蛋白质的测定.ppt

DeterminationofproteinandaminoacidinFood,第九章蛋白质及氨基酸的测定,第一节概述,1.蛋白质的元素组成（Theelementsofprotein）C：50-55%N：15-18%O：20-23%H：6-8%S：0-4%微量元素：P、Fe、Zn、Cu2、基本结构单位：氨基酸3、蛋白质的变性作用。,4、蛋白质分析的重要性,生物活性测定功能性质调查营养标签总蛋白质含量氨基酸组成蛋白质的营养价值,5、蛋白质的测定方法,利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法,凯氏定氮法杜马斯法,福林酚法染色法,第二节蛋白质的定性测定,一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了5种染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）,第三节蛋白质的定量测定,关于氮-蛋白质换算等数,6.25,=,6.25,=,6.38,=,5.95,一、凯氏定氮法,常量凯氏定氮法1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。,2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定,消化,(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O,加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点,加硫酸铜作为催化剂、消化终点指示剂,加氧化剂加速有机物氧化速度,蒸馏,NH4+OH-,=NH3+H2O,影响氨化完全和速度的因素,（1）K氏烧瓶和取样量（2）分解剂1g样品K2SO4：H2SO4=7g:12ml还有一种比例：K2SO4：H2SO4=10g:20ml,用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿）指示剂红色绿色红色（酸）（碱）（酸）,吸收与滴定,反应式为：NH3+H3BO3=NH4+H2BO3-H2BO3-+H+=H3BO3,用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液。,现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h后，估计消化完全，取出消化液加入少量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。,讨论,大量的脂肪,振摇,大火加热,消化,2h后，估计消化完全,量NaOH,少,计算,X=,X为样品中蛋白质的含量V1为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C为盐酸标准液的浓度MN为氮的摩尔质量W为样品的质量K为氮换算为蛋白质的系数,1.装水至2/3容积处，加甲基橙数滴及硫酸数毫升以保持酸性,7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色开始计时，蒸馏10min，将管尖端提离液面再蒸馏1min，用水冲洗管尖后停止蒸馏,同时做空白,8.吸收液用0.01000mol/LHCl标准溶液滴定至微红色为终点,2.管下端插入液面下(瓶内先装硼酸液及混合指示剂2滴),3.消化液10mL,4.NaOH溶液,5.水洗漏斗数次,6.夹好漏斗夹，水封。,4.5.6步操作要迅速,微量凯氏定氮法,凯氏定氮仪,凯氏定氮仪,二、双缩脲法,150160,双缩脲,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物。,紫色络合物。,操作方法,1、制作标准曲线取10支干试管分成两组，按下表平行操作：,取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。,2、样品测定取4支试管分成两组，按下表平行操作：,取两组测定的平均值计算：Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml）N为稀释倍数c为样品原浓度（mg/ml）。,3、计算,福林-酚法（双缩脲法的发展）,两步反应,(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质铜络合物。,(2)此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸(olin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)。,杜马斯法（燃烧法）,样品在高温下（700-800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。,几种蛋白质测定方法比较,总氮量,蛋白氮,总氮量,蛋白氮,凯式定氮装置,分光光度计,高温装置、GC,分光光度计,浓硫酸,用量较少,不需要,福林-酚试剂,长,简单快速,3min,简单快速,其他方法,染色法,紫外吸收法,水杨酸比色法,采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算：水份含量=8.0%，1号样品重量=1.015g，2号样品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度=0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数=22.0mL，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5mL，空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。,第四节氨基酸定量测定,一、甲醛滴定法,氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。,反应式（有几种不同的推论）如下：,双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂,同时取两份样,+中性红，用NaOH滴定,+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定,二、非水溶液滴定法,在水溶液中1、能溶解的物质有限，尤其是有机物质2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄3、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。,溶剂选择原则,1、不引起副反应2、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物3、应考虑溶剂的酸碱性对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好,氨基酸的非水溶液滴定,1、选择冰乙酸作为溶剂,2、选择高氯酸进行滴定,三、电位滴定法,根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定的终点。,pH,8.2,9.2,氨基酸自动分析仪法,在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg于100mL容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL进行测定，用0.05N氢氧化钠滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液7.0mL,