（植物学专业论文）拟南芥（arabidopsis+thaliana）vhac基因表达与调控的研究.pdf

学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 瞿伟菁教授华东师范大学主席 周秀佳教授上海中医药大学 王幼芳教授华东师范大学 吴自荣教授华东师范大学 王瑞刚教授内蒙古农业大学 塑堕堕 6 b a ： a b a ： m c t i n ： b r s ： c a m ： c o l ： d g c d ： d e p c ： e b ： e i ) a t ： e s t ： g u s ： h p t ： k a n ： l b ： m s ： p c r ： p e g ： p 肝： r i f ： r t p e r ： s d s ： s i l w e t7 7 ： u t r v a t p r s e ： x g l u c ： 本文出现的缩略语 6 - b e n z y l a m i n op u r i n e6 - 卞基胺基瞟呤 a b e c i s i ca c i d 脱落酸 肌动蛋白基因 b r a s s i n o s t e r o i d s 油菜素内脂 c r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s m 景天酸代谢途径 c o l u m b i a 拟南芥的一种野生生态型 川一d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e 二环己碳二亚胺 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 e t h i d u mb r o m i d e 溴化乙啶 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e x p r e s s e ds e q u e n c et a q 表达序列标签 b g l u c u r o n i d a s eb 一葡萄糖苷酸酶 h y g r o m y c i n 潮霉素 k a n a m y c i ns u l f a t e 硫酸卡那霉素 l u r i a - b e r t a n i 微生物用培养基 m a r a s h i g ea n ds k o o g 植物组织培养基 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p r o t o nm o t i v ef o r c e 质子驱动力 r i f a m p i n 利福平 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r 反转录p c r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 种商品名 u n t r a n s l a t e dr e g i o n 非翻译区 v a c u o l a rh o a t p a s e 液泡h + 一a t p a s e 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 3 一i n d o l y l - b d 6 l u c u r o n i ca c i dc v c l o h e x y l am m o n i u ms a l t5 - 溴4 一氯3 一吲哚一b d - 半乳糖酸 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我 所知，赊文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成 果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均巳在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：缘舞日期：2 1 型兰兰幺 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：替辆 日期：渺，2 妒 导师签名：萎奶罩 日期：7 一歹工之亿 中文摘要 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i 幼a ) 删_ c 基因 表达与调控的研究 中文摘要 植物v - a t p a s e 是一类特殊的膜结合转运蛋白，广泛分布于植物的液泡、质膜 以及内质网、高尔基体、小泡等内膜系统上。v - a t p a s e 利用水解a t p 产生的能 量将质子泵入细胞区室内，调节细胞和细胞器的p h 值，产生质子电化学梯度以驱 动离子和代谢物质的转运，从而影响膨压、细胞的伸长和扩展以及气孔的关闭等 生命活动。另外，当植物处于高盐、干旱、低温等逆境时，v - a t p a s e 通过调节 自身的活性使植物适应环境得以生存。因此，v - a t p a s e 在植物的生长发育及适 应环境的变化中具有重要的作用。 植物v a t p a s e 是由1 3 个亚基组成的复合体酶，这些亚基组成了v ，和v 。域 两大亚复合体。v 。域主要由a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h 八个亚基组成，v 。域由a ， c ，c ”，d ，e 五个亚基组成。c 亚基是v 。域的主要组成亚基，6 个拷贝的c 亚基 形成质子( h + ) 进出细胞内室的通道，c 亚基还参与了v 0 域和膜的结合与组装， 因此c 亚基直接影响v 。域的组装进而影响v a t p a s e 的活性和作用。 研究表明许多植物的v - a t p a s e 亚基是由多基因编码的，这些基因编码形成 不同的亚基同工型( i s o t y p e i s o f o r m ) 。拟南芥v - a t p a s e 的1 2 个亚基中组成 v 域的b ，e ，g 亚基和组成v 。域的所有亚基都是由2 个或两个以上的基因编码。 c 亚基由- c l ，v 9 4 一c 2 , v a c 3 ,例- c 幺和v k 4 - c 55 个基因编码，这是目 前发现的最大的v a t p a s e 亚基基因家族。 尽管目前对于v - a t p a s e 的结构和亚基组成已作了大量研究，编码亚基的基 因也已经从许多植物中克隆，但是关于v a t p a s e 亚基基因表达与调控的研究鲜 有报道，同时对多基因家族编码的亚基同工型在植物体中的作用和意义也知之甚 少。基于此本研究对编码拟南芥v - a t p a s ec 亚基的5 个基因的表达特性和调控 方式进行了比较全面的研究，这对于了解植物v - a t p a s e 亚基基因在植物生长发 育过程中的作用、调控方式以及植物v - a t p a s e 功能的多样性具有重要意义。 本论文采用r t _ p c r 技术对拟南芥的5 个路t a - c 基因的表达特性及盐胁迫， 环境的p h 值，水分胁迫，外源a b a 等非生物胁迫对其表达的调节进行了比较全 面的研究：在此基础上集中克隆了v e a c 3 基因的启动子区，构建v h a - c 3 ：g u s 融合表达载体，进步研究v a c 3 基因在拟南芥中的表达特性及非生物胁迫对 2 华东师范大学博士学位论文 其表达的调节；同时构建了吲一c 3 启动子缺失载体，通过分析不同长度的v h a - c 3 基因启动子指导的g u s 基因在拟南芥中的表达情况，探讨v h a c 3 基因表达调控 的分子机制。 研究结果如下： 1 在正常的生长条件下，v i i ac 1 、v h a c 2 和v h a c 3 基因在根、茎、叶、花、 果荚中均有表达，而v h a c 4 和v i i a c 5 基因的基础表达量非常低。表明 v h a e l 、v h a c 2 和v h a c 3 具有持家基因的表达特性，它们的表达维持植 物正常的生命活动。 2 盐胁迫，环境的p h 值，水分胁迫，外源a b a 调节v h a - c 基因的表达。而 v h a - c 4 和v h a c 5 基因在胁迫条件下的表达变化特别明显，表明v h a c 4 和 v h a c 5 基因在植物响应环境胁迫中起作用。本研究首次对v h a - c 4 和删一c 5 基因的表达特性和作用进行研究。 3 对v i i a - c 3 基因的深入研究表明，v h a - c 3 基因在拟南芥幼苗的根、光培养 的子叶、暗培养的下胚轴中表达；在叶片中的表达具有发育特异性，随叶 龄的增加而增加；在花器官中的表达具有组织特异性，只在萼片、柱头、 花柱和花粉粒中表达。这些结果表明v i i a - c 3 基因参与了细胞的扩展和膜泡 运输。 4 在盐胁迫条件下，v h a c 3 基因在叶片中的表达显著增加，而在根中的表达 变化不明显，表明盐胁迫以组织特异性的方式调节v h a - c 3 基因的表达。 5 在酸性条件下，v h a c 3 基因在拟南芥根中的表达受到抑制，而在叶中的表 达变化不明显。本研究首次证明环境p h 值调节植物v - h t p a s e 亚基基因的 表达。 6 对不同长度的v i - i a - c 3 基因启动子指导的g u s 基因在拟南芥中的表达特性傲 了研究，结果表明v h a - c 3 起始密码子a t g 上游7 7 2 b p 序列内存在着调控其 表达的基本的启动子元件。 关键词：v - a t p a s e ，c 亚基，吼4 1 ，组织特异性表达，基因表达调控，环境 胁迫 茎塞塑茎 t h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no f 删1 g e n e s i na r a b i d o p s i st h a l f a n a a b s t i 认c t t h ep l a n tv a t p a s ei sam e m b r a n e b o u n dt r a n s p o r tp r o t e i nl o c a t e dt o t h et o n o p l a s ta n dv a r i o u ss u b c e l l u l a rm e m b r a n e s ，i n c l u d i n gt h eg o l g i ， e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，i n t r a c e l l u l a rv e s i c l e s ，a s w e l la st h ep l a s m a m e m b r a n e t h ev - a t p a s eu s e st h ee n e r g yr e l e a s e dd u r i n gc l e a v a g eo ft h e 7 - p h o s p h a t eg r o u po fc y t o s o l i ca t p t op u m pp r o t o n si n t ot h ev a c u o l a rl u m e n a n da c i d i f yt h ev a c u o l e ，t h e r e b yc r o a t i n ga ne l e c t r o c h e m i c a lh - g r a d i e n t w h i c hi st h ed r i v i n gf o r c ef o rav a r i e t yo ft r a n s p o r te v e n t so fi o n sa n d m e t a b o l i t e sa n ds oi n f l u e n c i n gt u r g o r ，c e l le x p a n s i o n a n dg u a r dc e l l m o v e m e n t o nt h eo t h e rh a n d ，u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n ss u c ha ss a li n i t y ， d r o u g h t ，c o l d ，s u r v i v a lo ft h ec e l l sd e p e n d ss t r o n g l yo nm a i n t a i n i n go r a d j u s t i n gt h ea c t i v i t yo ft h ev - a t p a s e t h u sv - a t p a s e i si n d i s p e n s a b l e f o rp l a n tg r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n da d a p t a t i o nt oc h a n g i n ge n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o i l s ap l a n tv a t p a s ec o n s i s t so fa tl e a s t1 3d i s t i n c ts u b u n i t so r g a n i z e d i nt w ol a r g es u b c o m p l e x e s ：t h ec y t o s o li cv la n dm e m e b a r n ev 0 t h ev is e c t o r c o n s i s t so fs u b u n i t sat h r o u g hh t h ev 口s e c t o ri n c l u d e sf i v ep z 。o t e i n s ， n a m e ds u b u n i t sa ，c ，c ”，d ，e s u b u n i t ci sam a j o r c o m p o n e n t o ft h e m e m b r a n o u sv os e c t o r ，f o r m st h ep r o t o nc o n d u c t a n c ep a t h w a ya n di n v o v l e s i na s s e m b l yo ft h ev oc o m p l e x s m a l lg e n ef a m i i i e sh a v eb e e nd e t e c t e di nt h ep l a n tg e n o m ef o rm o s t p l a n tv a t p a s es u b u n i t s s u b u n i t sb ，ea n dgi nt h ev l s e c t o ra n da l lt h e v os u b u n it sa r ee n c o d e db ya tl e a s tt w og e n e si na r a b f d o p s i s s u b u n i te i se n c o d e db yt h el a r g e s tg e n ef a m i l yw i t hf i v em e m b e r s ( 踢h c ，踞掰一c 2 , 煳1 曼f z 4 - c 4a n d 删一c 曲，y e tt h es p e c i f i cf u n c t i o no fm u l t i p l eg e n e so f s u b u n i t si np l a n ta n dt h e i rr e g u l a t i o na r el a r g e l yu n k n o w n t ou n d e r s t a n dt h er o l e sa n dr e g u l a t i o no fv h a cg e n e s ，w ed e t e r m i n e d t h e i rp a t t e r n so fe x p r e s s i o nu n d e rn o r m a la n ds t r e s sc o n d i t i o n sb yu s i n g 4 华东师范大学博士学位论文 r t p c r t h e nt h ee x p r e s s i o np a t t e r no fv l 4 一c 奠m o n i t o r e db yp r o m o t e r d r i v e nb g l u c u r o n i d a s e ( g u s ) a e i v i t y ，w a sa l s oi n v e s t i g a t e du n d e rn o r m a l a n ds t r e s sc o n d i t i o n s t oa n a l y s i se x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f v h a - c 了，as e r i e so fp r o m o t e rm u t a n t sw e r ec o n s t r u c t e di nw h i c hv a r i o u s e x t e n t so f 阳翻一c 3p r o m o t e rw e r ep l a c e du p s t r e a mo ft h eg u sg e n ei nt h e v e c t o rp c a m b i a l 3 0 5 1 o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a t ： ( 1 ) v h a c l 、v t i a c 2a n d 删_ c ? w e r ee x p r e s s e di na r a b i d o p s f sr o o t ，b o l t ， l e a f ，f l o w e ra n ds i l i q u e ，w h i l eb a s a lt r a n c r i p t i o nl e v e lo f v h a 0 4 a n dv t t a c 5w a sv e r yl o wu n d e rn o r m a lc o n d i t i o r s ( 2 ) t h ee x p r e s s i o no fv i t a cg e n e sw a sr e g u l a t e db ys a l ts t r e s s ，a c i d i c o ra l k a l ic o n d i t i o n s ，w a t e rs t r e s sa n de x o g e n o u sa b a e x p r e s s i o no f v h a - c 4a n dw t a - c 5w a sc l e a r l yr e g u l a t e db ye n v i r o n m e n t a lc u e s 。 s u g g e s t i n gt h e i rf u n c t i o nr e s p o n s i v et o s t r e s sc o n d i t i o n s t oo u r k n o w l e d g e ，t h i si st h ef i r s tr e p o r to ne x p r e s s i o na n df u n e t i o no f t h e s et w og e n e s ( 3 ) t h ee x p r e s s i o n o fv t t a - c 3i n r o o t ，c o t y l e d o n o f s e e d l i n g s a n d h y p o c o t y l s o fe t i o l a t e d s e e d l i n g s t h ee x p r e s s i o no f 吼4 一c 3i n a r a b i d o p s i sl e a fw a sd e v e l o p e n t a ls t a g ed e p e n d e n t i t se x p r e s s i o n w a sa l s oi nat i s s u e s p e c i f i cm a n n e r ，e x p r e s s e do n l yi nf l o r a lo r g a n i n c l u d i n gs e p a l ，s t i g m a ，s t y l ea n da n t h e r ( 4 ) f u r t h e r m o r e ，n a c ls t r e s sc o u l da l s oa l t e rt h ee x p r e s s i o no fv h a0 3 i na r a b i d o p s f sl e a fi nat i s s u e s p e c i f i cm a n n e r ( 5 ) u n d e rp h 4c o n d i t i o n ，t h ee x p r e s s i o no fv t t a c 3w a si n h i b i t e di n a r a b i d o p s i sl e a f t oo u rk n o w l e d g e ，t h i si st h ef i r s tr e p o r tt h a t p hr e g u l a t e se x p r e s s i o no fp l a n tv a t p a s eg e n e s ( 6 ) t h ee s s e n t i a lc i s e l e m e n tf o re x p r e s s i o no f 删1 7 w a sl o c a t e dw i t h i n t h e 7 7 2 b pf r a g m e n t su p s t r e a m o ft h et r a n s l a t i o ns t a r tc o d o no f 雎别c 。置 k e yw o r d s ：v - a t p a s e ，cs u b u n i t ，嘲一c ，t i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o n g e n ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o n ，s t r e s sc o n d i t i o n s 第一章植物v - a t p a s e 的研究进展 第一章植物v - a t p a s e 的研究进展 植物的生长发育依赖于对营养元素和代谢物质的吸收、运输和选择，同时植 物还必须适应和抵抗逆境，以求生存。植物通过对转运蛋白的调解来感知和响应 营养和环境的改变。质子泵在转运蛋白中占有很重要的位置，没有质子驱动力提 供能量并与载体或质子通道偶联，所有其它的转运蛋白都将停止运转( s z e 等， 2 0 0 2 ) 。 在植物中主要有三种质子泵( h + - a t p a s e ) ，位于细胞质膜上的p 型质子泵 ( p - a t p a s e ) 、液泡膜上的v 型质子泵( v - a t p a s e ) 和h l p p a s e ( s z e 等，2 0 0 2 ； b a r k l a 等，1 9 9 6 ；m o r s o n m n e 等，2 0 0 0 ) 。在植物中，p a t p a s e 从细胞中外排 r ， 并提供能量来吸收和释放许多营养物质。拟南芥p - a t p a s e 基因家族有1 2 个成员 ( a h a 卜a h a l 2 ) ( p o r t o l l o 等，2 0 0 0 ：p a l m g r e n 等，2 0 0 1 ) 。v - a t p a s e 和h 一p p a s e 在细胞内部酸化细胞内室，拟南芥中有三个基因编码同源的h l p p a s e ( a v p i - a v p 3 ) ( d r o z d o w i c z 等，1 9 9 7 ) 。v - a t p a s e 是亚基构成最复杂的质子泵 ( l u t t g e 等，1 9 9 7 ) ，自发现二十年以来，我们刚刚开始理解v - a t p a s e 在植物 中的作用。 v - a t p a s e 是一类膜结合蛋白，分布于液泡、质膜以及内质网( e r ) ，高尔基 体和小泡等内膜系统上( m a t i n 等，1 9 8 5 ：s z e 等，1 9 8 5 ：s z e 等，1 9 9 2 ：l u t t g e 等，1 9 9 7 ) 。在液泡中，v - a t p a s e 含量非常丰富，占液泡总蛋白量的 6 5 - 3 5 ( s c h l i e b s 等，1 9 9 7 ) ，利用电子显徽镜观察每u m z 的液泡膜上有9 7 0 3 3 8 0 个v - a t p a s e 全酶( l u t t g e 等，1 9 9 7 ) 。v a t p a s e 利用水解a t p 所释放的能量将 质子泵入液泡腔中，产生质子电化学梯度作为各种离子和代谢物质转运的驱动 力。因此，v a t p a s e 是十分重要的持家酶以维持细胞质中的离子稳态和细胞的 代谢。另一方面，在环境胁迫条件下，v - a t p a s e 作为胁迫响应酶会适当的改变 皿基的表达和酶结构。因此，v - a t p a s e 被称为“生态酶”( e c o e n z y m e ) ( l u t t g e 等，1 9 9 5 ) 。 一植物v - a t p a s e 的功能 在植物中，v - a t p a s e 广泛分布于液泡、质膜以及内质网( e r ) ，高尔基体和 小泡等内膜系统上( 图1 ) ( s z e 等，1 9 9 9 ：d i e t z 等，2 0 0 1 ) 。v - a t p a s e 的主要 作用是酸化液泡及其它的细胞内室，为离子和代谢物质的转运提供能量，因此影 华东师范大学博士学位论文 响膨压和细胞扩展。已有实验证明质子电化学梯度对于蛋白质的定位具有重要的 作用( m a t s u o k a 等，1 9 9 7 ) 。另外酵母中小泡之间的融合需要v a t p a s e 的v 。域参 与，这说明在中心液泡形成期间v 。域在膜融合中起作用( w i c k n e r 等，2 0 0 0 ， p e t e r s 等，2 0 0 1 ) 。在动物体内，v - a t p a s e 除了在细胞内膜上发挥着重要作用以 外，大量分布于肾小管和破骨细胞膜上的v - a t p a s e ，还维持着动物体的酸碱平 衡和骨骼的新陈代谢过程。在植物的保卫细胞，维管组织和分生组织中以及特有 的生理过程，如植物的营养运输，开花，胁迫忍受中v - a t p a s e 都发挥着特定的 功能。 图1 植物v - a t p a s e 的分布 f i g1 v - a t p a s ew i t hd i v e r s e1 0 c a t i o n 第一章植物v - a t p a s e 的研究进展 v - a t p a s e 缺失突变体是分析v - a t p a s e 在植物体内功能的有利工具。植物 体中的第一个v - a t p a s e 突变体是幽 ? ，它是亚基c 的突变体，表现为亚基c 和 v - a t p a s e 的活性减少。当在黑暗中植物表现为非黄化状态( 8 c h u m a c h e r 等1 9 9 9 ) ， 光下生长明显的矮化和顶端优势的丧失。另外，外源c a ”浓度升高后使突变体气 孔关闭状态消失( a 1 l e n 等，2 0 0 0 ) 。这些研究显示v a t p a s e 与植物的生长，发 育和保卫细胞信号传导紧密相关。 二植物v - a t p a s e 的结构 植物v - a t p a s e 由1 3 个亚基组成( 表一) ，这些亚基组成了两大亚复合体： 位于细胞质内的v 。域和膜内的v 。域( a r a t a 等，2 0 0 2 b ：d o m g a l l 等，2 0 0 2 ) 。与线 粒体和叶绿体上的f 一型a t p 合成酶( f a t p a s e ) 非常相似，v ，域和v 。域的结构类 似于f - a t p a s e 的f 。和f 。域。v 。域由亚基a 到h 组成，它催化a t p 的水解并与质 子转运相偶联，质子通过与膜结合的v 。域运入区室中( 见图2 ) ；v 。域包括五个 完整的蛋白，亚基a 、c 、c ”、e 和一个亲水性亚基d 。亚基a 和亚基b 各三个 拷贝形成了六聚物催化水解a t p 。亚基d 和亚基f 组成的中心柄将v 。域和v 。域连 接起来。亚基e 与亚基g ，c ，h 有关联，是中心柄的一部分或者是外周柄的一部 分( a r a t a 等2 0 0 2 a ：g r u b e r 等，2 0 0 0 ) 。完整的亚基a 的末端与亚基a 和外周柄 相连。亚基c 是v 。域的主要组成亚基，6 个拷贝的亚基c 形成质子进出的通道， 在驱动质子转运中亚基c 形成的环的旋转是必不可少的。 1 v 。域亚基的结构及功能 亚基a ：植物v - a t p a s e 亚基a 的序列与f a t p a s e 的催化亚基1 3 的序列相似， 与酵母的v m a l p 蛋白同源。亚基a 包含了核苷酸结合位点，腺嘌呤类似物与亚基 a 结合抑制了a t p 的水解活性( g o g a r t e n 等，1 9 9 2 ：r a n d a l l 等，1 9 8 7 ：w a n g 等， 1 9 8 5 ) ，因此亚基a 是v - a t p a s e 的催化亚基。从氨基酸序列推测亚基a 的分子量 在6 8 5 和6 8 8 k d a 之间，因种而异。 亚基b ：亚基b 的序列与f - a t p a s e 的亚基d 的序列相似，与酵母的v m a 2 p 蛋白同源。它有一个核苷酸结合位点，但是光激活的a t p 类似物并不抑制 v - a t p a s e 的a t p 水解活性( m a n o l s o n 等，1 9 8 5 ) ，这表明亚基b 是与底物结合的 非催化亚基。推测其分子量在5 3 7 和5 4 7 k d a 之间。 亚基c ：亚基c 的分子量在3 7 和5 2 k d a 之间。其功能还不清楚，可能与v ，域 的稳定有关。大麦( 1 1 0 v u l g a t e ) 和拟南芥中的亚基c 已被克隆，其序列与酵母 的v m a 5 基因很相似。 亚基d ：拟南芥中的亚基d 已被克隆( k l u g e 等，1 9 9 9 ) ，分子量约为2 9 i k d a ， 与酵母的v m a 8 p 同源。对亚基d 的分析发现，其结构与f a t p a s e 的v 亚基相似 华东师范大学博士学位论文 ( n e l s o n 等，1 9 9 5 ) 。因此，亚基d 参与了v o 域和v 1 域的连接以及a t p 的水解 和h + 转运的偶联。 亚基e ：从植物中克隆的亚基e 的序列与酵母的v a m 4 p 蛋白相似，它形成中心 柱，其分子量在2 6 2 2 7 1 k d a 之间。 亚基f ：分子量为1 3 k d a ，与酵母的v a m t p 蛋白同源，其功能主要为联系v 。和 v ，的桥。 表1 总结了酵母和拟南芥的v - a t p a s e 亚基及功能 t a b l e l v a t p a s es u b u n i t sa n df u n c t i o n si ny e a s ta n dd r a b i d o p s f s s u b u n i tf u n c t i o n by e a s tr e f e r e n c e a r a b f d o p s i s k d ag e n eg e n ek d ap r o t e i n v lp e r i p h e r a ls e c t o r a c a t a l y t i ca t p b i n d i n g 6 9p 刎v h a a6 8 p e r i p h e r a l b n o n c a t a l y t i ca t pb i n d i n g 6 0g i n 2v i a b5 4 p e r i p h e r a l cv ls t a b i l i t y a c t i v i t y4 2嘲5v h a c4 2 p e r i p h e r a l dc e n t r a ls t a l k ，c o u p l i n g 3 2v m a 8 v h a d2 9 p e r i p h e r a l e p e r i p h e r a lo rc e n t r a ls t a l k 2 7 册硝4v h a e2 6 p e r i p h e r a l f b r i d g ev 1 一v oc o n t a c t s 1 4 翰甜7v h a f1 4 p e r i p h e r a l g c o u p li n gv 1 a n dv o 1 3v g a i ov h a g1 2 p e r i p h e r a l h r e g u l a t o r y 5 4阳e 4 1 3v h a h5 0 p e r i p h e r a l v om e m b r a n es e c t o r a c o u p l i n g ，a s s e m b l y 9 5 一1 0 1v p h l s t v l dv u a a8 9 9 5 i n t e g r a l ep r o t o nt r a n s l o c a t i o n1 6 昭纠3v h a e1 6 i n t e g r a l c 7 p r o t o nt r a n s l o c a t i o n1 7 陋翻一nd e ”p r o t e o l i p i ds i m i l a rt oc 2 3v m a l 6v h a c ”1 8 i n t e g r a l dv oa s s e m b l y s t a b i l i t y3 6v i g a 6v h a d4 0 p e r i p h e r a l en dv f a e 8 i n t e g r a l d r a b i d o s p s l st h a l l o eg e n e sw o u l db ed e n o t e da sa t v h a x dv p t l la n ds t v a r eh o m o l o g so fs u b u n i tai ny e a s t a b b r e v i a t i o n s ：n d ，n o td e t e c t e d 亚基g ：从植物中克隆的亚基g 与酵母的v a m l o p 蛋白同源，编码这些克隆的多 肽的分子量为1 2 5 k d a 。烟草的亚基g 可使酵母的v a m l 0 突变体恢复为野生型 ( r o u q u i e 等，1 9 9 8 ) 。尽管亚基g 的序列比f - a t p a s e 的b 亚基短，在它的n 一端没 有明显的跨膜域，但是亚基g 的序列与f a t p a s e 的b 亚基的序列具有很高的相 似性( s u p e k o v a 等，1 9 9 6 ) 。与f - a t p a s e 的b 亚基相似，亚基g 是v - a t p a s e 颈 第一章植物v - a t p a s e 的研究进展 的主要组成部分，可能参与了a t p 的水解和h + 转运的偶联。有趣的是，燕麦 ( a p 鲫a s a t i v a ) 的v a t p a s e 的亚基g 在v 。域和v ，域分开后是与v 。域联在一起 的( w a r d 等，1 9 9 2 ) 。冰叶日中花的全酶中的亚基g 没有在分解的v 。亚基中发现， 这些都显示了亚基g 是与v 。亚复合体紧密相连的。 亚基h ：从拟南芥中克隆得到的亚基h 的分子量为5 0 k d a ，它类似于酵母的 v a m l 3 p 。已知酵母的v a m l 3 p 在v - a t p a s e 的组装中是必不可少的，并不在催化过 程中起作用( h o 等，1 9 9 3 ) 。近来，在sc e r e v i s i a e 中己鉴定v h a h 的存在， 其结构已被预测( s a g e r m a n n 等，2 0 0 1 ) 。植物的v h a h 有两个高度保守区域， 这两个区域可能由一个可变的间隔序列分开，这表明v h a h 的结构具有弹性 ( k l u g e 等，2 0 0 3 ) 。v i a h 的三维结构的特征是有两个由三个a 螺旋形成的超 螺旋犰狳重复蛋白元件，这一特征在植物的其它蛋白中也存在，是介导蛋白与蛋 白的互作( h i r s c h l 等，1 9 9 6 ) 。有研究表明v h a h 可能是连接v 。和v 。的，并激 活v - a t p a s e 。交联研究哺乳动物的衣被小泡和酵母揭示v h a h 与a e ，v h a f ， v h a e 具有互作关系( l a n d o l t m a r t i n c o r e n a 等，2 0 0 0 ：x u 等，1 9 9 9 ) 。 2 v 。域亚基结构及功能 亚基c ：植物v - a t p a s e 亚基c 是v 。域的主要组成成分，其序列与f a t p a s e 的亚基c 和酵母的v m a 3 p 蛋白同源。已经从几种植物中克隆出亚基c 基因，推断 其分子量大约在1 6 6 和1 6 7 k d a 之间。亚基c 是高度疏水性蛋白，包括四个跨 膜结构域( l a i 等，1 9 9 1 ) ，直接参与了h + 的转运。在酵母的亚基c 中，跨膜结构 域i v 中的”7 g l u 被证明是非常必要的。因为”7 g l u 被除了a s p 以外的其它氨基酸 代替后，v - a t p a s e 即失活。这一结果暗示带负电荷氨基酸是d c c d 的结合位点， d c c d 抑制v - a t p a s e 活性。d c c d 结合研究揭示每个v - a t p a s e 全酶至少有六个亚 基c ( k a e s t n e r 等，1 9 8 8 ) 。然而，每个v a t p a s e 结合一个d c c d 就可以使v a t p a s e 失活这暗示了在不同的亚基c 之间高度的协同性。 亚基a ：分子量约在9 5 一1 1 5 k d a ，是v - a t p a s e 中最大的亚基。与酵母的 v p h i s t v i 蛋白相类似。在f a t p a s e 中没有与之序列相似的亚基，这可能是 v a t p a s e 的独有的蛋白。亚基a 可能参与了v a t p a s e 的组装以及将v - a t p a s e 定向到液泡上。v h a a 的结构是嵌合性的，它带有一个保守性很低的亲水性氨基 端( a s 卜4 0 0 ) 和一个相对更保守的疏水性羧基端( a a4 0 1 8 1 6 ) 。羧基端有6 9 个跨膜域，包括参与了h + 的跨膜转运的氨基酸残基。这些氨基酸残基在所有的已 公布的v h a a 序列即k 7 4 3 ，h 7 4 3 ，q 7 8 9 ，r 7 9 9 ( k l u g e 等，2 0 0 3 ；l e n g 等，1 9 9 6 ) 中 是保守的，这暗示了其可能具有催化功能。然而，在植物有功能的v - a t p a s e 复 合物中是否有完整的v h a a 的存在仍然难以定论( r a t a j c z a k ，2 0 0 0 ) 。l ia n ds z e 等( 1 9 9 9 ) 不能在有催化活性的v - a t p a s e 中鉴定到v h a a ，这暗示v h a a 在 i o 华东师范大学博士学位论文 v - a t p a s e 的组装中是需要，但是在有功能的v - a t p a s e 复合物中是不存在的。目 前还不能用蛋白质组学的方法分析v h a a ，因为免疫沉淀得到许多分子量大约为 l o o k d a 的多肽( d r o b n y 等，2 0 0 2 ) 。 亚基d ：分子量在3 2 3 6 k d a 之间，可能与酵母v m a b p 蛋白相似。尽管亚基d 没有跨膜结构域，但是它却是与v 。域紧密相连( w a n g 等，1 9 8 8 ) 。亚基d 可能与 v 。域的组装和稳定有关。用离液盐处理可使v h a d ( 酵母中的v m a 6 p ) 从酵母的 v o 域中溶解出来( b a e u e r l e 等，1 9 9 3 ) 。抗v m a 6 抗体可以和用离液试剂处理的红 甜菜( r e db e e t ) 液泡膜中分离出来的3 6 k d a 的多肽反应(