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f y 互2 5 5 5 工业循环水处理中泄漏含油介质 的生化处理 摘要 在工、1 2 循环水处理中，应用生物技术来处理系统中泄漏的含油介质是一个新课 题。从含油污泥中分离、筛选、纯化出来的石油降解菌n 一1 和n - 2 ，经过一定过程的 驯化厉，可在t - 3 9 。c ，p h = 9 0 ，兼性厌氧的条件下生长繁殖，基本适应了循环水系 统的生氏环境，且列系统中泄漏的含油介质具有一定的降解能力。通过形态学观察和 一系列的生理生化特征实验，n l 鉴定为节杆菌属，n 一2 鉴定为假单胞菌属。 实验结果表明：当降解u , t f j 为5 天，每l o o m l 水样中接入5 m 菌悬液时，降解率 可达到最大值，之后降解率趋于稳定，基本保持不变。n1 剥l5 4 机械润滑油和原油 的最大降解率分别为7 5 3 和6 82 ：n - 2 对l j 。机械润滑油和原油的最大降解率分别 为8 2 5 和7 7 9 ，| l 降解率足随着接种菌量的增大而先增大后减小的。在较低的浓 度范围内( 5 0 0 m g i 。) ，菌种的降解能力不随含油介质浓度的变化而变化。同 时n 一1 和n 一2 与循环水系统中的缓蚀剂之问没有明显的相互影响，且氧化型或非氧化 型杀菌剂对nl 和n 一2 都具有较好的杀菌效果。 关键词：工、i k 循环水，石油降解菌，节杆菌属，假单胞菌属，含油介质，降解率 t h eb i o c h e m i c a lt r e a t m e n to fl e a k i n go i l c o n t a i n i n gm e d i u m i nt h ei n d u s t r i a lr e c i r c u l a t i n gw a t e r a b s t r a c t i nt h ei n d u s t r i a lr e c i r c u l a t i n gw a t e rt r e a t m e n t ，i ti san e ws u b j e c tt ot r e a tl e a k i n g o i l c o n t a i n i n gm e d i u mw i t hb i o l o g i c a lt e c h n i q u e b yt h ep r o c e s so fd o m e s t i c a t i o n ，t h e p e t r o l e u md e g r a d i n gs t r a i n sn la n dn - 2w h i c ha r ei s o l a t e d s c r e e n e da n dp u r i f i e df r o m o i l c o n t a i n i n gs l u d g ec a ng r o wu pa n db r e e du n d e rt h ec o n d i t i o no ft 5 3 9 c p h 2 9 0 a n df a c u l t a t i v ea n a e r o b i cc u l t u r e t h e ya r ea d a p t e dr a d i c a l l yt ot h eg r o w t he n v i r o n m e n to f r e c i r c u l a t i n gw a t e rs y s t e m a n dh a v ec e r t a i nd e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yf o rl e a k i n go i l - c o n t a i n i n g m e d i u mi nt h es y s t e m t h r o u g hm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n das e r i e so fp h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e re x p e r i m e n t s ，n - 1a n dn - 2a r ea p p r a i s e dt ob ea r t h r o b a c t e rs p a n dp s e u d o m o n a s s p r e s p e c t i v e l y t h e e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w t h a tw h e nt h es t r a i ns u s p e n s i o nw h i c hi si n o c u l a t e di n t o 10 0 m ls a m p l ei s5 m la n dt h ed e g r a d a t i o nt i m ei s5d a y s ，t h ed e g r a d a t i o nr a t er e a c h e st h e m a x i n m mv a l u ea n dt h e na p p r o c h e st ob es t e a d y t h em a x i m u m d e g r a d a t i o n r a t eo fn li s 7 53 a n d6 8 2 f o r15 。l u b r i c a t i n go i la n dc r u d eo i l r e s p e c t i v e l y c o r r e s p o n d i n gf i l e m a x i m u md e g r a d a t i o nr a t eo fn - 2i s8 2 5 a n d7 7 9 r e s p e c t i v e l y t h ed e g r a d a t i o nr a t e i n c r e a s e sf i r s ta n dt h e nd e c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s eo fi n o c u l a t e ds t r a i n q u a n t i t y i nt h e r a n g eo fl o w e rc o n c e n t r a t i o n ( 5 0 0 m g + l 。1 ) ， t h ed e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yo fs t r a i n sd o e sn o tc h a n g ew i t ht h ec h a n g eo f o i lc o n c e n t r a t i o n a tt h es a m et i m e ，t h e r ei sn oo b v i o u sm u t u a ji n f l u e n c eb e t w e e nn 一1o rn 一2a n dt h e c o r r o s i o ni n h i b i t o ri nt h er e c i r c u l a t i n gw a t e r s y s t e m a n dt h eo x i d i z i n gt y p eb a c t e r i c i d eo r n o n o x i d i z i n gt y p eb a c t e r c i d eh a sa b e t t e rb a c t e r i c i d a le f f e c tf o rn 一1a n dn - 2 k e y w o r d s ：i n d u s t r i a lr e c i r c u l a t i n gw a t e r , p e t r o l e u md e g r a d i n gs t r a i n s ，a r t h r o b a c t e rs p p s e u d o m o n a s s p ，o i l c o n t a i n i n gm e d i u m ，d e g r a d a t i o nr a t e 硕士论文 ：业循环水中泄漏含油介质的生化处理 1 引言 随着近代工业的发展而逐渐成为主要能源石油的大量开采和应用，以及石油 化工生产的迅速发展，人为地使大量石油及其制品进入环境，打破了自然界原有的生 态平衡，造成了严重的污染。概括起来大致有下列几种原因： ( 1 ) 油船在运输过程中发生海难事故。 ( 2 ) 沿海石油钻探过程的漏油事故。 ( 3 ) 清洗油船的储油罐所排放的污水。 ( 4 ) 石油化工工业和炼油工业排放的污水。 ( 5 ) 汽车清理的污油。 ( 6 ) 输油管线的管道破裂。 油污染的直接影响是使水中鱼群绝迹，或使水产资源如鱼、虾等体内受污染而不 能食用。内陆河道油污染的主要危害，是污染了与人类生活最密切相关的水源。 为了消除石油污染，微生物学者与其他学科工作者一道进行了大量研究，揭示了 在自然界净化石油的综合因素中，生物降解起着重要作用”。根据1 9 8 3 年版的中 国大百科全书环境科学卷，生物降解是指土壤、水体和废水生物处理系统中的需 氧微生物对天然合成有机物的破坏和矿化作用。随着对有机污染物生物降解过程研究 的深入，生物降解的内涵也有深化和扩展。目f j i 在环境科学界，所谓生物降解 ( b i o d e g r a d a t i o n ) 就是通过生物的作用将污染物分解成小分子化合物的过程。这里 生物类型包括各种微生物、高等植物和动物。虽然高等植物和动物能够代谢和降解许 多有机化合物，但对另外一些有机污染物却往往不具有降解能力，而微生物却具有将 大多数有机物降解为无机物质( 水、二氧化碳和矿物质) 的潜力，所以微生物是有机 化合物生物降解中的第一因素。“。 微生物具有以下几个特点： ( 1 ) 个体微小，比表面积大，代谢速度快。 ( 2 ) 种类繁多，分布广泛，代访 类型多样。 ( 3 ) 能合成降解酶。 ( 4 ) 繁殖快，易变异，适应性强。 ( 5 ) 体内有调控系统质粒。 ( 6 ) 共代谢作用。 以上这些特点都使得微生物具有降解转化污染物的巨大潜力。 石油是链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量非烃化合物的复杂混合物。石油的生物 降解性因其所含烃分子的类型和大小而异”1 ，从最简单的c 化合物至复杂的几十个碳 原子的固体残渣，只要条件合适，均可以被微生物代谢降解，只是难易程度与降解速 度不同”。一般者之，链长度中等( c i - - c 。) 的链烷最易降解，短链烷对许多微生物 硕士论文工业循环水中泄漏含油介质的生化处理 有毒，不过它们通常很快从油中蒸发，很长的链烷对微生物的抗性增强。从烃分子类 型看，链烃比环烃易降解；不饱和烃比饱和烃易降解：正构烷烃比异构烷烃易降解； 直链烃比支链烃易降解，支链烷基越多，微生物越难降解，链末端有季碳原子时特别 顽固：多环芳烃很难降解或不降解”1 ；脂环烃对微生物的作用最不敏感。在烷烃中c 一 c ，化合物如甲烷、乙烷、丙烷只能被少数具有高度专性的微生物所利用。石蜡可被 微生物降解，但含碳原子3 0 个以上者则较难，这是因其溶解度较4 、的缘故。在芳香 物中，苯的降解极难，要比烷基代苯类及多环化合物慢一些。对石油中沥青组分的降 解情况则知之甚少”1 。 微生物处理有机污染物的能力是巨大的，但在自然条件下，在一定的空间和时间 内其降解能力是有限的，受许多因素的影响： ( 1 ) 碳氢化合物的种类不同，微生物对之降解的速度也不同。 ( 2 ) 烃类化合物的溶解度是生物降解的重要限制因素。 ( 3 ) 微f l 物不同菌群对原油的降解能力不同，也是影响降解速度的重要因素。 ( 4 ) 温度、压力、溶解氧以及营养物等都是微生物降解烃类化合物的影响因素。 已知自然界中，存在许多能够以石油或其化工产品为碳源和能源的微生物，它们 能够降解石油为无机物质”1 。v e c c h i o l i g 报道了通过添加土著微生物增强石油降 解的能力。s o r k h o nn a ”j 等从科威特被石油污染的土壤与海滩中分离出p s e u d o m o n a s s p ，r h o d o c o c c u ss p ，s t r e p t o m y c e ss p ，e n t e r b a c t e r i a c e a e ，b a c i 1l u ss p 和 n o c a r d i as p ，其中以r h o d o c o c c u ss p 含量最高、除油能力最强。据统计，迄今为 止，已经发现能降解石油中各种烃类的微生物共约1 0 0 余属，2 0 0 余种，它们分属于 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌以及藻类。 ( 1 ) 细菌：有假单胞菌属、棒杆菌属、微球菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、无色杆 菌属、节栩：菌属、不动杆菌属、小球菌属、弧菌属等属中的某些菌株。其中对最常见 的假乖胞菌研究较多，已发现多种降解烃类的质粒，并曾用于基因工程中。不论对乙 烷、丙烷、丁烷等短链烃或长链烃与芳烃的降解，均有不同的假单胞菌参与，并可使 烷烃彻底降解。 ( 2 ) 放线菌：主要是诺卡氏菌属和分枝杆菌属，尤以曲者更为突出，但对烃类降解 常不彻底，有中问物累积。 ( 3 ) 酵母菌：有假丝酵母属、红酵母属、球拟酵母属、酵母菌属等属中的菌株，以 假丝酵母( 主要是解脂甲丝酵母和热带甲丝酵母) 最为广泛。有人研究5 0 0 种酵母中， 5 5 种能降解石油，几乎全为假丝酵母。由于它营养要求不高，只需要有n 地或n o 。 等无机氮素存在，不需要生长素类物质，故常以假丝酵母分解石油而生产酵母蛋白质。 ( 4 ) 霉菌：有青霉属、曲霉属和枝孢霉属等，最早报道的石油降解微生物就是株 灰绿葡萄孢霉，能使一薄层石蜡降解。 硕十论文l ：业循环水中泄漏含油介质的生化处理 ( 5 ) 藻和蓝细菌：近年来发现绿藻和蓝细菌也可降解多种芳烃，尤其是蓝细菌似乎 具有氧化多种芳烃的能力”。“。 有关石油烃的微生物降解研究，大多注重于降解石油烃及其相应化合物的微生物 类型和分布，以及微生物降解石油烃的能力等方面。例如：陈庆涛等“”从北京采样 的变质石油和从广东省茂名市油田地下管道污水样品中，分离到能利用石油作唯一碳 源的两株镰刀菌。中科院微生物研究所烃代谢组”1 对微生物的正烷烃代谢进行了详 尽研究，其中包括假丝酵母的正烷烃代谢产物的研究和长链酯在酵母菌正烷烃发酵中 的消长等两个方面。凌代文等“”从海南岛崖城温泉土壤中分离得到4 8 2 株耐高温的氧 化烃细菌，选用三种油品及三个发酵时间进行了摇瓶试验，从中筛选出脱蜡效果较好 的两株菌( 定名为嗜热棒杆菌和脱蜡棒卡t 菌) ，能将中质润滑油的凝固点从2 6 c 下降 到一3 7 c 。刘志培等1 从活性污泥中分离得到一株细菌a n 3 ，能以苯胺为唯一碳、氮 源和能源生长，苯胺的最高降解浓度达5 0 0 0 m g 一以上，鉴定为食酸丛毛单胞菌。 a n 3 还可以降解乙酰苯胺，但不利用其他取代类苯胺。 另一方面，利用微生物处理土壤和水环境中石油烃污染物的有关报道也不少。例 如：1 9 9 7 年，k i e s e el a n gu l r i k e “”和s i d o r o vd g “”分别利用土著微生物处理被焦 油和原油污染的地下水和土壤，效果显著。其中受原油污染土壤在接种土著微生物 两年后，对含油样地的除油效果较好，除油率可达7 8 。白威等“对炼油废水中乳化 念石油进行了生物除油研究，分离筛选了，+ 组降解石油的微生物，并培养形成性能良 好的活性污泥菌剂，可将废水中1 4 0 m g 的乳化态石油降解到3 0 m g l 。以下，为生 物除油代管絮凝浮选除油提供了实用方法和依据。谢思琴等“”利用自行筛选的动胶菌 株，以生物接触氧化法对含机械涧滑油的废水进行处理后，水质达到国家二级以上的 排放标准。郑少奎等“”从含油土壤中筛选出适用于色拉油加工废水的酵母菌菌群，并 用摇瓶试验研究了该菌群对未经预处理的高浓度色拉油加工废水的降解效果。 对于嗜油微生物的分离与筛选工作同样是微生物学工作者普遍研究的问题。例 如：赵荫薇等”0 1 从石油污染地分离出i o 株除油菌，经测定单菌株的除油率在2 0 5 0 ，混合菌群m z 9 4 0 2 的除油率可达7 1 4 。a p r i lt m 等”从石油污染土壤中分离出 4 株能够降解石油的p s e u d a l l e s c h e r i ab o y d ij 菌，并对其形态、菌落特征、菌落大 小、孢子形成等进行了研究，其中3 株能够降解线形脂肪族石油烃，另1 株能够降解 挥发性的链烷烃而不受伤害，如乙烷、丙烷、丁烷等。s h i r a ik a t s u h is a 等“”从 m iz u s h i m a 海湾被石油污染的海水中分离出l 株除油能力较强的酵母菌( c a n d i d as p m 2 3 2 ) 。金梁等”3 】从石油污染土壤中分离、筛选出可降解机油的3 株细菌：动胶菌属， 氮单胞菌属和假单胞菌属。在利用动胶菌处理含2 0 。机油的废水模拟试验中，除油率 达9 0 5 4 1 0 0 。朱怀兰等”“、田雷等”分别对降解微生物的分离、筛选及检测技术 作了专门研究。 硕卜论文l l , j k 循环水中泄漏含油介质的生化处理 近2 0 年发展起来的生物修复技术，在治理石油污染物方面也得到了广泛应用。 例如：p e r l em 1 对柴油、k i e s e l el a n g u l r i k e “”对芳香烃、d e yj e f f r e yc ”“和 n o c e n t i nm a s s i m o 对煤油、t t u r tk e l l y 1 和r u t h e r f o r dp m 。对木榴油( 杂酚油) 的生物降解都取得了显著的效果。 以上这些研究工作都说明了微生物降解对消除石油污染起到了重要作用，而且正 受到世界范围内的普遍关注，相关研究也十分活跃，但是将其应用于工业循环水处理 上的研究还未见报道。 存石化、冶金企业的工业循环水处理中，m 于装置老化、检修质量、密封技术、 操作不当等原因，往往会引起系统中的介质泄漏，以至于循环水中含有大量难降解的 有机物，从而导致水质恶化、管道腐蚀、菌藻滋生等一系列严重问题，对管道、设备 危害很大“+ 3 “。泄漏的有机物成份相当复杂，其中含油介质的泄漏最为普遍，且处理 时有一定难度，所以此问题已引起了人们的高度重视。日前，各企业基本上都采用了 在循环水中投加除油剂的方法来处理。由于通常所使用的除油剂存在若干问题：水体 的二次污染，除油剂与系统中缓蚀阻垢剂的配伍性以及除油剂的价格因素等，因此我 们提出了一个新课题：应用生物技术来处理泄漏的含油介质。采用微生物降解的处理 方法具有范围广、污染小、残留少、安全可靠、经济高效、降解完全等诸多优点，更 重要的是可以直接达到无害化。冈为微生物可把大多数有机化合物最终降解为无机物 质一一：氧化碳和水，所以该研究课题具有良好的j 、v 用| j i 景和推广价值。 综上所述，生物技术在环境领域的应用已经相当普遍和成熟，应用微生物降解原 理治理被污染的环境所具有的潜在优势也得到r “泛认l 玎。但是其在一i 业循环水处理 j ：的应用还是空白。本课题正是看到了这。空门点选用了循环水中经常泄漏的两种 含汕介质( 1 5 。机械润滑油和原油) ，经选择性增殖培养、纯种分离、初筛、复筛、再 复筛、性能鉴定等步骤，分离、筛选出能够降解泄漏的含油介质，适应循环水系统， i ；j 易于生长繁殖的石油降解菌( 目前国内还没有号门用于t 业循环水处理上的石油降 解菌) 。同时确定了影响菌种降解能力的因素，选择了最佳实验条件，并刑菌种与循 环水系统中的各种水处理剂之问的相互影响做了实验研究。 本文将分为以下几大部分来论述：( 1 ) 微生物降解动力学及降解机理；( 2 ) 菌种 的选育、驯化与保藏；( 3 ) 菌种的生理生化特征实验及鉴定；( 4 ) 影响菌种降解能力 的因素：( 5 ) 菌种与各种水处理剂之i 、日j 的相互影响；( 6 ) 结论。 硕士论文工业循环水中泄漏含油介质的生化处理 2 微生物降解动力学及降解机理 2 1 微生物降解动力学。“ 有机化合物的微生物降解动力学一直是研究者的热门课题，人们在不断致力探索 各种情况下有机化合物的微生物降解速度模型。目前关于微生物降解有两个基本方 程，个是用于描述降解微生物群体在污染物生物降解过程中的生长，称为双曲线规 律；另一个是用于描述污染物的降解与时间的关系，称为幂指数规律。 牛物降解速率是微生物群落浓度和有机污染物浓度的函数。要使污染物能较为明 显地降解，就必须有足够的微牛物存在，此外对单一培养基质，还必须有足够的污染 物存在，以保证微生物细胞的大量增值，使微牛物群落得以延续。在理想条件下( 微 q i 物群落和营养物的量足够大) ，微牛物的增长速率受微牛物细胞再生速率的限制。 2 1 1 双曲线规律 有机污染物的牛物降解速率，通常可以用微牛物的增长速率来表示。这罩，假定 所有消耗掉的污染物完全转变成微牛物增长的重量，而且只有单种营养物可以被利 用，那么微牛物增长的速率和培养基质浓度之间的关系可由 “o n o d 方程来描述( 双曲 线规律) ： p = 帅丽s ( 2 1 ) 式中：u 微牛物的增长速率，它代表单位质量牛物的增氏速率，单位为日r j 问。； 。一微牛物的最大增长速率，单位为时间； s 污染物或培养基质的浓度，单位为质量体积； k s 对应于增长速率“= p 2 时的污染物浓度。 在低培养基质浓度条件下，微牛物增长速率随着基质浓度的增加而线性增加。在 高壤质浓度条件f ，增长速率接近并保持极瞅增长速率而与基质的浓度无关。通常， 降解作用及微牛物增长是由许多酶的催化作辟j 实现的，所以对酶反应来说，可用 m i c h a e l e s 一 l e n t e n 方程代替m o n o d 方程。这两个方程的数学形式是一致的，其不同 点在于两个方程中的参数和变量不同。m o n o d 方程仅适用于特定的微牛物增长过程， 而m ic h a e le s m e n t e n 方程则适用于基质反应速率受酶催化影响的普遍牛物化学过 程。 根据微牛物增长过程( 应用m o n o d 方程) ，污染物的浓度和混合种属微牛物菌落 的数量以及有机化合物的生物降解速率之间的关系可以用下列公式表示： 刈8 d r 叫( x y ) _ “志删y ) 瑙6 煮 2 ) 式中：k 降解速率为最大值一半时的基质浓度； s 污染物或基质浓度，单位为质量体积； 5 硕十论文 ，：业循环尘! 娑塑皇兰! 垦竺竺兰竺! 一一 k 。生物降解速率常数，单位为时问； y 生物产量，等于单位数量化学物质生产的生物量，又称为产率系数； x 单位体积的生物量，单位为质量体积。 常数i t 一，k b 和y 是由环境温度、微生物种类和其他共存营养物等因素决定的。 例如：消耗单位数量的污染物而生产的生物量y ，就依赖于吸收作用的强弱和基质转 化为细胞成份的容易程度。y 的水平随着微生物的种类、污染物的化学结构和体系的 环境条件而变化。 对于污染物生物降解速率，上面的动力学方程在许多特定环境条件下可以加以简 化。 ( 1 ) 在污染物浓度较高的条件下，s k s ，方程可简化为如下形式： 一d s d t = k b x ( 2 3 ) 在这种情况下，生物降解速率是一级的，并且仅与生物量大小有关。 ( 2 ) 在污染物浓度较低的条件f ，s ( 爷 。：o 硕十论文j ：业循环水中泄漏含油介质的生化处理 产生具有双键的加氧化合物，最终形成饱和或不饱和脂肪酸。然后再经b 一氧化进入 三羧酸循环而被完全分解。可从饱和末端或不饱和末端接受氧化分解，但研究表明： 反应中由1 ，2 一羟基化合物被氧化的情况很少，所以一般认为是饱和末端甲基受到氧 化。反应式为： h ，3 c r c h 2 c h 2 u 一氧化 h o c h 2 r c h = c h 2c h l r c h c h ，一c h l r c h c h ， t h o o c r c h = c h ， + b 一氧化 vf o0 1 ho h 环氧( 1 ，2 羟基化合物)( 2 1 0 ) + c h 3 r c h 2 c o o h 1 0 氧化 2 2 4 芳烃的微生物降解 芳烃类化合物一般对微生物代谢有抑制作f j 能使菌体凝集而生长受阻。但在一 定浓度下，也能被一些细菌、放线菌所降解。 芳烃加氧酶氧化为儿茶骱， 1 黔甚化的片乔”f i f 氧化，邻何或问f 妒j lj + 。邻付 珥牛哎l 烯 酸，i l 氧化为p 酮l 酸， ，j 名l l f 氰化为羧酸循叫、的t 1 ，州，“物 琥j 1 1 酸和乙酰j = l j 嗍a 。f hj t z ) i 。牛成2 y tl ! 烯、f 醚酸，逊 步代谢牛成f f 酸、乙 酚和丙酮酸。反应式为： 3 器 cj o 崂裂 m z h 嵘洲 +o 叫3 o 洲 h c 二u l ；hh l 邻位开外 黜 卜 o 旷、c o o l t l c o o h ( 211 ) ft c o a t h o o c - - c h ，一c h 厂c 0 0 h c h 3 8 c o a o 2 2 5 多环芳烃的微生物降解 多环芳烃的生物降解，先是一个环一二羟基化、丌环，进一步降解为丙酮酸和c o 。 然后第二个环以同样方式分解。以萘为例反应式为： 硕十论文 工业循环水中泄漏含油介质的生化处理 一 ：一 器刚卫 ：。 ( 2 1 2 ) 以下的图2 1 和图2 2 是存实验中选_ = | 的两种油介质( 1 f 机械润滑油和原油) 的红外光谱图。 图2 1i 5 。机械润滑油的红外光谱图 4 0 0 03 5 0 03 0 0 02 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 05 0 0 被拽( c m ) 图2 2 原油的红外光谱图 分析以上两张谱图可以看出：1 5 。机械润滑油和原油的化学结构基本相同，不含 有不饱和的c - - c 键，均为饱和的链烷烃或环烷烃，应符合2 2 i 节或2 2 2 节所述 的链烷烃或环烷烃的微生物降解机理。 1 0 ooco i p + 一 ch 0 一 i 。 一卜 ， 0 0 o 享一廿爿蚓 硕士论文j ：业循环水中泄漏含油介质的生化处理 3 菌种的选育、驯化与保藏 3 1 主要仪器、设备 名称型号生产厂家 电热恒温培养箱d h p 一9 0 8 2上海医用恒温设备，+ 恒温振荡器t h z 8 2江苏太仓实验设备厂 生物显微镜江南x s 一1 8南京江南光电股份有限公司 无菌操作台s w j i f苏净集团 电热压力蒸汽消毒器y x q s g 4 l 2 8 0上海医用核子仪器厂 海尔电冰箱 b c d 一1 8 0 i ：青岛海尔电冰箱股份有限公司 紫外可见光谱仪c a r y 一1 0 0美国瓦里安公司( v a r i a n ) 分析天平上海天平仪器厂 电热恒温水浴锅h h s8上海浦东荣丰科学仪器有限公司 电热恒温干燥器2 0 2 0上海沪南科学仪器联营厂 p h 酸度计p h s - 2上海第二分析仪器厂- 3 2 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的三株纯菌种”1 1 2 0 7 解脂假丝酵母( y a r r o w i a 】i p o l y t ic a ) ，用于石油脱蜡、降解原汕，麦芽汁 琼脂培养基，2 5 2 8 。c 培养。 1 5 0 4 嗜热棒十i ：菌( c o r y n e b a c t e r iu mt h e r m o p h ilu m ) ，用于石油脱蜡、降解原油， 营养肉汁琼脂培养基，3 0 c 培养。 4 4 8 9 嗜石油腐皮镰孢( f u s a r i u ms o l a n iv a f p e t r o l i p h i l u m ) ，用于石油脱蜡、 降解原油，p d a 培养基，2 5 2 8 c 培养。 3 3 从自然界筛选获得新菌种 3 3 1 采样 采样应根据筛选的目的，微生物分伽情况，菌种的j ：要特k k ；e ：e 态等i n 素，确 定具体的时削，环境和目标物。根掘本实验的具体情况， 要目的是耍筛选出能够降 解4 i a t t 的菌利t 。因此，选择了某水处壁l ! 一的含油污泥区为采样地点，取离地面5 1 5 c m 处的 二样几克，盛于预先灭菌的牛皮袋中扎紧，并标明h , j 问、地点和明：境等情况，以 备查考。 3 3 2 增殖 在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率， 常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所 需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养，其实质是使天然样品中 的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离m ，。因此，在实验中 配制了特殊的含油培养基，将1 5 4 机械润滑油或原油作为唯一碳源，从而使石油降解 硕士论文 工业循环水中泄漏含油介质的生化处理 菌大量增殖。 3 3 2 1 含油培养基的配制 用1 5 。机械润滑油或原油作唯一碳源的矿质培养基：( n 叱) ：s o 0 5 9 ；n a n o 0 5 9 ； c a c l 。0 0 2 9 ；m g s o ，0 2 9 ；k h ：p o 。1 o g ；n a h ：p o h ：o1 o g ：琼脂2 0 9 ：蒸馏水1 0 0 0 m l ； 1 5 。机械润滑油或原油o 5 9 ，p h = 7 0 ，灭菌后待用。 3 3 2 2 增殖培养基的配制 胰酶酪蛋白1 5 9 ；植物蛋白胨或大豆蛋白胨5 9 ；n a c l5 9 ；琼脂1 5 9 ：蒸馏水 1 0 0 0 m l ，o h = 7 1 7 5 ，灭菌后待用。 3 3 2 3 筛选过程 ( 1 ) 称取5 9 土样( 湿重) 粉碎，加入装有l o o m 无菌水的三角烧瓶中，浸泡2 天至 土壤全部分散开。 ( 2 ) 将土壤浸出液按l o 。，l o ，1 0 ，1 03 ，1 0 1 的梯度稀释，用涂布法分别接种到配 好的含油培养基上，在电热恒温培养箱中2 8 c 培养。 ( 3 ) 4 天后1 0 0 培养基上菌落长成。 ( 4 ) 在显微镜下观察长成的菌落，将形态不同的两株菌落分别挑至增殖培养基上，进 行纯化培养【= 。 3 3 3 纯化 增殖培养的结果并刁i 能获得微化物的纯种。即使在增殖培养过程中发话1 了i ；1 ：多限 制因素，但其他微生物并没有死去，只是数量相对减少，一旦遇到适宜条件就会快速 生长繁殖。故增殖后得到的微生物培养物仍是个各类微生物的混合物。为了获得某 一特定的微生物菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多， 大体可将它们分为二个层次，个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从 “利，”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂析i 分离法和稀释分离法“：。本实 验中即采用这种方法。另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，它可达到细胞 纯即“菌株纯”的水平，其方法有很多，但就我们现有的实验条件而苦，操作起来难 度较大。 为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养应控制增贿条件外，在纯种分离时 也应控制适宜的培养条件并选用特异的检d 方法和筛选方案w 。 3 3 3 1 平皿划线分离法 ( 1 ) 接种环火焰灭菌，冷却后( 至少4 秒) 挑取样品。 ( 2 ) 左手掀开皿盖，右手持接种环，自皿的边开始轻轻来回划线，开始条纹间密 些。 ( 3 ) 划线时千万别将琼脂划破，或划到琼脂内部，这是第一次划线区。 ( 4 ) 将接种环火焰灭菌，然后冷却几秒钟。 1 2 硕士论文1 ：业循环水中泄漏含油介质的生化处理 ( 5 ) 将培养皿转一个向，接种环从第一次划线区划一条，继续如前在第二区划线。 ( 6 ) 接种环再次火焰灭菌，再从第二区划出一线，在第三区前划线，放置培养箱内 待观察。”1 。 3 3 3 2 纯化过程 将分离筛选所得的两株菌经平皿划线分离法后，置于2 8 培养箱f j ! | 。4 8 小时后取 出观察，发现菌苔丰满，生长旺盛。重复几次平皿划线分离法后，平皿上有多个单菌 落长成，且各菌落的形态，颜色，质地都一样。从每个平皿上挑出几个单菌落移至营 养肉汤培养基斜面上，置于冰箱冷藏室( 4 ) 保存。 经过以上的采样、增殖、纯化后，就从含油污泥中获得了两株纯种石油降解菌， 分别编号为南理工1 号( n - 1 ) 和南理工2 号( n 一2 ) 。 3 4 菌种的驯化 购买来的3 株用于石油脱蜡、降解原油的纯菌种以及从含油污泥中获得的2 株 石油降解菌并不能适应循坏水系统的生长环境，必须对菌利，进行驯l 化。驯化是一种定 向选育微生物的方法与过程，它通过人工措施使微生物逐步适应某种特定条件，最后 获得具有较高耐受力和代谢活性的菌种。就菌种的生长环境而占，循环水系统有其自 身的特点： ( i ) 温度：循坏水的进出 1 温度一。般在3 0 。c 4 0 。c 之i 、日j ，应将菌利，驯化至在此温度 卜，l 长繁殖旺盛。 ( 2 ) p h 值：循环水的p h 值一般在8 0 9 0 之间，应将菌种驯化至适应碱性生长环 境。 ( 3 ) 半封闭半敞丌的系统( 管道内封闭，冷却塔敞丌) ，适应兼性厌氧微生物的生长。 因此驯化的主要目标是：提高菌种培养的温度及p h 值，控制培养过程中的溶解 氧最，从而使菌种能逐步适应循环水系统的，卜长环境，可在其中大量繁殖，迅速降解 水中泄露的含油介质。 3 4 1 温度 取5 个洁净的无菌摇瓶，分别加入含汕培养基1 0 0 m l 后，接入1 2 0 7 、1 5 0 4 、4 4 8 9 、 n 一1 、n 一2 等5 株纯菌种，嚣于恒温振荡器一h 控制温度为2 9 c ，转速为1 5 0 转分。 培养4 天后规察发现，5 株菌种均生长良好。同样的操作步骤，将这5 株纯菌种以1 为问隔逐步提高培养温度，发现到3 2 。c 时，1 2 0 7 、4 4 8 9 先停止生长；到3 5 c 时， 1 5 0 4 也停止生长。而n 一1 和n 一2 仍生长旺盛，在培养基中凝聚成肉眼可见的絮状物， n l 为灰白色，n 一2 为灰色，菌体自由浮动，分布均匀。继续提高培养温度，到3 9 c 4 0 c 时n - 1 n - 2 的生长速度先后减慢：到4 0 c 4 2 。c 时肉眼已看不到n - 1 n - 2 菌 体的明显生长，但培养基仍变浑浊；到4 l 4 3 c 时n 一1 n2 先后完全停止生长。 由此可知：在现有的实验条件下，4 0 。c 4 2 c 是n 一1 n 一2 的最高生长温度。 硕十论文x l , j k 循环水中泄漏含油介质的生化处理 3 4 2p h 值 将含油培养基的p h 值调至7 5 ，接入菌种，培养4 天后观察，5 株菌种均生长良 好。以0 5 为问隔逐步提高p l f 值，当p h - 8 5h 1 ，1 2 0 7 、1 5 0 4 、4 4 8 9 己停止生长， 而n - 1 和n 一2 仍生长旺盛。当p h = 9 0 时，n - 1 和n 一2 的生长速度虽然减慢，但在培 养基中仍能生长。 由于1 2 0 7 、1 5 0 4 、4 4 8 9 等3 株纯菌种不能适应循环水系统的温度和p h 值，因此 以下的工作将只针对n 一1 和n 一2 进行，其它3 菌种不再讨论。 3 4 3 需氧性 对于兼性厌氧微生物的驯化，需要控制培养过程中的溶解氧量，因此在实验中采 取了如下的培养方式：用8 层消毒纱布外加2 层无菌牛皮纸扎紧摇瓶的瓶i i 后，再将 摇瓶置于恒温振荡器中。这样，培养时摇瓶中只有极少量的氧气存在，可满足兼性厌 氧微生物的生长需要。经驯化发现n l 和n 一2 往这样的培养方式下仍能良好生长。 d j 于实验条件、实验手段等客观因素的限制，只能对菌种进行初步驯化。经一定 过程的驯化后，现阶段n - 1 和n 一2 可适应如下的生长条件：t = 3 9 v ，p h - 9 0 ，兼性厌 氧。由于循环水系统中换热器的局部温度较高，且p h 值的波动范围较大，因此，要 使菌种完全适应系统的生长环境，就必须进1 步提高菌种的耐高温性及耐碱性。同时， 为了获得一个较高的降解率，也要求对它们进行菌种改造，进一步提高已有菌种的某 种性能，使其更符合实际需要，这就是育种。育种的手段很多，从微生物育种发展的 历史看，有定向培育、诱变育种、杂交育种、细胞融合和基因工程等育种技术。目前， 诱变育种对于微生物工作者来说仍是一个最为有效而实用的方法。 3 5 诱变育种 诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率 人帕度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的 突变菌株，以供生产实践或科学研究刷。 ! j f j h 发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过济变育利，向大大提高了生产性能 的菌株。诱变育种除能提高产境外，还可达到改善产品质量，扩大。镐利i 平简化生产工 艺等i1 的。诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，故仍是目前被广泛使用 的主要育种方法之o 。 3 5 1 诱变剂 各种性状的突变都可以在没有人为因素的条件下自发进行，但自发突变的突变率 很低，获得符合要求的突变菌株的可能性很小。在人工的物理化学诱变因素作用下， 菌株的突变率得以大大提高，具有有利性状的突变菌株被筛选的可能性大大增强。这 些物化诱变因素又称为诱变剂。 3 5 1 1 物理诱变剂 硕士论文 1 业循环水中泄漏含油介质的生化处理 物理诱变主要是采用辐射，如紫外线、x - 射线、y 一射线、激光和快中子等。 3 5 1 2 化学诱变剂 化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多。常用的化学诱变剂根 据其作用方式不同，分为以下三种类型。 ( 1 ) 与核酸碱基化学反应的诱变剂，此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。 ( 2 ) 碱基类似物，这些化合物有5 溴尿嘧啶( 5 - b u ) 、5 - 氟尿嘧啶( 5 一f u ) 、8 - 氮鸟 嘌呤( 8 - n g ) 、2 - 氨基嘌呤( 2 一a p ) 等。 ( 3 ) 移码突变的诱变剂，移码突变是指一种突变剂引起d n a 分子中的一个或少数几 个核苷酸的插入或损失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一 类突变。吖啶类染料和一系列称为i c r 类的化合物都是移码突变的有效诱变剂。 3 5 2 诱变育种的步骤 原种( 出发菌种) 一一纯化一斜面培养一一完全培养基同步培养一一离心洗涤一一 自然分离( 对处理液活菌汁 玻璃珠振荡打散一过滤一单细胞或孢子悬浮液一诱变剂处理一 平板分离 照) 活菌汁数数并汁算杀菌率 斜面形态变易初筛忭复筛，什自然分离 一一斜面培养一斜面培养斜面培养一保减及 并计算变易书能测定能测定和f i 复筛 扩大试验一一中试一一l 产实践”“ 3 6 菌种的保藏 人们在长期的实践中，列微生物种子的保减建立了许多方法，各种方法所适用微 生物的种类和效果都不一样，在具体应用中各有优缺点。采用的措施有的简单，有的 复杂，但它们的原理基本f = 是相同的，即选用优良的纯种，最好是休眠体( 分生孢子、 芽孢等) ，创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制，难以突变的环境条件。 其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等。以下是一些常用的菌种 保藏方法1 。3 i ”3 。 3 6 1 定期移植保藏法 斜面菌种( 通常保存于温度4 ，相对湿度6 0 7 0 的环境中) 一般3 个月6 个月移植一次，半固体穿刺接种的，保藏于普通冰箱，可6 个月1 2 个月移植一次。 定期移植保减法是最早使用而且至今仍然普遍采用的方法，在实验室和工厂中， 即使同时采用几种方法保藏同一菌种，这种方法仍然是必不可少的。在本实验中即采 用了这种简单易行的保藏方法。 3 6 2 液体石蜡保藏法 这种方法是定期移植保藏法的补充。在斜面或半固体穿刺培养物上覆盖一层无菌 的液体石蜡( 约1 c m 高) ，直立保存于普通冰箱中，保存期为1 年2 年。 硕十论文 1 ：业循环水中泄漏禽油介质的生化处理 3 6 3 沙土保藏法 河沙( 6 0 目过筛) 与黄上( 1 2 0 目过筛) 以4 ：1 混合，装入小试管( 约1 c m 高) ， 高压蒸汽灭菌( 1 2 1 ，3 0 m i n ) 2 次3 次后再干热灭菌( 1 5 0 c 1 6 0 c ，2 h ) 1 次， 用接种环从斜面上刮下孢子或芽孢置于沙上管内，并混均( 或用无菌水洗下孢子，制 成浓悬浮液滴入管内) ，然后放在盛有无水c a c i ：的干燥器中，抽气使沙土干燥后， 密封管口( 用石蜡或烧熔玻璃封口) 。低温保藏，可达1 年1 0 年。 3 6 4 冷冻干燥保藏法 斜面培养后，加入灭菌脱脂牛奶0 5 m l 1 5 m l ，将菌苔洗下制成浓菌悬液( 8 0 亿个m l 1 0 0 亿个m 1 ) ，分装菌种管( 安瓿瓶) ，菌种管放在9 5 酒精或干冰中，冷 冻，真空泵抽真空干燥，最后封口。经真空度检查合格的菌种管，在低温( 5 。c 左右) 或室温下避光保减。许多菌