（药物分析学专业论文）固定化超氧化物歧化酶的制备与性质研究.pdf

独创性声明 独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 固定化超氧化物歧化酶的制备与性质研究 固定化超氧化物歧化酶的制备与性质研究 研究生:李 磊 导 师:马长清 教授 中文摘要 中文摘要 固定化酶作为现代生物工程技术的重要组成部分之一，在医学、分析与分离技 术以及化学合成等领域有着广泛的用途。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase. 简称 sod）是美国科学家 mccord 和 fridovich1969 年从牛血红细胞中发现的一种含 有金属离子的酶，也是至今为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。该酶能专一的 清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基（o2 .） ，在维护生物机体内自由基产 生与清除的动态平衡过程中起着极其重要的作用。本课题制备了固定化超氧化物歧 化酶，测定了固定化酶的活力，并对其理化性质进行了系统的研究。 一、固定化超氧化物歧化酶的制备及活力测定 一、固定化超氧化物歧化酶的制备及活力测定 本课题通过对甲壳素的去乙酰化制备并纯化壳聚糖， 将壳聚糖与一定浓度的戊二 醛混合交联，使其发生氨醛缩合生成活化的载体，将超氧化物歧化酶与活化的载体 混合搅拌后抽滤并洗涤，放置于 4冰箱保存待用。以改进的邻苯三酚自氧化法为测 定酶活力的方法。固定化超氧化物歧化酶活性可达到 333u.g -1,酶活回收率为 86.32% 二、酶活力测定的两种方法比较 二、酶活力测定的两种方法比较 测定超氧化物歧化酶的活力，常采用经典的邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在碱 性条件下发生自氧化反应，生成中间产物红桔酚，同时生成 o2 .。邻苯三酚的自氧化 率随着超氧阴离子 o2 .浓度的增加而增大。sod 能催化 o 2 .发生歧化反应，生成 h 2o2 和 o2 .，从而抑制邻苯三酚的自氧化。样品对邻苯三酚的抑制程度，可反映样品中 sod 的含量。 本课题采用以维生素 c 为终止剂的邻苯三酚自氧化法测定 sod 的活性。经研究， 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 维生素 c 的加入，使原本持续的反应得以终止，为同时测定多组实验项数据提供了 条件。而且本法相比较经典的邻苯三酚自氧化法，不存在统计学差异。 三、固定化超氧化物歧化酶的理化性质测定 三、固定化超氧化物歧化酶的理化性质测定 本课题对固定化超氧化物歧化酶的贮存稳定性、ph 稳定性与温度稳定性进行了 研究，每天测定一次酶活力，得到其活力变化曲线，经测算，半衰期为 43.8 天；分 别在各种 ph 条件下测定酶的活力，结果固定化酶在 ph6 时活性最强；在各温度下测 定酶活力，结果表明固定化酶的最适反应温度为 45。固定化酶使用一次后回收， 测得活力为初始的 70.12%，使用两次后回收，测得活力为 51.72% 四、固定化超氧化物歧化酶的动力学研究 四、固定化超氧化物歧化酶的动力学研究 本课题在国内首次对固定化超氧化物歧化酶进行了动力学研究，测定了固定化 超氧化物歧化酶与溶液酶的米氏常数。固定化酶和溶液酶的米氏常数（km）分别为 0.18mmol/l 和 0.16mmol/l。固定化酶的 km 略低于溶液酶，说明固定化处理影响了 酶对底物的亲和力，使酶的活力降低了。 【关键词】【关键词】超氧化物歧化酶，壳聚糖，固定化酶，邻苯三酚自氧化，动力学 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 study on the property and immobilization of superoxide dismutase candidate: li lei supervisor: ma changqing abstract immobilized enzyme technique is an important component of modern bioengineering and biotechnology. the application of immobilized enzymes has been widely used in the fields of industry, medicine, analytical and separation techniques, chemical synthesis, and so on. superoxide dismutase(sod) was a type of enzyme that has metal ion and was found by american scientists mccord and fridovich in 1969 from ox red blood cells, which was also the only enzyme whose substrate is free radical. it takes an important part in keep the balance of bodys free radicals creation and clearance for he can clear o2. in the body. this study prepare the immobilized sod ,tests its activity and study on its physico-chemical property systematically. in this thesis, the studies on the preparation, properties and application of immobilized superoxide dismutase have been investigated. the immobilization of sod and its activity in this study, the chitin was treated to be chitosan, which was mixed with glutaraldehyde and amino-group combined with the aldehyde-group becoming a activated carrier. the sod was mixed and agitated with this carrier for hour and was given sucking filtration, cleaning and put into fridge for storage. the pyrogallol autoxidation method was used to test the activity of the immobilized enzyme with the result of 333u.g-1 and the recovery was 86.32%. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 the comparison of two methods of activity tests the traditional method of pyrogallol autoxidation was to use the o2. gradually produced in the autoxidation and the sod can clear the o2.,thus, the sod can be measured by the inhibition of the sample. in this study, advanced method of pyrogallol autoxidation that use vitamin c as a terminating agent was also used, it has no differences in statistics on contrary with the traditional one but also has its rare dominance that several samples can be tested at the same time. the chemical and physical properties of the immobilized enzyme the storage stability, ph stability and temp stability was studied. the half-life of the enzyme was 43.8 day showed by testing activity once a day. the very best of the ph condition was 6 by testing series of phs, while the best temperature was 45 in a series of different temperatures. the relative activity of the immobilized enzyme was 0.7012 after used for the first time and 0.5172 for the second time, setting original activity was 1. the dynamics of the immobilized enzyme it was the first time in country that study on the dynamics of the immobilized enzyme and testing of the km of the immobilized sod and original sod solution. the km was 0.18mmol/l of immobilized enzyme and was little higher than 0.16mmol/l that the km of sod solution. this was the signal that the immobilization had a little bad influence on the affinity of the enzyme and the substrate. 【key words】 superoxide dismutase, chitosan, immobilized enzyme, pyrogallol autoxidation，dynamics 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 第一章第一章 固定化超氧化物歧化酶的制备与活力研究固定化超氧化物歧化酶的制备与活力研究 固定化酶的含义是指，将水溶性酶与不溶性载体联结起来，使之成为不溶于水的 酶衍生物，又能保持大部分原酶的固有活性 1。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase.简称 sod）是美国科学家 mccord 和 fridovich 81969 从牛血红细胞中发现 的一种含有金属离子的酶，也是目前发现的唯一一个以自由基为底物的酶。该酶能专 一的清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，是机体对抗自由基的第一道防 线，在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡过程中起着极其重要的作用。 到目前为止，人们已从微生物、藻类、真菌、植物、昆虫、鸟类、鱼类、哺乳 动物等各种生物体中分离得到 sod，根据所含金属离子的不同，分为 cu,zn-sod、 mn-sod、 fe-sod 3 类： cu,zn-sod 呈蓝绿色， 主要存在于真核细胞的细胞质中； mn-sod 呈粉红色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞浆中；fe-sod 呈黄色，一般存在于 叶绿体基质中，不存在于线粒体中 9。 sod 能快速有效的清除过剩的超氧阴离子，在抗炎，抗辐射，抗肿瘤，抗衰老及 自身免疫性疾病方面均起重要作用。外源性 sod 已用于一些疾病的临床治疗，并取 得了令人满意的疗效，如：高压氧与氧中毒的预防和治疗，自身免疫性疾病的治疗， 急性炎症与水肿，肺气肿，辐射病与辐射防护，脏器缺血后再灌注损伤，老年性白 内障，抗衰老以及皮肤保养 9。 此外，sod 在食品工业也有重要应用。添加作为保健食品的功效因子的 sod 的牛 奶，啤酒等保健食品已经面世。另外，sod 也作为化妆品的添加剂。研究表明，sod 添加于化妆品中有四个方面的作用：防晒、抗氧化及防止皮肤衰老、抗炎、防治瘢 痕形成。 国内外已有不少的高级化妆品中添加sod制成面膜， 乳液等形式的化妆品 10。 目前对超氧化物歧化酶 sod 活性检测方法有很多，分直接法和间接法。直接法 是通过直接测定超氧阴离子 o2 .的.浓度来确定超氧化物歧化酶 sod 的活性，目前只 有电子自旋共振法（esr） 11，13。间接测定法较多，有自氧化分析法包括邻苯三酚自 氧化法 13，14和肾上腺素法15；羟胺发色法16；化学发光法17，18；电化学方法19，20，21 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 等，目前研究更多在于将 sod 膜固定化后制成生物传感器在体检测超氧阴离子浓度。 本实验用终止剂改进的邻苯三酚自氧化法测定 sod 活性，是一种结果准确，操作简 单测定方法 14。 sod 作为药品，食品，化妆品在生活中的应用越来越广泛，但 sod 具有潜在的免 疫原性，不稳定性，极易失活以及其在体内的半衰期短，不易维持长时间的防治作 用等方面的缺点，限制了其在临床和保健方面的应用，因而尝试用固定化的方法改 善 sod，使其具有较好的热稳定性，抗酸碱性，较长的保存时间和重复使用的性质。 本实验采用壳聚糖-戊二醛交联法固定 sod， 壳聚糖是一种良好的酶固定化载体， 安全无毒，已成熟应用于多种酶的固定化 22，如 d-葡萄糖异构酶，葡萄糖淀粉酶， -半乳糖苷酶，-葡萄糖苷酶等。 甲壳素（chitin）亦称甲壳质，是以-1，4 糖苷键连接的 2-乙酰胺基-2-脱氧- -d-葡萄糖，广泛存在于昆虫、甲壳纲动物外壳及真菌细胞壁中，是自然界中产量 仅次于纤维素的天然多糖。用强碱水解或酶解脱去一部分或 90%以上甲壳素糖基上 的乙酰基，即形成壳聚糖（chitosan）也叫甲壳胺。如下图所示： o oh nhcoch3 ch2oh oo o ch2oh oh nhcoch3 n o oh ch2oh oo o ch2oh oh nhcoch3 n nh2 浓 碱处 理 （chitin） （chitosan） 壳聚糖资源丰富，价格低廉，化学性质稳定，与其它天然材料相比更抗拒微生 物分解，具有良好的热稳定性和机械操作性等优点。壳聚糖分子结构中含有大量游 离氨基，使酶易于固定，是固定化酶的良好载体材料，已成功应用于固定化阿拉伯 呋喃糖苷酶，酪氨酸酶和葡萄糖苷酶等酶制剂23。 戊二醛为无色透明油状液体，分子式为c5h8o2。略带剌激性气味，易溶于水、 乙醇等有机溶剂。戊二醛性质活泼，易聚合，与含有氮的化合物发生反应氨醛缩合 反应。在已知的醛中，戊二醛是一种最好的蛋白质交联剂。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 本课题用浓碱液处理甲壳素,制备纯化了壳聚糖,再以壳聚糖为载体,用戊二醛作 交联剂,制备固定化超氧化物歧化酶, 探讨了固定化超氧化物歧化酶的最佳条件和固 定化酶的理化性质。 1.1 仪器与试剂仪器与试剂 仪器 sdc-6 数控超级低温恒温槽（宁波天恒仪器厂） ；uv-754 紫外可见分光光 度计；tgl-16m 台式高速冷冻离心机；syz-b 石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏省宜兴市 勤华石英玻璃仪器厂） 。 试剂 甲壳素（生化试剂 br） ，中国医药（集团）上海化学试剂公司； 铜锌超 氧化物歧化酶（美国 sigma 公司） ；小牛血清白蛋白（罗氏制药有限公司） ；戊二醛 25%水溶液（中国医药集团（上海）化学试剂公司） ；维生素 c（天津市科源化学试剂 有限公司） ；邻苯三酚（天津市标准科技有限公司） ；三羟甲基氨基甲烷 （tris） （天 津市博迪化工有限公司） ；其他试剂均为分析纯。 磷酸盐缓冲液（ph7.0）的配制：精密称量 0.68g 磷酸二氢钾，溶于 29.1ml 的 0.1mol/l 的 naoh 溶液中，定容至 100ml 容量瓶。 tris-hcl（ph8.23）缓冲液的配制：取 10ml 0.2mol/l 的三羟甲基氨基甲烷与 9ml0.2mol/l 的 hcl 溶液混合，加入 21ml 蒸馏水即可。 含 edta 的 tris-hcl 缓冲液的配制：精密称量 0.186g edta,加入到 500ml 制备好 的 tris-hcl（ph8.23）缓冲液。 超氧化物歧化酶储备液的配制：取 1mg的超氧化物歧化酶溶于 10ml0.05 mol l-1(ph=6.0)的磷酸缓冲液中，使成 0.1mg ml -1。 邻苯三酚溶液 （45mmol/l） 的配制： 精密称量 0.567g 邻苯三酚， 加水定容至 100ml 容量瓶，避光保存。 维生素 c （5%） 溶液的配制： 精密称量 0.5g 维生素 c， 加水定容于 100ml 容量瓶。 0.3% 戊二醛溶液配制：微量加样器吸取 0.3ml 的 25%戊二醛溶液，加水定容至 25ml。 牛血清白蛋白溶液配制： 取 10mg 牛血清白蛋白加水溶解定容于 100ml 容量瓶中。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 亚沸水：通过石英亚沸高纯水蒸馏器蒸馏而得到，具有杂质含量少，纯度高的优 点，有利于酶保持活性。 1.2 实验原理实验原理 1.2.1 酶固定化方法酶固定化方法 本章采用碱液法制备了具有较高氨基含量的壳聚糖，并以之为载体，利用戊二醛 载体交联法，分两步制备了壳聚糖固定化超氧化物歧化酶。固定化方法如下图所示： o ch2oh o oh nh2 o o ch2oh nhcoch3 oh* n o ch2oh o oh o o ch2oh nhcoch3 oh n o ch2oh o oh o o ch2oh nhcoch3 oh n glutaraldehyde acetate. 40 n=ch(ch2)3cho nh2 4 n=ch(ch2)3ch=n 1.2.2 酶活力测定原理酶活力测定原理 本实验采用改进的邻苯三酚自氧化法测定 sod 的活性。 邻苯三酚在碱性条件下发 生自氧化反应，在自氧化过程中，超氧阴离子（o2 .）不断消失又不断生成，当达到 稳态时，其浓度保持恒定，邻苯三酚的自氧化率呈 o2 .浓度相关性。sod 能催化 o 2 . 发生歧化反应，生成 h2o2和 o2，从而抑制邻苯三酚的自氧化。样品对邻苯三酚的抑制 程度，可反映样品中 sod 的含量 4。实验测定在 325nm 处有色醌类的吸光度变化，反 映出邻苯三酚自氧化反应的抑制程度。 o2 .在水溶液中是中等强度的还原剂和弱氧化剂， 它能迅速参与单电子还原反应， 但也能被强氧化剂还原。当强还原剂维生素 c 作为终止剂加到反应体系时，便迅速 与 o2 .反应，从而阻止自氧化反应的继续进行。从而为同时测定多样品争取了时间。 在规定条件下，1ml 反应液中，每分钟使溶液在 325nm 处吸光度减小一半（即使 邻苯三酚自氧化抑制率达 50%）的酶量定义为 1 个酶活力单位。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 (其中：v 为反应液的总体积，v 为溶液酶的加入量，m 为固定化酶的加入量。) 1.3 固定化酶的制备固定化酶的制备 1.3.1 壳聚糖的制备与纯化壳聚糖的制备与纯化 称 20g 甲壳素粉末，用 400ml 的 47%氢氧化钠溶液于 60浸泡 10h，用 80的 二次蒸馏水洗涤至中性后，再用 47%氢氧化钠溶液重复处理一次，进一步脱乙酰化， 最后用 80热水洗至中性，干燥后得到白色粉末状壳聚糖。 称取 10g 壳聚糖粗产品，溶于 200ml1%的乙酸水溶液中，滤去不溶物，搅拌下 向滤液中滴加 5%的氢氧化钠溶液， 将产生的沉淀过滤， 滤出物在蒸馏水中浸泡 24h， 然后用 1mol l-1的盐酸调节溶液的 ph 值至中性， 过滤后用蒸馏水充分洗涤， 再把滤 出物于丙酮溶液中浸泡 48h，过滤，零下 20冷冻 24h，50下干燥至恒重。 1.3.2 壳聚糖的活化壳聚糖的活化 精密称取 2.0g 壳聚糖粉，加入 25ml0.3%的戊二醛溶液，室温下搅拌 3h 后，于 4 下放置过夜；次日抽滤，并用 50ml 磷酸盐缓冲液洗涤，得到淡黄色活化的壳聚糖 粉末。室温干燥至恒重。 1.3.3 固定化酶制备 固定化酶制备 精密称取 0.5g 活化后的壳聚糖粉末，加入 10ml 超氧化物歧化酶液，室温下搅拌 1.5h，于 4下放置过夜；次日，首先吸取少量上清液保存在 4测定溶液中剩余酶 活力，然后将余下的混合物抽滤，并用 50ml 磷酸盐缓冲液分 5 次洗涤抽滤，将滤饼 取出，即得到固定化 sod 酶粉，放置于 4冰箱保存待用。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 1.3.4 酶活力的测定方法比较酶活力的测定方法比较 本章采用以维生素 c 为终止剂的改进型邻苯三酚自氧化法测定酶活力，与传统 的邻苯三酚自氧化法相比，这种方法有很大的优势。 经典邻苯三酚自氧化法：在试管中加入 tris-hcl 缓冲液 9ml，于 25恒温水浴 中放置 20min，用微量加样器加入 2545mmol/l 邻苯三酚溶液 10l，立即混匀， 取适量倒入比色皿中，以 tris-hcl 缓冲液为空白对照，在 325nm 波长处测吸光度， 每隔 30s 测定一次，共 6 次，计算每分钟自氧化率。 改进的邻苯三酚自氧化法：与经典法基本相同，整个自氧化反应在 25水浴中 进行，邻苯三酚自氧化准确反应 3min 时，迅速加 5%vit-c 溶液 1 滴（约 50l） ，立 即混匀， 室温下分别于 5min， 10min， 20min， 30min， 40min， 50min， 60min 时在 325nm 处测定吸光度， （若 1 小时内吸光度无变化，则证明反应已终止） ，并计算 3min 内的 每分钟自氧化率。 1.3.5 酶活力测定酶活力测定 溶液酶活力测定： 取三支带刻度离心管， 将溶液酶加入 tris-hcl 缓冲液(ph8.02) 中预热 10min 后，加入邻苯三酚，准确反应 3min 后加入终止剂 5%维生素 c，室温放 置 5min 后测 a325。按表 1 进行加样。以 1 号管溶液为空白，2 号管未加酶，3 号管为 酶管，测定各管的 a325。 表 1 溶液酶活力测定实验加样方法 离心管编号 1 2 3 tris-hcl 缓冲液 9 ml 9 ml 9 ml sod 溶液酶 0 0 20l 45mmol/l 邻苯三酚 0 10l 10l 5% 维生素 c 50l 50l 50l 固定化酶活力测定： 取三支带刻度离心管，将固定化酶加入 tris-hcl 缓冲液(ph8.02)中预热 10min 后，加入邻苯三酚，准确反应 3min 后加入终止剂 5%维生素 c，室温放置 5min 后测 a325。加入终止剂后在室温下放置数分钟，进行离心操作（10000r/min） ，离心 10min 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 后，吸取上清液。以 1 号管溶液为空白，在 325nm 处测吸光度 a。 表 2 固定化酶活力测定实验加样方法 离心管编号 1 2 3 tris-hcl 缓冲液 9ml 9ml 9ml 对照 0 10mg 0 固定化酶 0 0 10mg 邻苯三酚 0 10l 10l 维生素 c 50l 50l 50l 在规定条件下，1ml 反应液中，每分钟使溶液在 325nm 处吸光度减小一半（即 使邻苯三酚自氧化抑制率达 50%）的酶量定义为 1 个酶活力单位。 固定化酶的活力（u g-1）是指每克载体所具备的活力。 溶液酶的活力是指每毫升原酶液所具备的活力。 固定化酶的活力回收，是指以溶液酶活力为 100%，同样蛋白量的酶固定在载 体上之后所显示的活力之比。 1.4 实验结果实验结果 1.4.1 固定化反应固定化反应 ph 值对固定化酶活力的影响值对固定化酶活力的影响 取 6 组等量的用 0.3%戊二醛活化的壳聚糖载体， 分别置于用 ph 为 5.8、 6.0、 6.4、 6.8、7.2、7.6 的磷酸盐缓冲溶液稀释成蛋白质含量为 100 ug ml-1的酶液中，搅拌 1.5 小时，并在 4放置 24h 后，用 4磷酸盐缓冲溶液洗净未结合的酶，抽干，测定活 力。结果如图 2-1 所示，当 ph=6.0 时，固定化酶活力达到最大值。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 12 fig. 1-1 effect of different ph of immobilized reaction on the activity of chitosan bound sod of 0.3% glutaraldehyde activated matrix was respectively incubated with sod at different ph (5.8-7.6) and 4 for 24h. 1.4.2 固定化反应戊二醛浓度对固定化酶活力的影响固定化反应戊二醛浓度对固定化酶活力的影响 取 5 组等量的壳聚糖在 ph7.2,分别用浓度为 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、 0.6%、0.7%、0.8%的戊二醛溶液（v/v）在 25活化 3h，活化后的 5 组载体再分别置 于 ph=6.0,蛋白质含量为 100ug ml-1的酶液中，4放置 24h 后，用 4磷酸盐缓冲溶 液洗净未结合的酶，抽干，测定活力。结果如图 2-2 所示，当戊二醛浓度为 0.3%时， 所制备的固定化酶活力达到最高，低于或高于此浓度，都会降低固定化酶的活力。 fig. 1-2 influence of glutaraldehyde concentration on the activity 。matrix was separately activated with varying concentrations of glutaraldehyde (0.1-0.8%v/v) at ph 7.2, 25 for 3h .coupling of sod to the activated matrix was carried out by incubating the enzyme with the activated matrix at ph 6.0 and 4 for 24h. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 13 1.4.3 固定化给酶量对固定化酶活力的影响固定化给酶量对固定化酶活力的影响 取 5 组等量的用 0.3%戊二醛活化的壳聚糖， 分别置于蛋白质含量为 45、 63、 81、 99、117 ug ml-1的酶液中，4放置 24h 后，用 4磷酸盐缓冲溶液洗净未结合的酶， 抽干，测定活力。结果如图 2-3 所示，固定化酶活力随着固定化反应给酶量的升高增 势渐缓，当给酶量达到约 0.81mg ml-1时，酶活力趋于平稳。 fig. 1-3 effect of the amount of enzyme loaded on the activity of chitosan bound sod. of 0.3% (v/v)glutaradehyde activated matrix was seperately incubated with varying amounts of the enzyme 45ug-117ug at ph 6.0 and 4 for 24h. 1.4.4 活力回收活力回收 取戊二醛活化的壳聚糖载体 100mg，与 1694u（1ml）的超氧化物歧化酶溶液进 行固定化反应制备固定化超氧化物歧化酶，测得反应后的残液的活力为 1656u，由 此推算出固定在壳聚糖载体上的固定化酶的活力在理论上应该等于溶液酶的活力与 残液的活力之差，即 1694-1656=38u。但是实际测定的固定化酶的活力为 0.33u/mg， 所以固定化超氧化物歧化酶的活力回收等于 86.32% （实际活力与理论活力之比） ， 如 表 3 所示： 表 3 固定化酶活力和回收率 溶液酶 固定化上清液固定化酶 ao0.1020.1500.096 as0.0060.0120.060 抑制率 94.12% 92% 36.46% 酶活力 1694u/ml 1656u/ml 0.33u/mg 酶活回收率 / / 86.32% 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 1.5 酶活性测定的方法比较结果 1.5.1 经典邻苯三酚自氧化法实验结果 酶活性测定的方法比较结果 1.5.1 经典邻苯三酚自氧化法实验结果 在试管中加入 tris-hcl 缓冲液 9ml，于 25恒温水浴中放置 20min，用微量加 样器加入 2545mmol/l 邻苯三酚溶液 10l，立即混匀，取适量倒入比色皿中，以 tris-hcl 缓冲液为空白对照，在 325nm 波长处测吸光度，每隔 30s 测定一次，共 6 次 ， 计 算 每 分 钟 自 氧 化 率 。 求 得 线 性 方 程 ： y=0.0352x-0.0136 (r 2=0.9935),邻苯三酚每分钟自氧化率=0.035。 fig. 1-4 traditional method of pyrogallol autoxidation, testing a325 every 30 seconds and the rate of autoxidation is 0.035 with r2=0.9935 1.5.2 改进的邻苯三酚自氧化法实验结果 1.5.2 改进的邻苯三酚自氧化法实验结果 邻苯三酚每分钟自氧化率=0.031 由图可以看出，邻苯三酚的自氧化随时间呈线 性变化，其每分钟自氧化率在测定时间内（3min）为一定值。实验结果显示，经典 邻苯三酚法和用终止剂改进法每分钟自氧化率相近，且改进的邻苯三酚法在 325nm 处的吸光度 1h 内保持不变，故待测品可在 1h 内保留待测，即可同时测定多个样品。 终止剂改进法为固定化酶活力的测定提供了一种结果准确且操作可行的方法。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 fig. 1-5 a325 testing of pyrogallol autoxidation rate when using vitmin c as a terminate agent keep stable in 1 hour being 0.031 while 0.035 of the traditional one.it make testing several examples at the same time be available. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 第二章 固定化酶性质研究 第二章 固定化酶性质研究 2.1 固定化酶的最佳反应固定化酶的最佳反应 ph 值值 分别配制 ph 为 2，4，6，8，10，13 的 tris-hcl 缓冲溶液，再以之分别配制底 物溶液。取 6 组溶液酶与 6 组固定化酶，分别加入上述不同 ph 的底物溶液测定其活 力。缩小最佳 ph 值范围至 58 之间。 再分别配制 ph 为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的 tris-hcl 缓冲溶液，再 以之分别配制底物溶液。取 7 组溶液酶与 7 组固定化酶，分别加入上述不同 ph 的底 物溶液测定其活力。结果如图所示，固定化酶与溶液酶的最佳反应 ph 值均为 6.0。 fig. 2-1 effect of ph in enzyme assays on the activity of original enzyme solution (100ug ml-1) and approximately 10mg immobilized enzyme were incubated at different ph (2.0-13.0) and 25. the other parameters were as same as those in enzyme assays. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 17 fig. 2-2 effect of ph in enzyme assays on the activity of original enzyme solution (100ugml-1) and approximately 10mg immobilized enzyme were incubated at different ph (5.0-8.0) and 25. the other parameters were as same as those in enzyme assays. 2.2 固定化酶的最佳反应温度固定化酶的最佳反应温度 取 5 组酶液和 5 组固定化酶，分别在 25、35、45、55、65、85下，测定溶液 酶和固定化酶的活力。结果如图所示，溶液酶的最适温度是 25，超氧化物歧化酶 固定在壳聚糖上后，最适温度发生改变，升高到 45。但在反应温度为 45时，溶 液酶活力略有下降，而固定化酶仍有较高活力。 fig. 2.3 effect of temperature in enzyme assays on the activity of soluble and immobilized sod original enzyme solution and immobilized enzyme were incubated at different temperature (25-85) and ph 8.23. the other parameters were as same as those in enzyme assays. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 18 2.3 较高温度对固定化酶活力的影响较高温度对固定化酶活力的影响 在 85条件下，取 4 组酶液与 4 组固定化酶分别加入到 ph8.23 的 85水浴恒 温的 tris-hcl 缓冲液中，在 40、80、120min 分别取样，冷确，再于 25测定其活 力，结果如图 2-6 所示，随温育温度的升高，溶液酶的剩余活力均有所下降，但是与 溶液酶相比，固定化酶的热稳定性增加，在 120min 时，溶液酶几乎全部失活，而固 定化酶仍有较高的活力。 fig. 2.4 effect of high temperature (85) in enzyme assays on the activity of soluble and immobilized sod ，original enzyme solution and immobilized enzyme were incubated at different time and ph 8.23. the other parameters were as same as those in enzyme assays. 2.4 溶液酶和固定化酶的稳定性溶液酶和固定化酶的稳定性 将固定化酶与溶液酶分别置于室温条件下保存，隔天取样，测定二者的活力变 化。以初始活力为 1 作图，显示溶液酶随着保存天数的增加，酶活力有明显的下降 趋势，到第五天时，其活力不足原活力的 10%，而固定化酶的贮存表现良好，在五 天内活力维持在 90%以上。随着进一步的实验，发现固定化酶在 40 天后的活力仍然 保持在 50%以上。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 19 fig. 2.5 the stability of storage of original enzyme solution and immobilized enzyme at home temperature (25), the immobilized enzyme has a much longer life than that of original enzyme. 2.5 固定化酶的半衰期固定化酶的半衰期 将新制备的固定化酶贮于 4下，每隔一天测其活力变化，结果如图 2.5 所示。 分别以第 1 天与第 3 天，第 3 天与第 5 天所得活力值代入下式计算半衰期24。 t1/2 0.693 2.303 lg t e0 e 式中 t1/2为半衰期（即固定化酶活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时 间，单位 h） ，e0为原始酶活力，t为时间 h, e 为t时的酶活力，最后将所得t1/2求平 均值，计算得该固定化酶的半衰期为 43.8d。 2.6 酶在强酸碱条件下的稳定性酶在强酸碱条件下的稳定性 分别 6 组取一定量的固定化酶与溶液酶，放置到 ph 为 2 的酸性缓冲液中和 ph 值为 13 的强碱性缓冲液中，分别于 40min，80min,120min 取样，加入到 ph 为 8.23 的缓冲液中按测活力方法测定当时酶活力，ph2 条件下，固定化酶在一个小时内活 力仍然保持在 50%以上，而溶液酶在 40 分钟时活力已经下降到原来的 30%不足。随 着时间的推移，固定化酶这种稳定性优势体现的更加明显。 在 ph13 条件下，固定化酶的稳定性仍然大大强于溶液酶，在 40min 时，溶液酶 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 20 的活力急剧下降到原来的 10%左右，大部分活力均丧失；而固定化酶的耐碱性明显 强于溶液酶，在 80min 时，固定化酶的活力保持在 60%以上。 fig. 2.6 the activitys of the original enzyme solution and immobilized enzyme in ph2 condition at 40th, 80th, 120th minute, it shows the immobilized enzyme has a better stability than the original enzyme solution. fig. 2.7 the activitys of the original enzyme solution and immobilized enzyme in ph13 condition at 40th, 80th, 120th minute, it shows the immobilized enzyme has a better stability than the original enzyme solution. 2 .7 重复使用对固定化酶活力的影响重复使用对固定化酶活力的影响 如图 2-7 所示，固定化酶被重复使用了 4 次。每次使用后，都要用 tirs-hcl 缓冲 溶液 （ph=8.2） 充分洗涤固定化酶以洗除底物和产物， 然后冷至 4， 以备下次使用。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 21 溶液酶无法进行有效的分离回收，而固定化酶显示一定的重复使用性，随着使用次 数的增加，活力逐渐降低，在第 3 次以后仍保留近 50%的活力。固定化酶的一次、 二次回收率较高,经过固定化的酶实现重复使用性，提高了酶的使用价值。 表 4 固定化酶