文库进行定向筛选获得目的功能蛋白质的蛋白质改造方 法，分为建库和筛选两步。从上世纪7 0 年代起，蛋白质定向进化的系统方法 就陆续有人报道【6 7 8 l 。最早报道的是1 9 7 3 年对大肠杆菌l a c z - 筛选成功地筛 选到了能在以半乳糖为唯一碳源的大肠杆菌。随着各种分子生物学工具的出 现，人们已经能十分方便地在体外对核酸进行切割和重组，并转入受体中， 同时新出现的高通量筛选方法，使人们从过去的的筛选量从1 0 3 - 1 0 4 发展为 1 0 1 2 - 1 0 1 4 ，这些技术使定向进化日益成熟起来并广泛地应用到生物各领域。 ( 1 ) 蛋白质进化策略 蛋白质进化最重要的目的是获得人们预期的有某种特性的蛋白质用于 工农业生产和科研。目前主要有两种策略，第一种是理性设计：蛋白质改造 是基于我们对蛋白质的结构和功能十分清楚之上对其某一部分或某一点进行 改造如点突变；第二种是非理性设计【9 】：对蛋白质进行随机任意的改变后， 通过筛选获得目的突变子。后一种方法事先不需要了解蛋白质的结构等有关 信息，甚至是一无所知也能达到我们改造的目的。目前我们所清楚的蛋白质 不多，尤其是结构和功能的相互关系，单一残基或某部分改变对整体的影响 等各方面都不是很清楚，只能采取随机突变再借助随后的筛选来改造蛋白质， 因而定向进化或称体外进化往往特指第二种策略。随着我们对蛋白质的深入 研究，做到有针对性的高效的合理性设计也指日可待。目前，有学者已提出 将两者策略结合起来的半合理性设计1 1 0 l 。s a n t o s hk u m a r 等对细胞色素p 4 5 0 4 第一章前言 分别进行了定点突变和随机突变，突变子的突变位点不同，但效果相刚1 1 1 。 ( 2 ) 蛋白质体外进化常用方法 ( 1 ) 随机突变技术 d n a 虽然稳定，但在各种因素作用下经常发生点突变，有时只有一个碱 基的突变就能改变整个蛋白质的生物功能，如血红蛋白的镰刀型贫血症。最 早根据这个进化方式改造蛋白质的定向进化技术是易错p c r ( e r r o r - p r o n e p c r ) ，就是利用低保真聚合酶或在改变p c r 系统中的一些因子如m 9 2 + ，是 p c r 过程中错配产生突变。易错p c r 简单方便易行，但有益突变较少，中性 突变和有害突变较多，少量的有益突变淹没在大量的有害和中性突变中。为 降低有害突变等造成的突变子失活，不得不根据文库大小控制突变率，一般 控制在卜3 b p 左右；其次，由于聚合酶本身的密码偏向性，4 0 9 的突变是 在a t 问的转换，因而文库的多样性十分有限，实际工作中往往采取连续易 错p c r ( s e q e n t i a le r r o r - p r o n ep c r ) ：将一次p c r 扩增得到的有益突变作为下次 p c r 扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量有益突变 积累而产生较大的突变。w o n gt u c ks e n g 1 2 l 等巧妙地利用通用碱基一次黄脱氧 核苷酸和q 一硫代磷酸核苷酸的性质设计了s e s a m ( s e q e n c es a t u r a t i o n m u t a g e n e s i s ) ，部分地克服了易错p c r 的缺陷，可在特定位点插入脱氧核苷 酸。化学介导的随机诱变技术【”1 产生随机突变的方法更简单，直接将d n a 放 入羟胺等诱变剂中处理，此外产生随机突变的的技术还有依插入和缺失原理 的 r i d ( r a n d o mi n s e r t d e l e t i o nm u t a g e n e s i s ) t 1 4 j 、利用d p 0 4酶的 f r a m es h u f f l i n g l l5 j 等。 上述的这些建库方法都有一个共同缺陷：有益突变子少。a s a k os a w a n 0 1 1 0 i 将定点突变和随机突变结合起来，随机突变了g f p ( g r e e nf l u o r e s c ep r o t e i n ) 的第2 0 3 个位点附近肽段，结果与定点突变的y 6 6 w 和t 2 0 3 y 效果一样使 g f p 转化为c g f p ( c y a n g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) ，而m o n a lrp a r i k h t l 9 1 则对 1 3 一岩藻糖苷酶的n a + 结合位点n 6 0 4 、d 2 0 1 、h 5 4 0 附近肽段进行了随机突变， 结果比d n a 改组( d n as h u f f l i n g ) 更有效。很明显，定点突变和随机突变 结合起来的定点饱和突变( s i t es a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ) 更有针对性。但这一方 法的前提是对改造的蛋白质结构和功能有清楚的认识。 ( 2 ) 重组技术 重组是进化的大手笔，它能有效地将积累各种有益突变，依同源性高低 第一章前言 可分为同源性重组和非同源性重组。 同源性重组技术 利用同源重组进行定向进化的最具有代表性的是d n a 洗牌 ( d n a s h u f f l i n g ) 【1 6 】，其基本原理是将目的d n a 片断化后( 5 0 1 0 0 b p ) ，进 行无引物的p c r 获得全长片断，导入受体获得文库。d n as h u f f l i n g 能有效地 积累有益突变，排除有害突变和中性突变，使自然界几十亿年来进化来的各种 有益突变聚合在一起，显著地提高了良性突变的概率，可达1 3 的良性突变。 为进一步扩大聚合力，常将同一家族的多种d n a 片段化后再进行d n a 改组， 即d a n 家族改组( d n af a m i l ys h u f f l i n g ) 。c r a m e f i 等【1 7 1 用4 个1 6 k b 的不同菌 属头孢菌素c 进行d n a 家族改组，酶活性提高了2 1 0 5 4 0 倍，在这一策略启 发下b l o c ks h u f f l i n g l l9 1 ，e x o ns h u f f l i n g l 2 0 1 ，s y n t h e t i cs h u f f l i n g t 2 1 1 ，a c c u m u l a t i n g t a i l e dm u t a t i o n t 2 2 1 ，y l b c ( y - l i g a t i o n a s e db l o c ks h u f f l i n g ) t 2 3 1 等一系列重组技术 相续提出。 过度模板随机嵌合生长r a c h i t t ( r a n d o mc h i r a g e n e s i s o nt r a n s i e n t t e m p l a t e ) t 2 4 】是将随机切割基因片断杂交到一个临时d n a 模板下( 以一定间隔 插入尿嘧啶的单链d n a ) ，用于重组的片段比d n as h u f f l i n g 中所使用片段更 短，明显提高了重组频率和密度，一般d n as h u f f l i n g 的酶切片断是5 0 2 0 0 b p ， 而r a c h i t t 最小重组片断可达5 b p ；另一方面，d n a 改组同源性高达9 0 ， 非同源性片断很难重组进去。r a c h i t t 通过选择临时模板能够使得一些特 殊片断，甚至是低同源性的小片断重组进去。 s o n 9 1 2 q 等发展了将d n as h u f f l i n g 和i t c h y 结合的m u r a ( m u t a g e n e s i s a n du n i d i r e c t i o n a lr e a s s e m l y ) ，他们先将目的基因进行d n a 改组，然后采取 i t c h y 策略建立氨基末端截短文库，通过这一过程将磷脂酶转为中性脂酶， 分析转化子文库序列，结果表明氨基末端缺失了6 1 - 7 0 个残基，并且其他区 域有少量氨基酸被替代。 除了这些同源重组方法外，还有随机引导重组r p b ( r a n d o m p r i m i n g r e e o m i n a t i o n ) t 2 6 1 、交错延伸s t e p ( s t a g g e r e d e x t e n s i o n p r o c e s s ) 2 7 1 、 s s g ( s i t e s p e c i f i cg e n o m i cm u t a g e n e s i s ) 和r d l ( r a n d o m d o m a i n l o c a l i z e d m u t a g e n e s i s ) t 2 8 1 等。 非同源性重组 通过同源重组和随机突变产生的突变子的结构和功能与母本蛋白质类 6 第一章前言 似，而非同源性重组产生的突变子能克服这一问题，创造出自然界不曾有的 新蛋白质。递增截短法i t c h y ( i n c r e m e n t a lt r u n c a t i o n ) t 2 9 】是非同源性重组的代 表。l u t zs t 3 0 】对其进行了改进，建立了t h i o i t c h y ，主要是在p c r 反应中 加入a 一硫代磷酸核苷酸。由于外切酶对其不起作用，因而文库的多样性不取 决于酶切时间，而是a 一硫代磷酸核苷酸的掺入量，理论上每个单碱基删除的 各种突变子都能得到，提高了文库的多样性。但以上两种建库方法中每个突 变子中都只有一个交换。a m o l 等创建的s h i p b e c ( s e q u e n c e h o m o l o g y i n d e p e n d e n tp r o t e i nr e c o m i n a t i o n ) t 3 1 1 与i t c h y 的原理类似但它们的 重组一定是在两个不同的父本之间产生。s c r a t c h y t 3 2 】结合了i t c h y 和 d n a s h u f f l i n g 的优势，使得突变子不再只有一个交换，而是多交换。但总体 上这些方法存在重组文库功能性突变子频率偏低的问题。 ( 3 ) 利用活细胞自身修复系统建库 基于p c r 的体外重组进化方法能有效地积累有益突变，但整个过程中需 合成大量d n a ，p c r 理论上可扩增任何长序列，但实际上当片断太长时，有效 性会降低，且往往引入不利突变。1 9 9 9 年，a r h d df h t 3 3 i 提出了体内和体外相 结合的异源双链重组( h e t e r o d u p l e x ) 方法，就是在体外形成的异源双链转入 受体中，利用细胞内修复系统对错配区修复时产生突变库。a r n o l df h 用截 短的g f p 文库建立异源双链后导入大肠杆菌中，结果恢复了g f p 的荧光特 性。g i l l e st r u o n t 3 4 1 针对真核生物酵母建立了酵母增强组合文库c l e r y ( c o m i n a t o r i a ll i r a r i e se n h a n c e dr e c o m i n a t i o n ) ，他们将人类的细胞色素酶 p 4 5 01 a 2 和1 a 1 先进行d n a 家族改组后建立文库，导入酵母中。而s t r a t a g e n e 公司【1 3 】贝0 把目的d n a 直接导入他们筛选到的d n a 修复途径缺陷型菌株中， 只需一夜就能获得突变率为1 2 0 0 0 的随机突变文库。这些方法解决了长序列 问题，可用于d n a 大片断的改造，甚至是整个操纵子。 ( 4 ) 全基因改组( g e n o m es h u f f l i n g ) 以上的进化技术都是针对单一蛋白质而言的，而在生产中，我们发现酶 改造后往往它的某一性质加强了，而另一性质却减弱，同时生产中往往使用 的是整个细胞或生物体，这时牵连的不再是单一蛋白质或酶，而是一个复杂 的代谢途径。n o r i oh a m a m a t s u 等1 3 5 】提出a c c u l a t i n gt a i l e dm u t a t i o n 建库策略， 以解决此矛盾，并以乳酸氧化酶为材料使酶活提高了5 1 0 倍，且热稳定性没 受到影响，但没见其他有关报道。全基因组改组是一种全新的策略，将传统 7 第一章前言 的育种技术与家族d n a 改组结合起来，改的不再是单一基因，而是整个基因 组，其原理是将不同的菌株或细胞除壁形成原生质体后进行融合，使基因随 机发生重组。这一方法在乳酸杆菌( l a c t o a c t i l l u s ) r 串得到充分体现【3 9 1 ，将低产 的菌株通过两轮改组就获得了广泛用于工业生产的s f 2 菌株，而用传统育种 获得相同性质的菌株却花了2 0 年分析了1 0 0 万个突变子。吉林大学【4 0 】利用全 基因改组，使乳酸杆菌的乳酸产量提高了3 1 倍，p h 抗性从4 4 降到3 0 。 全基因改组是一种非常省时省力的改组方法，不需要进行d n a 改组，p c r 转化等复杂过程，直接利用原生质体融合技术实现对基因组的改造，适合于 各种生物，是一种简单有效的进化方法。 ( 5 ) 利用蛋白质空间结构改变的r e m 方法 随机延伸诱导法r e m ( r a n d o me l o n g a t i o nm u t a g e n e s i s ) 是一种全新的进 化方法，它是在目的蛋白质羧基末端随机接上一个小肽，使蛋白质的空间结 构发生改变，从而引起某些特性的改变。蛋白质发挥其生物功能都要求有一 定的空间结构，而空间结构又取决于氨基酸序列在羧基末端接上一段小肽 后，空间结构必然变化，从而带动功能的改变。利用r e m 对嗜热脂肪芽孢 杆菌( b a c i l l u ss t e a r t h e r m o p h i l u s ) 的过氧化酶i 的热稳定性进行了改造【4 ， 分别筛选出热稳定性提高1 0 倍和酶活性提高7 2 倍的突变子。但还没见其他 成功的报导。 1 3 3 展望 随着定向进化技术的成熟，越来越广泛在高校和工业实验室用来改造酶： 提高酶稳定性和活力，增强底物特异性，改变作用条件，如非水剂条件。除 了针对蛋白质本身外，还广泛应用于研究d n a 重组技术，生物催化代谢路 径工程，医药，农业物种改良等。近年来，有学者将其应用于研究蛋白质结 构与功能和它们的进化关系，解释生物分子系统进化的意义等，可以说定向 进化方法是蛋白质工程技术发展的里程碑，几乎可以应用到生物科学的各个 领域。 8 第一章前言 1 4 研究的目的、内容和意义 米曲霉酱油发酵前期对原料进行降解的主要是米曲霉分泌的碱性和中性 蛋白酶。而本实验室前期研究表明，米曲霉分泌的中性蛋白酶活力相对诺维 信蛋白酶来说明显偏低。 天然的米曲霉菌株由于其分泌的蛋白酶活力低，甚至可能缺少一些蛋白 酶基因，因而在实际生产中严重地降低了原料的利用率，影响了产品的风味。 从当前米曲霉的改造来看，主要是集中传统的筛选和物理突变上，也有人通 过细胞融合的方法对米曲霉进行改造 3 9 4 0 】。通过分子生物学的定向进化还鲜 见报道。 为对米曲霉蛋白酶进行定向进化就必须首先将其克隆表达以便对其进行 分子生物学操作。当前还没有见米曲霉蛋白酶基因在大肠杆菌克隆表达的成 功报道，米曲霉蛋白酶基因成功克隆表达无一例外地选择酵母菌1 4 1 4 2 】。然而 由于大肠杆菌遗传背景简单，操作简便等优点，成为蛋白质体外克隆表达的 首选。因而米曲霉蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达对于定向进化来说显示 尤其重要。 在实验室前期工作的基础上，本研究拟对米曲霉a l p 基因和n i p 基因进 行体外克隆表达，为最终定向改造米曲蛋白酶提供参考。主要内容如下： 建立从高含量蛋白质的原料中提取r n a 的方法，从固态发酵的曲精中 提取米曲总r n a ；通过r t - p c r 建立米曲霉c d n a 文库并从中扩增出米曲霉 a l p 基因b b a 0 0 2 5 8 和n i p 基因a a f 0 4 6 2 8 表达序列；构建大肠杆菌表达载 体6 h i s t - p b x 2 a l p 和6 h i s t - p b x 2 n i p ，导入到大肠杆菌b l 2 1 中，经i p t g 和乳糖两种诱导系统诱导表达米曲霉蛋白酶，探讨不同诱导系统对米曲霉蛋 白酶基因在大肠杆菌中诱导表达的影响；同时构建毕赤酵母g s l l 5 分泌性表 达载体p p i c 9 k a l p z t ，p p i c 9 k - n i p j t ，并在毕赤酵母g s l l 5 中表达，探讨 不同信号肽对诱导表达米曲霉蛋白酶基因的影响。 9 第二章米曲霉蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 第二章米曲霉蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 通过定向进化技术提高米曲霉蛋白酶的活力，首先就必须使米曲 霉蛋白酶在体外表达。迄今为止，人们已经研究出多种原核和真核表 达系统用以生产重组蛋白。与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统 虽然存在着表达效率不高、无糖基化修饰等蛋白后加工和表达得到的 蛋白酶活性不够等问题，但是它具有操作简便、遗传背景清楚、可以 大规模发酵培养的优点。因此，大肠杆菌表达系统仍然是现阶段最常 用的蛋白表达系统【4 3 】。但大肠杆菌缺少真核生物蛋白质表达的加工系 统，因而用于真核生物时常常会出现表达的蛋白因为不能正确的折 叠，糖基化等而没有生物学活性。 米曲霉蛋白酶基因由三部分组成：信号肽序列、前导肽序列和成 熟肽序列，a l p 基因如图2 - 1 和n i p 基因如图2 2 所示。信号肽负责 将翻译的蛋白酶转出细胞；前导肽能抑制蛋白酶活力，同时对成熟蛋 白酶的正确折叠有重要作用 4 4 , 4 5 1 ，具有分子