（植物病理学专业论文）芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析.pdf

出券农照丈攀颟士学位论文 攘簧 薨菁裁啼瘸邂( t u m v ) 怒植物瘸毒中凝大的瘸马铃罄￥癜毒羼 的个重要成员。在墩褥范羽内广泛分布，能役凝4 3 辩、1 5 6 属i ；冬3 0 0 多种植携，其炎豢仅次予黄瓜兹时瘸毒( c m v ) 。零礤嶷分离熊忧了楚蔫 兹时痣毒豹由衣分离貔，对芟生物学、盘潺学、缨臆痍壤学和粒子形态学 特，镬进褥了疆突。裁鼷瓣一p c r 方法竞隆了t u m v 滋寒分离溺戆羚竞虽弱 物，分剐禽名为t u m v s d i 、t u m v s 酶、t u m v - s d 3 、t u m v s d 4 、 t u m v - s d l 鞠飘m u s 玩。毒主反应特憔褒明，t u m v s d 卜6 黪l 受染3 辩 l o 秘植物，t u m v s d l 在寄囊绷骢内形成强轮状内食钵，孙党爨自为3 缝分，分予量分裂先4 5 k d 、3 8 k d 帮1 4 k d , 撼楚鲮病毒牧体为汝线条弑。 箨岁 摭矬测定表骥；t u m v - s d l 嗡稀释隈患菇1 ：3 5 0 0 4 0 0 0 ，体岁 存活 期海9 6 夺瓣，失毒键镪滏度烫弱6 0 。 2 威用改避貔茏饕花婶瘸毒翁挺取方法获瘸时中瓣取瘸辫筏体，应溺虽 自酶k 法献病毒簸捧牵撵取瘸毒刑a 藻困缀，根嚣已报邋豹t u m v 酌e p 鏊阂序捌，设量 弗合成7 一对幸謦霉零l 物，利用r t - p c r 法嶷隆了6 个分离 物静静壳蛋自基鞠，与巍隆载体p u c l 9 连羧后遁避热激法转化大肠拇薄 o h 5 往。垮猁测定缕莱袭明；翔m v s 轨6 躲e p 蘩暇均海8 6 7 个溅基，编 码2 8 9 个懿基酸。将测定序列递交g e n b a n k ，登荣号势嬲为a f 5 3 9 4 0 7 、 f 5 3 9 4 0 8 、躲5 3 譬4 圆、a f 5 3 9 4 1 0 、a f 5 3 9 4 1l 、a f 5 3 9 4 1 2 。掰褥令分褒物 懿醪基嚣蠡孽核蝥黢彦捌麓深拣较褰，在9 7 然9 9 + 鬟之阗，系统遴纯分 耩表褥：窀稻与b r a s m c a ( b ) 致病瑟分离耪巾的w o d d - bt i t 分离物髂鞫源 毪缀勰( 9 1 ，豁l o 麟) ，亲缀获系最避。献褥麸分子隶平上将t u m v 由东 分离物划分为w o r l d b 缀：y 荧键溺：茏篝筏畦病毒疼蒸嚣壳陵旁残分橱 芜荐藐卧病毒垂东分离耪井壳骚鑫基因的尧隆和滓剜势耩 a b s t r a c t t u r n i pm o s a i cv i r u s ( t u m v ) i sam e m b e ro ft h ep o t y v i r u sg e n u s i t o c c u r sw o r l d w i d ea n dc a ni n f e c tm o r et h a n3 0 0s p e c i e si n15 6g e n e r ao f 4 3 p l a n tf a m i l i e s 。i tw a sf o u n d t ob eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n t ( o n l ys e c o n dt o c u c u m b e rm o s a i cv i r u s ) i nt h i sr e s e a r c h ，t h ei s o l a t e so f t u m vf r o ms h a n d o n g w e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e d t h e i rb i o l o g i c a l ，s e r o l o g i c a l ，c y t o p a t h o l o g i c a l a n dp a r t i c l em o r p h o l o g i c a l p r o p e r t i e sw e r e s t u d i e d r t - p c rw a su s e dt oc l o n e t h ec o a t p r o t e i n c 玲g e n e so f t n m v - s d t 。6 。m e a n w h i l e ，t h e s e s i xc o a tp r o t e i n g e n e sw e r es e q u e n c e da n dc o m p a r e dw i t ho t h e rh o m o l o g o u ss e q u e n c e si n g e n b a n k t h es t r a i nd e s i g n a t i o no ft h es i xi s o l a t e so ft u m vw a sf i n a l l y d e t e r m i n e d t h er e s u l t sa r ea st h ef o l l o w i n g ： 1 s i xi s o l a t e so ft u r n i pm o s a i cv i r u sn a m e dt u m v s d i t u m v s d 2 t u m v - s d 3t u m v - s d 4 , t u m v s d 5 a n d t u m v s d 6 w e r e r e s p e c t i v e l y a c q u i r e df r o mi n f e c t e dc h i n e s ec a b b a g e sa n dr a d i s h e s i n3c i t i e s ( t a i a n ， y a n t a ia n dz a o z h u a n g ) o fs h a n d o n gp r o v i n c e d i f f e r e n t s 括r e s p o n s e s u g g e s t e dt h a tt l l m v - s d tc o u l di n f e c tp l a n t so f10s p e c i e si n 3f a m i l i e s 羹l m v * s d if o r m e dp i n e - w h e e li n c l u s i o nb o d i e si np l a n tc e l l s t h ec o a tp r o t e i n o ft h e 酬v s d lc o n t a i n s3c o m p o n e n t sw h o s ee s t i m a t e dm o l e c u l a rw e t g h t a l e4 5 k d 3 8 k da n d1 4 k d r e s p e c t i v e l y 髓ev i r o n s a r ef i l a m e n t - l i k ep a r t i c l e n v i t r or e s i s t a n c et e s t ss h o w e dt h a tt h ed i l u t i o ne n dp o i n ti sl ：3 5 0 0 4 0 0 0 , t h e i o n g e v i t yw a s 9 6h o u r sa n dt h ei n a e t i v a t i o nt e m p e r a t u r ei s5 5 6 0 2 a nu p d a t 茈m e t h o dw a s e m p l o y e d t op u r i f yt u m vi nt h i sr e s e a r c h + u s i n g t h ep r o t e a s ek m e t h o d ，w ea c q u i r e dt h ev i r a lg e n o m e - r n a ap a i ro f s p e c i f i cp r i m e r sw a sd e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d b a s e do nt h en u c l e o t i d e s e q u e n c e s o ft u m vc o a tp r o t e i ng e n e s r e p o r t e db e f o r ea n dr t * p c r w a su s e d t oc l o n et h ec pg e n e so ft h es i xt u m vi s o l a t e s 确ep c r p r o d u c tw a st h e n c l o n e di n t op u c l 9v e c t o r , w h i c hw a su s e dt ot r a n s f o r me c o l td h 5 a t h r o u g h h e a ts h o c k s e q u e n c ea n a l y s i ss h e l w e dt h a tt h ec pg e n e so ft u m v s d i ，6 i n c l u d e d8 6 7 b pa n de n c o d e d2 8 9a m i n oa c i d s 。弧es e q u e n c e sw e r es u b m i t t e d t og e n b a n ka n dt h ea c c e s s i o nn u m b e rw e r ea f 5 3 9 4 0 7 。a f 5 3 9 4 0 8 ，a f 5 3 9 4 0 9 ， 山东农业大学硕士学位论文 a f 5 3 9 4 1 0 ，a n da f 5 3 9 4 1l a n da f 5 3 9 4 1 2r e s p e c t i v e l y t h e s es i x s e q u e n c e s h a dah i g hh o m o l o g yt oe a c ho t h e r , w h i c hw a sb e t w e e n9 7 a n d 9 9 4 ，t h e y s h a r e dt h e h i g h e s th o m o l o g yt o w o r l d b g r o u pi s o l a t e s i nb r a s s i c a ( b ) p a t h o t y p e ( b e t w e e n9 1 8 a n dl o o ) p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do nt h ec p g e n es e q u e n c e so ft u m vs t r a i n so ri s o l a t e ss h o w e dt h a tt h e s e6t u m v i s o l a t e sf r o m s h a n d o n gb e l o n g e dt o w o r l d b g r o u p y s o 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：趁孑笔 导师签名：崖芳f 易 荛篝花辞病毒出东分离耱箨壳摄岛基因豹竞窿和痔硝势辑 英文缩珞表 壤写耱号英文名 r n ai n h i b i t o r a i pa l k a l i n ep h o s p h a t a s e a l m va l f a i r am o s a i cv i r u s a m pa m p i c i l l i n b s ab o v i n es e r u ma l b u m e n c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a c i c y l i n d r i c a li n c l u s i o n c i p c y l i n d r i c a li n c l u s i o np r o t e i n e m vc u c u m b g rm o s a i cv i r u s c pc o a tp r o t e i n d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i sd e f e c t i v e i n t e r f e r i n gm o l e c u l a r s d n t p d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 孵d i t h i o t h r e i t o l e be t h i d i u mb r o m i d e e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d e l i s a e n z y m el i n k e dl m m u n o s o r b e n ta s s a y g m c g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p s h c - p r o h e l p e rc o m p o n e n tp r o t e a s e h d g s h o m o l o g y - d e p e n d e n tg e n es i l e n c i n g i si n t e rs e q u e n c e k bk i l o b a s e k d ak i l o d a l t o n k m k a n a m y c i n k m k a n a m y c i nr e s i s t a n c e l bl u d a - b c r t a n im e d i u m m a b sm o n o c l o n a la n t i b o d i e s 串文名 r n a 酶抑制剂 碱性磷酸酶 苜嵇花n l + 病毒 氨苄青霉素 牛搬清白蛋自 互补d n a 墓疆敬海含体虽爨 圆 主状内含体蛋白 黄瓜花# 瘸毒 外巍蛋白 焦碳酸二己脂 缺陷于扰分予 脱氧核糖梭苷三磷酸 二虢苏糖簿 溴化己锭 乙二胺西己酸 酶联免疫检测 转基因作物 糍助成分，赞是酶 同源依赖的基因沉默 翔箍痔捌 千碱基 千邋尔顿 卡那霉素 卡那霉素抗性 l b 壤葬基 单克隆抗体 山东农业大学硕士学位论文 m o p s m p m r n a m s o l t f p g e p a p p 8 p b s p c r p d r p 嚣g p e p m o v p l r v p p v p r p s b m v p t g s p v y r d r p r i p r m v r r p m 娃p e r s a s s d s s s c p t e m e d t e v 3 一( n - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d e m o v e m e n tp r o t e i n m e s s a g e r n a m u r a s h i g e a n d s k o o gm e d i u m o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o k e w e e d a n t i v i r a lp r o t e i n p h o s p h a t eb u f f e r p h o s p h a t e - b u f f e r e d s 0 1 i o n p l o y m e m s e c h a i nr e a c t i o n p a t h o g e n - d e r i v e dr e s i s t a n c e p o l y e t h y l e n eg l y c o l p e p e r m o t t l ev i r e s p o t a t ol e a f r o l lv i r u s p l u mp o xv i r u s p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n p e as e e d - h o m em o s a i cv i r u s p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g p o t a t o v i r u sy r n a - - d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e r i b o s o m e - i n a c t i v a t i o np r o t e i n r n a m e d i a t e dv i r u sr e s i s t a n c e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np c r s y s t e m i ca c q u i r e ds i l e n c i n g s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e s i n g l es t r a n dc o n f i g u r a t i o np o l y m o r p h i s m n n n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e t o b a c c oe t c hp o t y v i r u s 3 ( n 一吗啉代) 冈磺酸 移动蛋自 信使r n a m s 培养基 辩援阅读框架 聚丙烯酰胺凝胶电泳 裔陆抗病毒蛋白 磷酸缓冲液 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反疯 病原来源的抗性 聚乙二醇 胡椒斑驳病毒 马铃薯卷叶病毒 牵痘病毒 病程相关蛋白 魏豆秘搀花h l 瘸毒 转录后基因沉默 马铃薯v 病毒 依赖于r n a 的r n a 聚台酶 核糖体炎活蛋南 r n a 夯罨靛瘸毒抗牲 转，分 爱转录p c r 系统获得性的蒸因沉默 十二靛嫠硫酸铺 单链构型多态性 n n ，n 一- 四甲基乙二二麟 烟草蚀绞病毒 芜菁筏静病毒出东分离耪井壳螯自基困的克隧和序列分析 下g s t m v t r v r v m v v p g y e p t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g t o b a c c om o s a i cv i r u s t o b a c c or a r l ev i r u s t o b a c c ov e i nm o t t l ev i r u s g e n o m el i n k e dp r o t e i n y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u m 转蒙基因沉默 烟草花叶病毒 烟草脆裂病毒 烟革驶斑驳病毒 基因组相关蛋白 y e p 培莽基 山东农业大学硕士学位论文 芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析 1 引言 芜菁花叶病毒是植物病毒中最大的属马铃薯y 病毒属的一个重 要成员( m u r p h y e a e t a l ，1 9 9 5 ) 。在世界范围内广泛分布。能侵染4 3 科， 1 5 6 个属的3 1 8 种植物( e d w a r d s o n e ta l 。1 9 9 1 ) 。自然条件下侵染十字花科作 物，包括花椰菜、嫩茎花椰菜、卷心菜、布鲁塞尔甘蓝、大白菜、油菜和 芜菁，其他园艺作物如洋蓟、豌豆、大黄根、菊苣和莴苣，观赏植物如s t o c k s 和w a l lf l o w e r s 以及1 4 个科的多种杂草植物( s h a t t u c kv i ，1 9 9 2 ) 。每年由该 病毒的侵染造成显著的经济损失，国内外学者都对它进行了大量的研究， 对其研究越来越多，越来越深入。对于芜菁花叶病毒株系的划分历来无统 一的划分标准，但应用较多的是利用该病毒在鉴别寄主植物上的表现而将 其划分为不同株系，近年来随着对其研究的深入，对株系的划分已发展到 分子水平，如利用单克隆抗体比较某些抗原决定簇的差异、利用地高辛标 记的探针进行分子杂交( 邓晓东等，1 9 9 7 ) 等；芜菁花叶病毒的基因组结构 与其他马铃薯丫病毒成员一样，为单一的阅读框架( o p e nr e a d i n g f r a m e ) ， 可表达产生一个约3 6 0 k d 的多肽前体。其基因表达的策略及表达产物在 病毒的侵染、传播、及症状表达中起不同的作用。这些分子水平上的研究 结果必将有利于人们深入了解植物对病毒抗性的机制，最终用于病毒病害 的防治中去。 1 1 芜菁花叶病毒的株系分化及其分子生物学研究进展 1 1 1 芜菁花叶病毒的株系分化研究 自1 9 3 5 年h o g g a n 和j o h n s o 首次涉入t u m v 株系分化以来，国内外 有不少学者先后采用了不同的方法划分t u m v 株系。 我国自5 0 年代以来先后有李德褒( 1 9 6 4 ) 和王拱辰( 1 9 7 4 ) 对浙江 省油菜上t u m v 进行株系鉴定，根据其是否侵染心叶烟而区分为两株系。 魏景超等( 1 9 5 8 ) 对华东油菜和十字花科蔬菜的t u m v 进行鉴定，其分 离物在普通烟上均表现枯斑，而根据其是否侵染早生朝鲜油菜品种而区分 为两个株系：此外，裘维蕃( 1 9 5 7 、1 9 6 3 ) 将河北和京津地区大白菜等十 芜瞢花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析 字花科蔬菜的t u m v 区分为k 1 1 、k 1 2 、k 1 3 和k 1 4 等四个株系，主要 依据其是否侵染心叶烟和普通烟；范怀忠等( 1 9 5 7 ) 对广州十字花科蔬菜 上的t u m v 鉴定为芜菁花叶病毒株系和油菜毒系，前者侵染普通烟和心 叶烟，后者均不侵染；姚文岳等( 1 9 8 4 ) 也采用范怀忠的方法对上海白菜 的t u m v 进行鉴定，也有两个株系。 国外，也先后有很多学者根据不同标准对t u m v 进行株系划分，直 到1 9 8 0 年p r o v v i d e n t i 应用从日本和中国得到的大量的大白菜栽培品种， 进行了t u m v 与品种间关系的研究，获得了很大成功。他发现：大白菜 对t u m v 的抗性具有株系特异性，一些品系或品种携带有独立的、显性 遗传的抗t u m v 基因，并从中筛选出具有株系特异性的4 个大白菜栽培 品种：p 1 4 1 8 9 5 7 、p 1 4 1 9 1 0 5 、t r o p i c a ld e l i g h t 、c r u s a d e r ，将美国纽约州大 白菜、芜菁上的t u m v 划分为4 个株系，即t u m vc l 、c 2 、c 3 、c 4 株 系( 表1 1 ) 。g r e e n ( 1 9 8 5 ) 用同样方法对台湾十字花科蔬菜的t u m v 进 行株系鉴定，除确定了c 1 c 4 株系在台湾存在外，还发现了另一株系， 即c 5 株系( 表卜2 ) 。 表1 - 1p r o w i d e n t i 的划分株系方法 t a b l e l - 1p r o v v i d e n t s t r a i nd i f r e r e n t i a lm e t h o d 表i - 2g r e e n 的划分株系方法 t a b l e l - 2g r e e n s t r a i nd i i r e r e n t i a lm e t h o d 山东农业大学硕士学位论文 注：接种叶症状，非接种叶症状：o ：无症：l ：潜隐侵染( 无症带毒) ；v e ：明 脉；d i s ：畸形；m ：花叶；c h ：褪绿斑；n ：浅褐或黄色枯斑；h 免疫( 无症不带 毒) ：r ：抗病；s ：感病 n o t e s ：s y m p t o mo f i n o c u l a t e dl e a f s y m p t o m o f n o n i n o c u l a t e dl e a f , o ：n os y m p t o m ；l ： l a t e n ti n f e c t i o n ；v e ：b r i g h tv e i n ；d i s ：d i s t o r t i o n ；m ：m o s a i c ；c h ：c h l o r o s i s ；n ：n e c r o t i cs p o t ； l ：i m m u n i t y ( n os y m p t o m s a n dn o v i r u s ) ；r ：r e s i s t a n c e ；s ：s u s c e p t i b l e 从表1 1 和1 2 中看出：c 5 株系致病力最强，其余依次为c 4 、c 2 、 c 3 、c l 株系。沿用p r o v v i d e n t i 和g r e e n 的株系划分方法刘栩平等( 1 9 8 6 ) 对我国十省( 市) 7 ，9 8 2 份病样中筛选出的1 9 个t u m v 主流分离物进行 株系鉴定。结果表明：有1 个分离物属c 1 株系，6 个分离物属c 4 株系 7 个分离物属c 5 株系，未检出c 2 和c 3 株系，其余5 个不能按g r e e n 的 标准归类，暂分别定为c 3 2 和c 6 株系，c 4 株系占3 1 5 8 ，c 5 株系占 3 6 8 4 ，c l 株系占5 2 6 ，c 3 2 株系占2 1 0 5 ，c 6 株系占5 2 6 ，从 1 9 个分离物的地理来源来看，以c 4 和c 5 株系在我国的分布最广，包括 北京、河北、江苏、上海、广东、四川、辽宁和黑龙江等9 个省( 市) 。 同时刘栩平等人研究还发现t u m v 在心叶烟上的症状反应存在着随接种 苗龄及培养温度不同而发生变化的情况。接种叶片带毒的，在一定温度下 可以不表现症状，当温度有所变化时，又可以表现出轻微症状来。因此他 们认为：以症状反应特性作为决定寄主的抗、感属性是不能反映株系特性 的，也与生产实际情况不符。用做鉴别寄主的4 个大白菜品种中，p 1 4 1 8 9 5 7 的症状反应对温度的变化过于敏感，也将造成株系判定上的困难或差误。 另外，还发现：隶属于同一株系的各个分离物对大白菜或其它十字花科蔬 菜甚至是同一个品种的致病力往往有较大差异。依据g r e e n 推荐的4 个大 白菜品种作为t u m v 株系鉴别寄主谱，对我国辽阔地域内的大量十字花 芜瞢花时扁毒山东分离物外壳馕白萋捌的克窿和序列分析 科蔬菜来说，尚滚反殃箕实际上的区剐或实质上的差异。因此鍪于我国十 字花科蔬菜资源十公丰蛮，栽壤地域广阔，生态地联差异驻著的实际壤况， 他们用生物学标准，即致病力分化的蔗异对t u m v 株系箍定研究提出了 毅的方法。按照他们援定戆抗性分类标难葶鞋各分离携豹痰状特缝，将1 9 个分离物归为7 类。即7 个株系，根据各株系对十字花科不同种类蔬菜致 痍力戆专纯经，分翻会袋必：罄逶撩系( 强1 ) 、夺自菜( 不结球是菜) 撩 系( t u 2 ) 、海洋白菜株系( t u 3 ) 、大陆白菜株系( t u 4 ) 、甘蓝株系( t u 5 ) 、 花椰菜株系( h 6 ) 和荛箐株系( t u 7 ) ，通过广泛酌寄主反应试验，选出 了一套对各分离物有一定特异性可资利用的鉴别寄主谱( 实验结果见袁 1 3 ) 。以上株系的归类，可以葳映不同株系对相应十字花科蔬菜县有强或 较强致病力的特燃。由于划分为同一株系驰分离物农毒主遴上的毒主反应 差异较大，所以刘栩平等人认为从某种意义上称为株系群更科学。 表1 4 支栩平等瓣划势撵系方法 t a b l e l 一3l i ux u - p i n ge ta l s t r a i nd i f f e r e n t i a lm e t h o d 洼：l ( 免疫l 冤疫不带毒 戳抗病) ：蠢症一n ll 病祷指数) ；联耐病) ：ll 。1 2 2 5 0 0 ； s ( 感瘸) ：2 5 1 0 以上；系秦囱l 号对冀1 分离物的反应 n o t e s ：l ( i m m u n i t y ) ：n os y m p t o m sa n dn ov i r u s ；r ( r e s i s t a n c e ) ：n os y m p t o m s - 1 i l ( d i s e a s e i n d e x ) ；t ( t o l e r a n c e ) ：1 1 1 2 - 2 5 0 0 ；s ( s u s c e p t i b l e ) ：m o r et h a n2 5 1 0 ；+ ：r e a c t i o no f q i n g b a in o 1 t oj i i i s o l a t e 继p r o v v i d e n t i , g r e e n 的划分方法之嚣，李藤丽( 1 9 8 9 ) 、冯兰蠢( 1 9 9 0 ) 4 出束农业丈学疆士学控论文 等都沿明了北方法对t u m v 豹栋系进行划分，其中李瑟飘等期p r o w i d e n t i 的一套艇定品种，并用酶联免疫吸附测定( e l i s a ) 敢抗夹心法及衡主范 孺实验，鉴定滋三令不圈糠系，秘t u m v c r i 、t u m v c r 2 、t u m v 。c r 3 为我国油菜上的三个不同株系( 实验结果见表1 4 ) 。 袭l - 毒攀蕤蠡静划势豫系方法 t a b l e l 4l il i i i s t r a i nd i f i e r e n t i a | m e t h o d 注：h 免烧( 无癜不带毒) ：r ：抗病：s ：感瘸 n o t e s ：l ：i m m u n i t y ( n os y m p t o m s a n dn o v i r u s ) ；r ：r e s i s t a n c e ；s ：s u s c e p t i b l e 除j 艺之外，y o s h i i ( 1 9 8 6 ) 穰据t u m v 分离杨的寄主范丽、病瘫和在 世界上嬲分布情况，将t u m v 区分为丽个株系组，即甘蓝株系组和普通 株系组，前者在卷心菜上产生严熏的环状枯斑，在心叶烟上表现为严重的 楚时，其分毒仅双予欢测、美渊秘澳测，在受溯各国来发现；瑟者农以上 两种寄生上只产生轻微症状，并广泛分布于世界各地。王翠花等( 1 9 9 3 ) 利用支| j 撵平等薅选静6 穆鉴掰毒熏纛撩系划分方法，对l 圭l 东大白菜t u m v 6 个分离物进行了株系分化鉴定。黢定结果表明：从山东大白菜主产区采集 并分离获得静t u m v6 个分离物，检索酗类藩t u m v 中的海洋自蘩秣系。 进入8 0 年代以来，随簧分予生物学技术的深入发展，对t u m v 株系 的划分发展到分子水平。v a r v e f lc & c a n d r e s s e ( 1 9 8 8 ) 、曹先继等( 1 9 9 1 ) 、 邸并生等 1 9 9 2 ) 先螽剩用核酸杂交技术对病簿进行拣系划分，邓晓东等 ( 1 9 9 7 ) 用地高辛标记的d n a 探针检测t u m v 并以此为基础进行了 芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析 t u m v 株系的划分。c h o ie s 等( 1 9 9 6 ) 根据3 非翻译区( 3 - u n t r a n s l a t e d r e g i o n ，y - u t r ) 对t u m v 进行分类。叶荣等( 1 9 9 6 ) 用单克隆抗体，结 合e l i s e 、t u m v c p 的酶解图谱、w e s t e r n b l o t 进行抗原结构的区别，为 鉴别分离株提供依据。另外，l i v i as t a v o l o n e ( 1 9 9 8 ) 提出用衣壳蛋白基 因的s s c p ( s i n g l e - s t r a n d c o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ) 来研究t u m v 分离 物的变异性，揭示了一种分离物产生一种特定的s s c p 分布。同时他的这 项研究还表明：即使在一个非常有限的地理区域内，可以有多种t u m v 的变异类型。 1 1 2 芜菁花叶病毒( 1 、i m v ) 的分子生物学 t u m v 分子生物学方面的研究始于七十年代末。1 9 7 8 年，c h o i 等人 改进了提纯方法，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了t u m v 核酸的分子量， 确认了t u m v 核酸为r n a 。在分类上t u m v 属于马铃薯丫病毒属，为正 单链r n a 病毒。基因组结构与其他马铃薯丫病毒( p v y ) 属( 基因组结 构见图1 一1 ) 成员一样，为单一的阅读框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ) ，长约1 0 k b ， 基因组5 末端共价结合基因组连接蛋白( v p g ) ，3 末端含有p o l y ( a ) 尾巴。 它只包含一个开放阅读框架( o r f ) ，进行表达时先翻译成一大的多聚蛋 白，再通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成小的多肽。从多聚蛋白的 n 端到c 端不同基因产物依次为：第一蛋白( p 1 ) ，辅助成分蛋白酶 ( h c p r o ) ，第三蛋白( p 3 ) ，第一个6 k 蛋白( 6 k 1 ) ，圆柱状内含体蛋白 ( c i 蛋白) ，第二个6 k 蛋白( 6 k 2 ) ，核内含体蛋白a ( n i a ) ，核内含体蛋 白b ( n l b ) ，外壳蛋白( c p ) ( r e v e r s fe ta l ，1 9 9 9 ) ( 见图1 - 1 ) 。t u m v 可表 达产生一个约3 6 0 k d 的多肽前体。并通过病毒基因组本身编码的三种蛋 白酶p 1 、h c p r o 和n i a 的加工产生约8 种成熟的蛋白( 徐平等，1 9 9 4 ) 。 d o u g h e r t y 等( 1 9 8 8 ) 研究发现：蛋白酶的切割位点通常是q a ，q g ， 或q s 组成的二肽键。 6 k 16 k 2 v r s _ 吨亚五叵互二巫 回p o l y ( a ) 1 0 k br n a 图1 1 马铃薯y 病毒属基因组结构( f r e d e r i cr e v e r se ta l ，1 9 9 9 ) f i g 1 - 1o r g a n i z a t i o no f t h ep o t y v i r u sg e n o m e 山东农业大学硕士学位论文 1 1 2 1 芜菁花叶病毒( t u m v ) 的衣壳蛋白( c p ) 基因和c p 随着分子生物学的发展，特别是d n a 克隆技术和测序技术的发展， 对于病毒外壳蛋白( c p ) 基因的研究越来越多，也越来越深入。a l l i s o n ( 1 9 9 8 ) 等提出：p o t y v i r u s 病毒属病毒外壳蛋白的主要病毒特异性抗原决 定簇位于n 末端3 0 6 0 个氨基酸。该研究中将t u m v c p 的氨基酸序列 与己知的t e v ( a l l i s o n ，1 9 8 6 ) 和p v y d ( s h u k l a ，1 9 8 6 ) 比较，它们分 别具有5 7 和6 0 的同源性，它们之间的差异主要位于n 末端，而c 端 相当保守。同时将r n a 复制酶的部分氨基酸序列与p v y n ( r o b a g l i a ，1 9 8 9 ) 的羧基端比较，发现有6 2 的同源性，且同源性主要表现在多肽的n 端， 而c 端则同源性较差。之后，t e r m b l a y 等( 1 9 9 0 ) 首先对t u m v 的r n a 序列进行了分析，随后k o n g 等( 1 9 9 0 ) 对t u m v c p 进行了序列分析， 我国，1 9 9 1 年何庆芳等( 1 9 9 1 ) 克隆了t u m v 的c d n a ，i l 令洁等( 1 9 9 2 ) 首次克隆了t u m v 的c p 基因，测定了其核甘酸序列，并构建了植物表达 载体。序列分析结果表明：这一克隆包含1 4 2 9 个碱基( 不包括p o l y a 尾 巴) 的插入片段，从5 3 只有一个连通的阅读框架( o p e n r e a d i n g f r a m e ) ， 根据这一阅读框架。该克隆由1 2 2 0 个碱基的蛋白质编码区和2 0 9 个碱基 的非编码区( n c r ) 组成，最后面是p o l y a 尾巴。确定了c p 的n 末端 在整个氨基酸序列的第1 1 8 位。插入片段的编码区包含完整的外壳蛋白基 因( 8 6 4 b p ) 和部分复制酶( n l b ) 基因( 3 5 3 b p ) ，外壳蛋白5 端没有起始 密码。徐平、许建平等( 1 9 9 4 ) 对t u m v 杭州分离株的c p 基因进行序列 分析。最近的研究表明：转t u m v c p 基因的工程植株一m c d r 蛔”口 b e n t h a m i a n a 的抗t u m v 的抗性机制是一种转录后基因沉默( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l i e n e i n g ，p t g s ) 。f u h - j y nj a n 等( 2 0 0 0 ) 将t s m v 的2 1 8 或l l o 的n 基因区端和全长的c p 基因连在一起，转化n i c o t i a n a b e n t h a m i a n a ，能通过同源依赖性的基因沉默而赋予转基因植物多病毒抗 性。 1 1 2 2t u m v 的核内含体蛋白a ( n i a ) 基因和n l a 蛋白 c a r r i n g t o n ( 1 9 8 7 ) 、d o u g h e r t y ( 1 9 9 1 ) 等先后研究发现了n i a 的多个 水解位点，将t u m v 的6 k - n i a 蛋白的前体物和n i a 蛋白编码区插入 p e t 1 l d 并在大肠杆菌中表达，s d s p a g e 和免疫印迹表明：n i a 蛋白经 芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析 内切蛋白酶解可释放产生一个2 2 k d 的多肽。该多肽经氨基末端氨基酸序 列分析表明与n l a 蛋白的氨基末端一致。定点诱变显示：水解作用与n l a 蛋白的蛋白水解活性有关：蛋白酶识别n i a 的一个氨基酸序列中的谷氨酸 ( g l u ) 。将6 k 蛋白与n i a 蛋白融合能部分抑制n i a 蛋白的水解活性。 另外，由3 8 6 3 个氨基酸组成的多聚蛋白中有7 个n i a p r o 识别的水 解位点，它们的序列与马铃薯y 病毒属的n i a - p r o 水解序列一致( 6 k v p g 位点除外) ，都是以水解肽键之前的谷氨酸( g i u ) 为特征。 1 1 2 3t u m v 的第一蛋白( p 1 ) 基因及p 1 蛋白 c a r r i n g t o n ( 1 9 9 0 ) 、j e a n m a r i ev e r e h o t 等( 1 9 9 1 ) 、j e l e n aa r b a t o v “1 9 9 8 ) 先后对马铃薯y 病毒属( p o t y v i r u s e s ) 病毒的p l 蛋白进行研究，发现： p l 蛋白就是催化其与p o t y v i r u s e s 的h c p r o 之间断裂的蛋白酶。大肠杆菌 中充分表达t u m v 多聚蛋白中的p l 蛋白，在变性及复性条件，通过金属 螯合层析进行纯化，发现p l 蛋白能与s s r n a 和s s d n a 亲和，但不能结 合d s d n a ，t u m v 的p l 蛋白既能与d s d n a 结合，又能与单链核酸结合。 我国张耀州等( 1 9 9 6 ) 通过r t