（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕bmnadhb5的表达分析及其亚细胞定位.pdf

浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 学位论文作者签名：查删 日期：少口年多月】，1 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：圈 日期：少，口年乡月- j at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i - - t e c h u n i v e r s i t yf o rd e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e c a n d i d a t e sn a m e ： l iii n g t i n g s u b m i s s i o nd a t e ： 】虹al 2 q1q 单位代码! q 墨3 垦 研究生学号q z 2q 2q 兰q 堇z 本研究由张耀洲教授主持的 国家重点基础研究发展规划( 9 7 3 计划) ( n o 2 0 0 5 c b l 2 1 0 0 6 ) 国家8 6 3 计划课题 ( n o 2 0 0 7 a a 0 2 1 7 0 3 ，2 0 0 7 a a l 0 0 5 0 4 ) 浙江省自然科学基金 ( n o y 3 0 8 0 1 8 3 ) 提供资助 浙江理r 大学硕十学位论文 摘要 从本实验室构建的家蚕蛹e d n a 文库中筛选出一条4 3 8b p 的基因序列( 基因登录 号：e u 8 2 6 6 7 6 ) ，编码1 5 0 个氨基酸残基，序列比对发现是n d u f b 5 家族的一个亚基， 将该基因命名为b m n a d t t b 5 ( b o m b y xm o r in i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d eh y d r i d e c y t o c h r o m eb 5r e d u c t a s e ) 。 目的片段经b a m hi 和x h oi 双酶切后插入到高效表达载体p e t - 2 8 a ( + ) q b ，成功构 建原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) - b m n a d h b 5 ，在e c o l ir o s e t t a 中过度表达重组的 p e t - 2 8 a ( + ) b m n a d h b 5 并纯化蛋白。超声破碎表达产物，发现以包涵体的形式存在于 沉淀中，我们通过镍柱进行纯化，以纯化的融合蛋白为抗原多次免疫一只雄性新西兰 兔，获得的抗体用i 刨接酶联免疫吸附实验( e l i s a ) 测得其效价为1 ：1 2 8 0 0 以上。我们 提取了家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个时期的总蛋白和总r n a ，又选择五龄幼虫第三 天作为实验对象来研究b m n a d h b 5 的组织分布情况，提取了家蚕的头、表皮、马氏管、 气管、脂肪体、丝腺、睾丸和卵巢等组织的总蛋白和总r n a 。我们用e l i s a 半定量法 和w e s t e r nb l o t 以及荧光定量p c r 实验检测b m n a d h b 5 的表达分析及其分布。e l i s a 半定量法和w e s t e r nb l o t 技术分析发现b m n a d m 5 蛋白在家蚕各发育时期都有表达， 其中卵期表达量明显高于其他发育时期，在各组织中，气管、生殖器等表达量较高。 荧光定量p c r 实验，我们发现家蚕各发育时期，蛹期表达量明显高于其他发育时期， 在各组织中，马氏管表达量最高。我们又用免疫荧光技术对b m n a d h b 5 蛋白在家蚕卵 巢上皮细胞b m n 进行定位研究，结果发现，它在细胞整个生长周期中主要存在于细胞 质中。该结果为我们进一步研究b m n a d h b 5 蛋白在细胞中的功能奠定了基础。 关键词：e l i s a ：w e s t e r nb l o t ；荧光定量p c r ：亚细胞定位 浙江理- 丁人学硕士学位论文 a b s t r a c t ae d n as e q u e n c ec o n t a i n i n gac o n s e r v e dd o m a i nn d u f - b 5w a sf o u n df r o mt h ec d n a l i b r a r yc o n s t r u c t e db yo u rl a b o r a t o r y ( g e n ei d ：e u 8 2 6 6 7 6 ) w ea n a l y z e dt h eb i o i n f o r m a t i o no f ae d n as e q u e n c es e l e c t e df r o ms i l k w o r mp u p ac d n al i b r a r ya n df o u n dt h a tt h ec d n a s e q u e n c eo f b m n a d h b 5g e n ec o n t a i n e da no r fo f 4 3 8b pe n c o d i n gap o l y p e p t i d eo f1 5 0a m i n o a c i d s i no r d e rt op r e p a r et h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e so fb m n a d h b 5 ，t h eb m n a d h b 5 g e n ew a s a m p l i f i e db yp c ra n di n s e r t e di n t ot h ep e t - 2 8 a ( + ) e x p r e s s i o nv e c t o r f o l l o w i n gt r a n s f o r m a t i o n o fe c o l ir o s e t t ac e l l sw i t ht h ep e t - 2 8 a ( + ) - b m n a d h b 5c o n s t r u c t r e c o m b i n a n tb m n a d h b 5 w a so v e r e x p r e s s e di ne c o l ir o s e t t ab ya d d i n gi p t gf o ri n d u c t o r t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s p u r i f i e d 、访mm e t a l c h e l a t i n ga f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n dt h e nt h ep u r i f i e df u s i o np r o t e i nw a s u s e dt oi m m u n i z eam a l en e wz e a l a n dr a b b i ta n d g e n e r a t ea n t i - b m n a d h b 5p o l y c l o n a l a n t i b o d y w h i c ht i t e rw a sl a r g e rt h a n1 ：12 8 0 0w h e na tt h ec o n c e n t r a t i o no f10 斗g c m l w e e x t r a c t e dp r o t e i na n dr n ao fd i f f e r e n ts t a g e so fb o m b y xm o r ia n ds o m et i s s u e so ft h ef i f t hi n s t a r l a r v a e ，s u c ha sh e a d ，e p i d e r m i s ，t r a c h e a , m a l p i g h i a nt u b u l e ，f a t t yb o d y , s i l kg l a n d ，t e s t i s ，o v a r y a n dg u t t h e nw ed e t e c t e dt h ea n t i b o d ya n a l y z e db ys e m i - q u a n t i t a t i v ea n dw e s t e r nb l o ti n d i f f e r e n ts t a g e sa n dt i s s u e s t h es t a g es p e c i f i ce x p r e s s i o np a t t e r n si n d i c a t e dt h a tb m n a d h b 5 w a se x p r e s s e dt h eh i 曲e s tl e v e li ne g g s t h et i s s u es p e c i f i ce x p r e s s i o np a t t e r n ss u g g e s t e dt h a t b m n a d h b 5w a se x p r e s s e dt h eh i g h e s tl e v e li nm a l p i g h i a nt u b u l ea n dg e n i t a lo r g a n t h er e s u l t o fr e a l t i m ep c rr e v e a l e dt h a tb m n a d h b 5m r n ai sw i d e s p r e a di nt h ed e v e l o p m e n t a ls t a g e s o fs i l k w o r m ，h i 曲e s ti np u p a , a n dd i f f e r e n tt i s s u e so ft h ef i f t hi n s t a rl a r v a , h i g h e s ti nm a l p i g h i a n t u b u l e t h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ft h eb m n a d h b 5w a sa n a l y z e d b m n a d h b 5a c c u m u l a t e d i nc y t o p l a s m a l lt h e s er e s u l t sw i l lp r o v i d eu si m p o r t a n te v i d e n c et om a k ef u r t h e rs t u d i e so f b r n n a d h b 5 k e y w o r d s ：e l i s a ；w e s t e r nb l o t ；r e a l - t i m ep c r ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n 浙江理j f ：大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 缩咯语1 第一章n a d h 还原酶的综述2 j ；i 言： 1 酶的发现2 2 氧化还原酶的分类2 3 线粒体复合体和n a d h 2 4n a d h 和n a d h 辅酶的化学结构的关系4 5n a d h 细胞色素b 5 还原酶4 6n a d h 突变引起的疾病5 7 展望。5 第二章实验方案设计7 1 实验目的和意义7 2 实验流程7 第三章生物信息学分析8 1 生物信息学工具8 2 结果与分析8 2 1 基因分析9 2 1 1 进行序列比对9 2 2 蛋白性质分析一9 2 2 1 保守结构域分子9 2 2 2 跨膜结构分析1o 2 2 3 疏水性分析l o 2 2 4b m n a d h b 5 蛋白定位的预测11 2 2 5 信号肽分析1 1 2 2 6 功能位点的预测1 2 2 2 7b m n a d h b 5 类家族蛋白的同源分析1 3 2 2 8 进化树分析1 3 2 2 9 二级结构预测1 4 3i j t 论15 第四章b m n a d h b 5 的克隆、表达、纯化及抗体制备17 1 材料与试剂17 1 1 材料17 1 2 试齐0 1 7 1 3 试剂的配制1 7 1 3 1 培养基1 7 1 3 2 碱裂解法提取质粒d n a 用溶液1 8 1 3 3 核酸电泳所用溶液1 9 1 3 4s d s p a g ej e h 试剂1 9 1 3 5 抗体纯化朋试剂2 0 1 3 6b r a d f o r d 检测h j 试剂2 l 1 3 7 抗体制备用试剂2 l i 浙江理j 人学硕十学位论文 1 3 8e l i s a 试剂。2 1 1 3 9 其他试剂2 2 2 实验方法2 2 2 1 局耐忆蚴5 基冈的克隆2 2 2 1 1p c r 获得的o r f 序列2 2 2 1 2p c r 产物与表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 的双酶切2 3 2 1 3 酶切产物的纯化2 4 2 1 4 连接反应2 4 2 1 5e c o l it g l 、e c o l ir o s e t t a 感受态细胞的制备2 4 2 1 6 连接产物的转化2 4 2 1 7 重组克隆的筛选与鉴定一2 5 2 1 8d n a 胶同收2 5 2 1 9 质粒提取2 6 2 1 1 0 基冈序列的测定2 7 2 1 1 lb r a d f o r d 法蛋白定量2 8 2 2b n l n a d h b 5 重组质粒在大肠杆菌中的表达2 8 2 2 1 融合蚩白的诱导表达2 8 2 2 2s d s - p a ( 范操作步骤2 8 2 2 3 融合蛋白的纯化3 0 2 3 抗体的制各3 0 2 3 1 抗原的制备3 0 2 3 2 免疫动物。31 2 3 3 多克隆抗血清的制备31 2 3 4 抗体的纯化31 2 3 5 抗体的效价测定( e l i s a ) 3 2 3 结果3 2 3 1p c r 扩增目的片段3 2 3 2 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m n a d h b 5 的双酶切鉴定3 3 3 3 重组质粒测序结果3 3 3 4 蛋白诱导纯化3 4 3 5 处理包涵体3 5 3 6 抗体纯化图3 6 3 7 抗体的效价测定3 6 z l 讨论3 7 第五章b m n a d h 的表达分析及其分布3 9 1 材料与试剂3 9 1 1 材料3 9 1 2 试卉0 3 9 1 3 试剂的配制3 9 1 3 1 抗体纯化用试剂3 9 1 3 2w e s t e r nb l o t 试剂3 9 2 方法4 0 2 1w e s t e r nb l o t 检；1 9 1 0 4 0 2 2 总蛋白和r n a 的提取及定量4 l 2 2 1 总蛋白质的提取及定量4 1 浙江理t 大学硕士学位论文 2 2 2 总r n a 的提取4 l 2 2 3 反转录反应4 2 2 3 荧光定量p c r 检测b l n a d h b 5 在家蚕各组织的分布4 2 2 3 1 荧光定量p c r 的引物设计4 2 2 3 2 荧光定量p c r 4 3 2 3 3 荧光定量p c r 数据分析4 3 3 实验结果与讨论4 4 3 1 抗体的w e s t e r nb l o t 分析4 4 3 2e l i s a 半定量法和w e s t e r nb l o t 检测各绍织4 4 3 3e l i s a 半定量测定家蚕各时期中b m n a d h b 5 含量4 5 3 4 荧光定量p c r 技术对b n l n a d h b 5 转录水平的分析4 8 z ii i t 论! ；：； 第六章亚细胞定位5 4 1 材料与试剂5 4 1 1 材料5 4 1 2j 戚剂5 4 1 3 试剂的配制5 4 2 方法5 5 3 结果5 6 z l 讨论5 7 l ；论：；8 参考文献5 9 致谢6 2 v 浙江理下大学硕士学位论文 姆 b l a s t b s a c m d a p i d n t p e d l 、a e l i s a f c a f l 气 h r p 口t g k a n l b n a d h n c b i o p d o i 江 p a g e p c r p v d f s d s t e m 匣d i r i s p - a m m o n i u m p e r s u l f a t e 缩略语 b a s i cl o c a la l i g n m e n t s e a r e ht o o l a l b u m i n , b o v i n e ，f r a c t i o nv c h l o r o m y c i n 2 一似- a m i d i n o p h e n y l ) 一6 一i n d o l e c a r b a m i d i n e d i h y d r o c h l o r i d e d e o x yn u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e s e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y l t h i o - p d - g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n l u r i ab r o t h n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d eh y d e n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n o - p h e n y l e n e d i a m i n e o p e nr e a d i n gf r a m e p o l ya c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d e s o d i u md o d e c y ls u l f a l t e 过硫酸铵 基础局部比对检索工具 牛血清白蛋白 氯霉素 4 , 6 联脒一2 苯基吲哚 三磷酸脱氧核苷 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附实验 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 辣根过氧化物酶 异丙基硫代b d 半乳糖 苷 卡那霉素 肉汤培养基 还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸脱氢酶 美国国立生物技术信息 中心 邻苯二胺 开放阅读框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 聚偏氟乙烯 十二烷基硫酸钠 n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺 t r i s h y d r o x ym e t h y l a m i n o m e t h a n e 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l 1 三羟甲基氨基甲烷 p - 巯基乙醇 浙江理工大学硕士学位论文 第一章n a d i - i 还原酶的综述 引言 酶在生物体中广泛存在，是由活细胞产生的能促进其它物质的化学反应而其在反应完 成时，自身不被破坏或发生改变的一种特殊蛋白质( 除核酶外) 。酶被称为生物催化剂， 生物体内错综复杂的代谢反应必须在有特定酶的情况下，才能按一定规律有条不紊地进 行。国际生物化学学会酶学委员会提出的“酶的国际系统分类法”将所有已知的酶按其催 化的反应类型，分为六大类，即氧化还原酶类【1 翻、转移酶类、水解酶类、裂解酶类、异构 类、合成酶类。 辅酶【3 】是一种非蛋白质有机分子，一般是水溶性维生素的磷酸化衍生物；与脱辅基酶 蛋白分子结合，即成有活性的全酶。酶蛋白与辅酶必须结合成全酶后，才有活性。 l 酶的发现 1 8 5 7 年微生物学家p a s t e u r 等人提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果，他认为只有活 的酵母细胞才能进行发酵；1 8 9 7 年，b 0 c h n e r 兄弟用石英沙磨碎酵母细胞，制备了不含酵 母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵；1 8 9 4 年，f i s h e r 提出了 酶与底物作用的“锁与钥匙”学说，用以解释酶作用的专一性；1 9 2 6 年，美国化学家s u m m e r 从刀豆提取出了脲酶并获得结晶，证明脲酶具有蛋白质的性质；8 0 年代，美国科学家c e c h 和a l t m a n 分别发现了具有催化功能的r n a 一核酶【4 】。现代基因组学【5 1 、系统生物学以及生 物信息学扩展了发现新酶的技术平台，除了传统的生物学实验和生化方法外，用化学探针 从蛋白质组选择特定酶类等新方法取得一定的进展。 2 氧化还原酶的分类 在已知酶类中，氧化还原酶是最大的一类，按习惯分类法，这类酶可分成四种，分别 是氧化酶、脱氢酶、过氧物酶和氧合酶，这一类酶是能催化两分子间发生氧化还原作用的 酶的总称。 3 线粒体复合体和n a d i - i 线粒体作为真核细胞的重要“能量工厂”，是细胞进行呼吸作用的场所，呼吸作用包 括柠檬酸循环和氧化磷酸化两个过程，其中氧化磷酸化过程的电子传递链( 又称线粒体呼 吸链) 位于线粒体内膜上，由四个相对分子质量很大的跨膜蛋白复合体( i 【6 1 、i i 刀、i i i t 8 】 幂n l v t 9 1 ) 、介于i i i 与i i i 之间的泛醌以及介于i i i 与之间的细胞色素c 共同组成。 2 内膜 质 图1 1 线粒体呼吸链组成模式 复合物1 只是一个示意图，根据三维晶体结构得出复合物i i 、的形状，虚线箭头代 表质子跨膜的过程，实线箭头代表电子传递过程，复合物i i 通过与三羧酸循环偶联与复 合物i 、i i i 和构成了完整的呼吸链系统。其中s u c c i n a t e 表示琥珀酸；f u m a r a t e 表示延胡 索酸；u q 表示是泛醌q 。 线粒体呼吸链膜蛋白复合体i 1 0 - 1 3 】( 简称线粒体复合体i ) ，是线粒体呼吸链电子传 递系统的主要入口，在呼吸链的四个膜蛋白复合体中，复合体i 最为复杂，相对分子质量 最大，包含的亚基最多。线粒体是n a d h 的质子泵，辅酶q 氧化还原酶至少包括3 5 1 4 1 个 亚基，它的合成是在线粒体复合体和胞质溶胶中【1 5 】；这个复合体i 是线粒体电子传递和质 子转位的第一步。这些亚基被组装成l 形，它的一条臂被埋入膜内，另一条突出的臂在线 粒体基质【1 6 1 7 1 ，这两条臂被独立装配，然后连接起来形成成熟的复合物【1 8 】。 线粒体呼吸链复合体i i ( 简称线粒体复合体i i ) ，它催化三羧酸循环中琥珀酸到延胡 索酸的氧化，同时，琥珀酸的氧化与线粒体内膜中辅酶q 的还原通过电子传递所偶合，电 子通过一系列包埋在该复合体中的电子传递体来完成了从琥珀酸到辅酶q 的传递。 线粒体呼吸链膜蛋白复合体i i i ( 简称线粒体复合体i i i ) ，是一个多亚基的膜蛋白复合 体，包括1 1 条多肽链，总相对分子质量约2 4 0k d ，在生理状态下以二聚体形式存在，每个 复合体i i i 核心包含一个细胞色素b 、一个细胞色素c 1 和一个铁硫蛋白，这三个核心蛋白亚基 负责完成电子的传递、醌的氧化和细胞色素c 的还原。 线粒体呼吸链复合体i v ( c o m p l e xi v ) 是一个多亚基的膜蛋白复合体，由1 3 条多肽链 组成，总相对分子质量约2 1 0k d ，每个复合体包含两个血红素、一个铜离子和一个双核铜 离子中心。 3 浙江理工人学硕十学位论文 n a d h ，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e , n a d h ) 脱 氢酶( n a d hd e h y d r 0 2 9 e n a s e , n d ) 又称辅酶i 脱氢酶，主要存在于糖酵解和细胞呼吸作用 中的柠檬酸循环【2 0 】，是细胞能量代谢所必需的还原酶【2 1 1 。在体内呼吸链中质子位移及电子 传递中起着重要的作用，它是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特 异性免疫增强剂，对动物的有氧呼吸起重要作用f 2 2 】。 4n a d h 和n a d h 辅酶的化学结构的关系 n a d h 具有复杂的结构，n a d h 的辅酶也具有特殊的化学结构和n a d h 结合。早期人 们误认为n a d h 辅酶是1 ，2 二氢烟酰胺衍生物，直到1 9 世纪5 0 年代，人们才确定n a d h 反应 中心结构是1 ，4 二氢烟酰胺衍生物。有学者验证了上述两种模型，将两种衍生物分别和n 甲基吖啶反应，测它们反应热和吉布斯自由能，通过对两者的比较，发现热力学驱动力l ，2 二氢烟酰胺辅酶模型物反应比1 ，4 二氢烟酰胺辅酶模型物要低，但前者具有很高的活化熵， 从而导致其吉布斯自由能反而大于后者，根本原因是烟酰胺辅酶反应中心结构二氢吡啶环 2 , y _ 上的氢原子较4 位上的氢原子有较大的空间位阻【2 3 】( 图1 2 ) 。 秽洲心筲k + 咖一书删h 1 phtg)ph(ojch，ph(g) 图1 2 氢化物从n a d h 到a c r h + 的转移模型 5n a d h 细胞色素b 5 还原酶 n a d h 细胞色素b 5 还原酣2 4 - 2 7 ( b 5 r ) 是一种含黄素( f a d ) 的单链蛋白。发现有两种形 式，分别集中在不同的细胞腔隙中，一种是可溶型的，主要存在于红细胞中，由2 7 5 个氨 基酸残基组成，和高铁血红蛋白有关，另一种是膜结合类型2 8 1 ，主要结合于线粒体外膜和 内质网膜上【2 9 1 ，含3 0 0 个氨基酸残基，它是可溶型b 5 r 分子的n 端多了一个含2 5 个氨基酸残 基的疏水肽段所构成，它参加一系列的生理功能，包括脂肪酸的延长、去饱和作用【3 1 1 、 胆固醇的合成【3 2 1 、p 4 5 0 介导的类固醇和抗生素的羟基化作用【3 3 】。人n a d h 细胞色素b 5 还原 酶基因定位于2 2 q 1 3 一c i t e r ，长3 1k b ，含9 个外显子n a d h 和8 个内含子；e d n a 编码序列为9 0 0 b p 。 4 蜘基 g 浙江理? 大学硕十学位论文 图1 3a 鼠的b $ _ f a d + - - 级结构；b 复合物中n a d + 绑定的底物删 a 表明鼠的b 5 f a d + 的x 射线衍射的结果表明，n h 2 末端和f a d + 的右边相同，c o o h 末端和f a d + 的左边相同；b 表明在b 5 - n a d + 的复合物中，氨基酸残基和n a d + 关系密切。 作为电子传递蛋白，细胞色素b 5 参与生物体组织中一系列重要的氧化还原反应，如类 固醇和脂质的合成代谢等【3 5 】。近年来的研究还发现，在细胞调亡中，它可能也存在着一定 的作用【3 6 】。 6n a d h 突变引起的疾病 n a d h 基因突变在临床上可导致常染色体隐性遗传性高铁血红n a d h 蛋白血症 ( r c m ) 。它在体内以两种形式存在：胞浆可溶型和膜结合型【3 7 1 ，前者主要存在于红细胞浆 内，可将生理状态下缓慢生成的高铁血红蛋白还原成正常( 亚铁) 血红蛋白；后者广泛分布 于组织细胞，主要结合于线粒体外膜和内质网膜上，可参与多种生化活动。 遗传性高铁血红蛋白血症是一种常染色体隐性遗传性疾病，位于第十三号常染色体， 它包括九个外显子 3 7 1 。通常是由患者的n a d h 细胞色素b 5 还原酶缺陷所致【3 8 1 。近年来通 过对该病的患者进行生物化学、免疫学及分子生物学研究，共发现六种新的突变基因型【3 9 1 。 将临床和分子特征进行分析比较，n a d h 细胞色素b 5 缺失分两种情况，i 型是发紫表现， 是可溶型n a d h 细胞色素b 5 还原酶缺乏；i i 型是发紫和重度精神问题，并且发育迟缓( 智 商2 0 一3 4 ) ，这种情况是可溶型和膜结合型n a d h 细胞色素b 5 还原酶缺失。 7 展望 n a d h 4 0 】作为一组保守的酶蛋白，在生物学上具有独特的特性与功能，它广泛地参与 了生物体内多种复杂的生理活动。n a d h 蛋白家族与一些人类疾病有重要的关系，如染色 体隐性遗传性高铁血红蛋白血症是由于缺少n a d h 细胞色素b 5 还原酶；n a d p h 氧化酶 浙江理丁大学硕士学位论文 活化产生r o s l 4 1 1 ，形成氧化应激，影响肾脏血流动力学、肾内基质重构及信号转导等系统， 参与糖尿病的发生发展【4 2 1 ，所以使其具有广阔的蛋白药物开发前景。 近年发展起来的r n a 干扰技术来治疗基因疾病，是在基因转录水平上的r n a 干扰 ( r n a i n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 、由双链r n a 介导的、在转录水平上进行基因阻断的新技术， 对治疗n a d h 细胞色素b 5 还原酶缺失，将是一种新的方法。 随着家蚕e s t 文库的进一步完善以及家蚕全基因组图谱的完成【4 3 删，家蚕【19 】作为继果 蝇后的又一模式生物引起众多领域研究人员的兴趣与重视。家蚕领域n a d h 蛋白的功能研 究有可能成为家蚕乃至昆虫功能基因组研究的一个热点。 6 浙江理t 大学硕士学位论文 第二章实验方案设计 1 实验目的和意义 从本实验室构建的家蚕蛹c d n a 文库e p t 4 5 】获得一条4 3 8b p 的基因序列，将其命名为 b m n a d h b 5 。在e c o l ir o s e t t a 中表达重组质粒的p e t - 2 8 a ( + 1 b m n a d h b 5 。采用亲和层析的 方法纯化融合蛋白b m n a d h b 5 ，并用b m n a d h b 5 蛋白免疫雄性新西兰大白兔，进行多克 隆抗体制备。间接e l i s a 法检测抗体效价在1 ：1 2 8 0 0 以上，用e l i s a 半定量法和w e s t e r n b l o t 检测抗体在各组织和各时期的表达。同时利用荧光定量p c r 技术检测该基因在家蚕不 同发育时期和五龄幼虫不同组织器官的转录水平。 该研究为今后深入研究b m n a d h b 5 在家蚕生长、发育过程中的功能提供依据，也为 研究家蚕b m n a d h b 5 在复合体中的作用打下坚实的基础。 2 实验流程 1 b m n a d h b 5 基因o r f 序列的获得； 2 该o r f 序列所编码的蛋白质的氨基酸序列特征的分析： 3 重组表达质粒p e t - 2 8 a ( + ) b m n a d h b 5 的构建； 4 重组表达质粒在大肠杆菌e c o l ir o s e t t a 中的表达； 5 表达产物的纯化；。 6 多克隆抗体的制备与效价测定； 7 该蛋白在家蚕各时期和五龄幼虫各组织的分布情况的研究； 8 b m n a d h b 5 在家蚕发育各时期及五龄幼虫各组织中的转录、表达情况的分析； 9 b m n a d h b 5 在家蚕细胞b m n 中分布的研究。 7 浙江理t 大学硕士学位论文 第三章生物信息学分析 本章利用一些生物学分析软件和生物网站进行b 蒯憎删m 基因分析和蛋白分析。通过 对各种生物基因序列的分析，我们可以得到很多有价值的生物信息，继而来分析研究。 本章利用网络资源和一些生物信息学软件对b m m 删乃5 基因进行全面深入的生物信 息学分析。主要是对基因组研究相关生物信息的获取、加工、分析和解释过程闱。通过生 物信息学分析，我们可以从各种生物序列数据中挖掘出有价值的生物信息，以获取基因信 息、蛋白质结构及预测序列相关特征、功能等。从本实验室构建的家蚕蛹c d n a 文库中获 得一条4 3 8b p 的基因序列，序列比对后推测为它是n d u f - b 5 家族的一个亚基，将其命