（微生物学专业论文）嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达及性质研究.pdf

碡、 蠲- 魄 t 6 钞9 8 li , a l i ii l l 1 ll ll 1 lil ll l l 熬匿鲁轻骊霉鹭里o s e qu 0 8 0 n r a 弹弧：锄蛆 辫由霉骂霉由联三o t m q l o t u o u ! u r e 天i i l a 呱x o 印s m ：s u 工 掰= 2 霉由圈o u m r e ! pa i 兀m 3 匹9 唧，：q 删目工 繇收苗v i g 丑s u , l 蝴n qv 工q 丑s f 【工：日工 睹魏鲤霉辫二4 - m 可i n si , o o p o pu m ! p o s ：s g s 鳆疑辫戥猝o s 它o l o u n o q r 8 ：o s g u 骘输瓤霉由害o p u o n l 3i 血呵i n s a u 唧a u q 工u 3 q d ：d s w d 搬印捌豫翻输辫坠酱s ! s o 1 0 q d o h o oi a 暑o p 【u r e i g a o 芑a i o d ：h d v d 窜墨椠 k l ! s u o pp 3 j j d o ：g o 潮亚辑啦驻封罄n a p m - q u ! o o n s o m o a q - n ：s f l n 霉錾密翅由狲害l o t m q l o t u m r a ! i a i ：巩w 髯奖崭戥照照狲售o s o h x o pr b u 印! w ：a 叭 酶母桑士u o i 它p o l p ：b 碉2 同滔二日p j o 它a u o o t m q o lo u u r e ! pa 匹【l p ：v 工q 碧2 矾藓o p ! t u o z qu m ! p r q 】, o ：叮h _ j ， o 莼繇鬈避= i o ”a 即。哪q - 1 a ：工工q 魏瓤三肆辫骘瓢m 它q s o q d u lo p ! s o o i o n u o q u a x o o g ：d i n p 副f z = 骊誓尊b 挥u o q j b 3 碱d 匹q 1 3 i q ：3 d 互q 霉2 髯鹭霉2 = i g q l o o u ! u - m l a q l o ! p ：吖a q 鞑霉搬烈强d a 观a ：d q 图髯匏矾骘馥3 so 鸵p ! x o o q o o w ：i x o v 善鸯睾4 鹭u i 1 i ! a ! d t u v ：d u t y 醣碘鲁姑 j i r ， 1 t ， _ 睁一 九 、 k 气 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 引言1 1 1 脂肪酶的研究进展1 1 1 1 脂肪酶的命名1 1 1 2 脂肪酶结构2 1 1 3 脂肪酶的催化机理。5 1 1 4 脂肪酶的特性7 1 1 5 几种脂肪酶活力的测定方法1 0 1 1 6 脂肪酶的应用1 4 1 2 毕赤酵母表达系统。1 6 1 3 嗜热真菌和热稳定脂肪酶1 8 1 3 1 嗜热真菌。l8 1 3 2 产热稳定脂肪酶微生物1 9 1 4 本研究的立题依据、研究内容及技术路线2 0 1 4 1 立题依据2 0 1 4 2 研究内容21 1 4 3 技术路线2 2 2 材料与方法2 3 2 1 材料2 3 2 1 1 供试菌株2 3 2 1 2 质粒2 3 2 1 3 酶和生化试剂2 3 2 1 4 仪器2 3 加l 2 2 1 2 2 4 目的基因c d n a 3 2 2 5 2 2 6 2 3 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 2 3 1 脂肪酶基因砌成熟肽基因序列的分离 2 3 2 质粒提取 2 3 3 酵母表达载体的构建 2 3 4 线性化质粒d n a 的制各 2 3 5 酵母转化 2 3 6 酵母转化子的筛选与鉴定 2 3 7 酵母工程菌的培养和l m 的诱导分泌表达 2 3 8 重组脂肪酶的活性检测一 2 3 9 表达产物l m 的s d s p a g e 分析4 4 2 3 1 0 脂肪酶工程菌产酶曲线及产酶期间生长曲线的测定4 4 2 4 重组脂肪酶的纯化4 5 2 4 1 发酵液的硫酸铵沉淀4 5 2 4 2d e a e s e p h a r o s e 阴离子交换柱层析4 5 2 4 3 蛋白质分子量测定和纯度鉴定4 5 2 4 4 蛋白质含量测定4 6 i i i k 、 “ 2 5 表达脂肪酶酶学特性的研究4 6 2 5 1 脂肪酶工程菌的遗传稳定性分析4 6 2 5 2 反应最适温度4 6 2 5 3 反应最适p h 值4 6 2 5 4 热稳定性4 7 2 5 5p h 稳定性4 7 2 5 6 各种金属离子对脂肪酶活性的影响4 7 2 5 7 酶的化学修饰4 7 3 结果与分析。4 9 3 1 嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆及其序列分析4 9 3 1 1ct h e r m o p h i l u m 总r n a 的提取4 9 3 1 2c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u mg e n o m i cd n a 的提取4 9 3 1 3 脂肪酶基因c d n a3 端的的分离5 0 3 1 4 脂肪酶基因d n a 序列5 末端的分离5 l 3 1 5 脂肪酶基因全长序列的验证5 2 3 1 6 脂肪酶基因全长d n a 和e d n a 的分离。5 3 3 2 脂肪酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析5 3 3 2 1 脂肪酶基因的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列5 3 3 2 2 脂肪酶基因的核苷酸序列分析一5 5 3 2 4 脂肪酶的立体结构预测5 8 3 2 5 脂肪酶的功能结构域预测5 8 3 2 6 脂肪酶基因砌结构及加工后的修饰分析5 9 3 2 7 目的基因砌的氨基酸序列同源性比较5 9 3 3 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达6 0 3 3 1 脂肪酶基因砌序列的限制性酶切位点分析结果6 0 i i i 3 3 2 脂肪酶基因砌成熟肽序列的扩增6 1 3 3 3 酵母表达载体的构建和鉴定6 2 3 3 4 重组酵母转化子的筛选6 4 3 3 5 脂肪酶基因砌在p i c h i a p a s t o r i s 中的高效表达及表达产物的检测6 8 3 4 重组脂肪酶的的纯化7 1 3 5 表达脂肪酶酶学特性的研究7 1 3 5 1 脂肪酶酵母工程菌的遗传稳定性分析7 1 3 5 2 表达脂肪酶l m 的最适反应温度7 2 3 5 3 表达脂肪酶l m 的最适反应p h 值7 2 3 5 4 表达脂肪酶l m 的热稳定性7 3 3 5 5 表达脂肪酶l m 的p h 稳定性7 4 3 5 6 金属离子对表达脂肪酶l m 活性的影响7 4 3 5 7 表达脂肪酶l m 的化学修饰7 5 4 寸论7 9 4 1 嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆7 9 4 1 1r n a 提取7 9 4 1 2 基因克隆新方法7 9 4 1 3 脂肪酶基因的结构7 9 4 2 重组脂肪酶在中温菌毕赤酵母中的表达8 0 4 2 1 表达载体构建8 0 4 2 2 不同线性化酶对转化效率的影响8 1 4 2 3 表达系统比较8 1 4 2 4 蛋白的翻译及加工8 2 4 3 重组脂肪酶的纯化及化学修饰8 3 4 3 1 脂肪酶的纯化8 3 i v 一 y j ， k ， 、 “ 4 3 2 脂肪酶的遗传稳定性8 3 4 3 3 脂肪酶的热稳定性8 4 4 3 4 脂肪酶的p h 稳定性_ 8 4 4 3 5 脂肪酶的化学修饰8 5 5 结论：8 6 参考文献。8 7 致谢9 6 攻读硕士期间发表论文9 7 v i “ k 、 “ 山东农业大学硕士学位论文 摘要 脂肪酶( e c3 1 1 3 ) ，全称三酰甘油酰基水解酶，广泛存在于生物 体内。微生物来源的脂肪酶由于种类多、生长周期短、易于培养等特点而 被广泛用于工业生产。脂肪酶能够催化油脂中甘油酯键的水解，也可催化 酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。但一般的脂肪酶热稳定性较差，在应 用中易于失活，因此热稳定性脂肪酶的研究和开发具有重要的商业价值。 对于热稳定脂肪酶性质和结构的研究已经成为当前脂肪酶研究的热点问 题。 嗜热毛壳菌( c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u m ) 是一种生长上限温度较高的 嗜热真菌，它能够产生具有重要工业价值的热稳定脂肪酶。但是野生菌产 酶存在培养温度高等较多不利因素，因而近年来主要研究方向集中于采用 基因工程方法构建重组菌，进而获得稳定表达的热稳定脂肪酶。 本研究在添加橄榄油的诱导培养基上诱导ct h e r m o p h i l u m 产生脂肪 。酶，根据已报道的脂肪酶同源保守序列设计兼并引物，综合运用r t - p c r 、 3 r a c e , t a i l p c r 技术克隆到脂肪酶基因的全长序列，命名为砌，其 中d n a 序列长11 8 0 b p ，有4 个内含子；c d n a 序列长8 7 0 b p ，开放阅读 框编码2 9 0 个氨基酸，序列提交g e n b a n k ，登录号分别为g u 3 3 8 2 4 9 和 g u 3 3 8 2 4 8 。 将脂肪酶基因砌编码区与酵母分泌型表达载体p p i c 9 k 经过髓以i 。 和n o ti 双酶切后体外连接，构建酵母重组表达载体p p i c 9 k m 。将重组 表达质粒p p i c 9 k l m 用限制性内切酶s a ci 线性化，电击法转化p i c h i a p a s t o r i sg s ll5 酵母感受态细胞，于m d m m 平板上筛选h i n u t + 表型的 酵母转化子。经过p c r 检测及g 4 1 8 抗性筛选多拷贝整合子，进行甲醇诱 导培养。通过检测各转化子目的蛋白表达情况，筛选到表达活性最高的菌 株g s l m 1 8 ，在第六天酶的活性最高，达1 9 7 7u m g ，蛋白表达量为0 4 2 8 m g m l 。 酵母工程菌株g s l m 18 在y p d 平板上划线连续传代l o 次后，重 舢 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达与性质研究 组脂肪酶的表达量基本保持稳定。表达脂肪酶l m 的最适反应温度和p h 分别为6 0 。c 和1 0 0 ，该酶在6 0 。c 以下稳定，7 0 。c 的半衰期为4 0 m i n ，在 p h 值为9 0 - - - 1 1 0 之间表达脂肪酶保持稳定的酶活性；c a 2 + 对酶有明显的 激活作用，f e 2 + 、z n 2 + 、k + 、a 矿对酶有显著的抑制作用。 重组脂肪酶工程菌能分泌出具生物活性的脂肪酶，而且表达脂肪酶 具有热稳定性，预示了表达的脂肪酶在生物学领域和化工工业的广阔应 用前景。 关键词：嗜热毛壳菌，热稳定脂肪酶，e d n a 克隆，表达，性质测定 i i j k ， 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t l i p a s e ( t r i a c y l g l y c e r o la c y l h y d r o l a s e s ，e c3 1 1 3 ) ，w h i c hw i d e l ye x i s t s i no r g a n i s m s ，c a t a l y z e sb o t hh y d r o l y s i sa n ds y n t h e s i so ft h ee s t e rb o n d so f t r i g l y c e r i d e sa to i l w a t e ri n t e r f a c e l i p a s e sp r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s m sa r e m u c hm o r ea t t r a c t i v ei ni n d u s t r i a lf i e l db e c a u s eo ft h e i rv a r i o u ss p e c i e s ，e a s y c u l t u r i n ga n dg r e a to u t p u t t h e r m a l s t a b i l i t yl i p a s e ss h o wg r e a tc o m m e r c i a l v a l u eb e c a u s eo ft h e i rs t a b l ea b i l i t yi nh i 曲t e m p e r a t u r e ，s ot h e r eh a sb e e na l l i n c r e a s i n gi n t e r e s ti nt h e m c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u mi sat h e r m o p h i l i cf u n g u s 哳t l ll l i g hg r o w t h t e m p e r a t u r e ，w h i c hh a sb e e np a i dm o r ea t t e n t i o nw i t ht h ee x p e c t a t i o nt o p r o d u c et h e r m o s t a b l ee n z y m e h o w e v e rt h eh i g hc u l t u r et e m p e r a t u r en e e d e d b yct h e r m o p h i l u mt op r o d u c el i p a s e i nal a r g en u m b e ri sd i f f i c u l t i n i n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s i nr e c e n ty e a r s ，m o s ts t u d i e sf o c u so nt h ee x p r e s s i o no f l i p a s ei nd i f f e r e n te x p r e s s i o ns y s t e m sb yg e n ee n g i n e e r i n gm e t h o d s 。d u r i n gg r o w t h i na l li n d u c e dm e d i u mc o n t a i n i n go l i v eo i l ，c t h e r m o p h i l u mp r o d u c e dl i p a s e d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e d o nt h e c o n s e r v e dd o m a i no fo t h e rr e p o r t e dl i p a s e s ，a n dt h ef u l ll e n g t he d n a e n c o d i n gt h el i p a s eg e n ew a so b t a i n e db yt a i l - p c ra n dr t - - p c r w en a m e d t h el i p a s eg e n ea s m d n as e q u e n c i n gr e v e a i e dt h a tg e n o m i cd n ao ft h ec t h e r m o p h i l u ml i p a s eg e n e mw a s118 0 b pa n dc o n t a i n e df o u ri n t r o n s a n dt h e e d n ao fg e n e mw ec l o n e dc o n t a i n sa no r fo f8 7 0 b pe n c o d i n g2 9 0a m i n o a c i d s t h ed n aa n dc d n as e q u e n c eh a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n k 谢t h a c c e s s i o nn u m b e rg u 3 3 8 2 4 9a n dg u 3 3 8 2 4 8 ，r e s p e c t i v e l y c o d i n gr e g i o no f ma n de x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kw e r ed i g e s t e dw i t h 积ia n dn o ti ，a n dl i g a t i o nw a sc a r r i e do u ti nv i t r o t h ec o n s t r u c tp l a s m i d p p i c 9 k mw a sl i n e a r i z e dw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m es a ci ( i n s e r t i o na t5 a o x o ， t r a n s f o r m e di n t op i c h i ap a s t o r i sg s115c o m p e t e n tc e l lb ye l e c t r o p o r a t i o n m e t h o d s ，a n ds c r e e n e df o rh i s + m u t + t r a n s f o r m a n t so nm da n dm mp l a t e s m u l t i c o p yi n t e g r a n t t r a n s f o r m a n t so b t a i n e db yp c ra n a l y s i sa n dg 418 i i i “ 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达与性质研究 s c r e e n i n g ，w e r ei n d u c e db ym e t h a n 0 1 t h e s ei n t e g r a n t sw e r es e l e c t e db y e x p r e s s i o nl e v e l so fi n t e r e s tp r o t e i ne v e r y2 4h o u r sa n dw en a m e dt h e e n g i n e e r i n gs t r a i n sw i t hh i 曲e x p r e s s i o nl e v e la sg s - l m 18 a f t e rs i xd a y s i n d u c t i o n ，t h et r a n s f o r m a n tg s l m 一18h a dt h eh i g h e s ta c t i v i t y19 7 7 u m ga n d t h ee x p r e s s i o nl e v e lw a s0 9 3 m g m 1 t h en a t u r eo ft h ee x p r e s s e dl i p a s ew a st e s t e da n dc h a r a c t e r i z e d a f t e r s u b c u l t u r ef o r10g e n e r a t i o n so ny p dp l a t e ，t r a n s f o r m a n t sg s - l m 一18k e p t c o n s i s t e n t 谢t 1 1t h eo r i g i n a le x p r e s s i o nl e v e la n dt h ei n t e r e s tg e n e mw a s i n t e g r a t e di n t opp a s t o r i sg e n o m e t h ee x p r e s s i o nl e v e lw a sa l s ok e p ts t a b l e t h ee x p r e s s i o nl i p a s el me x h i b i t e do p t i m u mc a t a l y t i ca c t i v i t ya tp h10 0a n d w a st h e r m o s t a b l ea t6 0 t h eh a l f - l i f eo ft h ee n z y m ea t7 0 w a s a p p r o x i m a t e l y4 0m i n t h ee n z y m ew a ss t a b l ei nt h er a n g eo f b u f f e rf r o mp h 9 0t o11 0 c a 2 + e n h a n c e dt h ee n z y m ea c t i v i t yg r e a t l y ，w h e r e a sa 矿，f e 2 + ，k + ， z n 2 + c a u s e do b v i o u si n b j b i t i o n t h er e c o m b i n a n tl i p a s ew a ss e c r e t e di n t ot h ec u l t u r em e d i u mb yt h ey e a s t ：p p a s t o r i si na na c t i v ef o r m ，a n dw a sa t h e r m o s t a b l ee n z y m e i ti m p l i e dt h a t t h ee x p r e s s e dl i p a s ec o u l db ew i d e l ya p p l i e di nt h eb i o l o g i c a lf i e l d sa n d c h e m i c a li n d u s t r y k e y w o r d s ：c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u m ；t h e r m o s t a b l el i p a s e ；e d n ac l o n e ； e x p r e s s i o n ；n a t u r ed e t e r m i n a t i o n i v t ， k - q 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 全称三酰甘油酰基水解酶( t r i a c y l g l y c e r o l a e y l h y r d r o l a s e s ) ，属于吖b 水解酶家族，是一类丝氨酸水解酶。脂肪酶催 化的一个显著特点是脂肪酶是一种界面酶，它们的水解反应只能是发生在 油水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反应。 脂肪酶的天然底物是甘油酯类，然而研究表明脂肪酶除了能够催化甘 油酯类化合物的水解和合成( c a r d e n a se ta 1 ，2 0 0 1 ；o s a d ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 之 外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚 合物的合成和药物的合成等( u n d u r r a g a e ta 1 ，2 0 0 1 ；c h o p i n e a ue ta 1 ，1 9 8 8 ； z h a n ge t a l ，2 0 0 1 ；m a r g o l i ne t a l ，1 9 9 1 ；g i l le t a l ，1 9 9 7 ) 。尤其是利用某 些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成( v a ne t a 1 ，2 0 0 1 ；m a r g o l i ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 成为酶工程领域研究的新热点。 脂肪酶广泛存在于原核生物( 如细菌) 和真核生物( 如霉菌、哺乳 动物、植物) 中，起到重要的生理功能，如帮助有机体储藏和利用脂肪， ，参与胞内脂代谢等( g o t ze t a l ，1 9 8 5 ；d a t t a e t a l ，1 9 8 8 ；w m k l e r e t a l ，1 9 9 0 ； h u a n g ，1 9 9 0 ) 。微生物脂肪酶是在二十世纪初才发现的( j a e g e r & r e e t z ， 1 9 9 8 ) ，研究起步较晚，但是微生物脂肪酶由于种类多，具有比动物脂肪 酶更广的作用p h 、作用温度范围和对底物的专一性类型，并且便于工业 生产和获得较高纯度的酶制剂，已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于 脂肪酶在工业中应用的研究也越来越多( 张树政等，1 9 8 4 ) 。 1 1 脂肪酶的研究进展 1 1 1 脂肪酶的命名 有关脂肪酶较确切的定义是2 0 世纪7 0 年代由b r o c k e r h o f f 等首先提 出的，他将能水解长链脂肪酸酯或水解油酸酯类的酶类定义为脂肪酶。由 于发现该定义易引起脂肪酶和酯酶的混淆，h u a n g 等随即将定义修改为一 类能催化特殊类型的酯键即三脂酰甘油酯键水解的酶；或者从催化作用的 可逆性考虑将脂肪酶定义为与高级脂肪酸和丙三醇所形成的三脂酰甘油 的合成、转酯和分解有关的酶类；或简言之脂肪酶是催化酯水解的一类酶 知 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达与性质研究 的总称。按照国际生化联合会的命名分类原则，脂肪酶编号：e c 3 1 1 3 ， 系统名称：三脂酰甘油酰基水解酶，习惯名称：脂肪酶( j e a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 尽管脂肪酶的定义目前仍然没有一个满意的界定，但对于如何从水解 脂肪的酶中划分出真正的脂肪酶，研究人员逐渐对两个标准产生认同 ( a h m e de ta 1 ，2 0 0 6 ) ：( 1 ) 脂肪酶具有界面激活现象。即当甘油三酸酯底 物形成乳浊液的时候酶活力明显增高。( 2 ) 脂肪酶应该有“盖子。然而 越来越多的具有“盖子”结构的脂肪酶却不具有界面激活现象，说明上面 的标准不适合脂肪酶分类。因此，现在脂肪酶被简单定义为可以催化长链 甘油酯水解或合成的羧酸酯酶。 1 1 2 脂肪酶结构 1 1 2 1 脂肪酶的一级结构 从已克隆的脂肪酶基因看，不同来源的微生物脂肪酶基因大小相差较 大，同源性比较低。在细菌脂肪酶的研究方面，目前已经测定了包括假单 孢菌、葡萄球菌、链球菌和枯草杆菌等在内的许多细菌脂肪酶的基因序列 和对应的氨基酸序列。g i b l e r t 根据氨基酸序列的同源性将来自于假单孢菌 属1 7 个种或株的脂肪酶基因分为两组，这两组脂肪酶之间除了含有非常 保守的脂肪酶活性中心保守序列( - g l y x 1 s e r - x 2 g l y - ) 之外，无任何相 似之处。而真菌来源的脂肪酶基因一般在1 0 0 0 b p 以上，存在少数几个短 的内含子。 在收录前人研究成果的基础上，j u r g e n 等人建立了一个脂肪酶蛋白质 工程数据库( l i p a s ee n g i n e e r i n g d a b a s e ) ，其网址是 h t t p ：w w w 1 e d u n i s t u t t g a r t d e ( j u r g e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。到2 0 0 0 年为止此数据 库已对多达9 2 种微生物脂肪酶及与其同源的丝氨酸水解酶的序列、结构 和功能进行了分类、总结和比较研究。通过多序列的比对，并根据其相似 性程度的大小，他们把上述各种酶划分为1 5 个超家族( s u p e r - f a m i l y ) 和 3 2 个同源家族( h o m o g o u sf a m i l y ) 。同源家族内，脂肪酶具有较高的序列 相似性，而超家族之间序列相似性很低。 在已测定的脂肪酶一级结构中，活性s e r 附近的1 0 个氨基酸较为保 2 j k 勺 山东农业大学硕士学位论文 守，大都包含了g l y x 1 s e r x 2 g l y 保守序列，仅有部分细菌脂肪酶如 b a c i l l i u ss u b t i l i s1 6 8 ( d a r t o i se ta 1 ，1 9 9 2 ) 的序列略有不同，保守区为 a l a - x ，s e r - x 2 g l y ，但也是以s e r 为活性中心。五个氨基酸的保守序列因 来源不同有所差别，x l 一般是h i s 或g l y ，x 2 一般是m e t 、g i n 、l e u 或 a l a 。对于真菌脂肪酶此序列的保守性更强，例如酵母脂肪酶是 g l y g l u - s e r - a 1 a - g l y ，霉菌脂肪酶是g l y h i s s e r - l e u g l y ( 邬敏辰，2 0 0 1 ) ； 另外，u p t o n 和a k o h 等人( u p t o ne ta 1 ，1 9 9 5 , a k o he ta 1 ，2 0 0 4 ) 发现某 些脂肪酶不具有典型的五肽序列，而是有一个g s d l 基序，但是这个基序 也包含由s e r 残基够成的活性位点，这些脂肪酶具有一些不同的特性。普 遍认为保守五肽中的s e r 是一种亲核残基，参与水解过程，是催化三联体 的成员之一；而s e t 侧翼的g l y 在酶的催化过程中所起的作用不大，推测 其作用为增加保守五肽的柔韧性和减少空间障碍以便底物能与催化中心 更好地结合和催化水解。 1 1 2 2 脂肪酶的二级结构 在二级结构上，尽管不同来源的脂肪酶在分子大小、水解底物的特异 性、氨基酸序列上差异较大，但是其空间结构却非常相似，都具有相似的 折叠方式p 水解酶折叠。p 水解酶折叠是由8 个p 一折叠片层互相 平行组成一个中心，其中3 至8 个折叠片层之间由仅螺旋相连，p - 折叠片 层是以左手超螺旋缠绕的，a 螺旋则排列在p 折叠的两侧( 图卜1 ) 。邮 水解酶折叠结构为各种脂肪酶的活性位点提供了一个稳定的支架：催化三 联体中携带有亲核基团的s e r 残基，一般位于p 5 链后面( n a r d i n ie ta 1 ， 1 9 9 9 ) ；酸性氨基酸( a s p 或g l u ) 残基一般位于p 7 链后面；而h i s 残基一般。 位于最后一个p 链的后面。不同脂肪酶二级结构的差别主要表现在p 折叠 片和c 【螺旋数量、p 折叠片扭曲的角度、a 螺旋的空间分布位置等的差异。 例如，较早研究的兄m i e h e i 有2 6 9 个氨基酸，其空间结构中有9 个p - 折 叠片和6 个仅螺旋( b r a d ye ta 1 ，1 9 9 0 ；d e r e w e n d ae ta 1 ，1 9 9 4 ) ；而 g e o t r i c h u mc a n d i d u m 脂肪酶有5 4 4 个氨基酸，其空间结构中包含1 1 个b 一 折叠片层和1 7 个0 【- 螺旋( s c h r a ge ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达与性质研究 瑟；雾：l3 溶i ：；i 孙；磐0 雾6 怨j i 7 懿嚣黟毋 图l - l 典型的脂肪酶邮水解酶二级结构 f i g i - lt y p i c a ls c c o n d a l ys t r u c t u r et o p o l o g yo f l i p a s e s 1 1 2 3 脂肪酶的三级结构 自1 9 9 0 年第一个微生物脂肪酶一r h i z o m u c o rm i e h e i 脂肪酶的三维 结构被测定以来，已有超过1 6 个微生物脂肪酶的三维结构被阐明( 检索 h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v e n t r e z ；h t t p ：w w w 1 e d u n i s m t t g a r t d e ；h t t p ：w w w a u k b c o r g ，0 5 0 7 2 0 0 6 ) ，其中7 个是细菌脂肪酶。所有已测定三维结构的 脂肪酶均是由位于酶中央的b 折叠和包围在p 折叠外面的c 【螺旋构成的近 似球形的蛋白质分子，相对分子质量为19 k d a - - 一6 0 k d a 。 对脂肪酶晶体结构研究表明，脂肪酶和别的甜p 水解酶一样，由三 个氨基酸构成活性中心催化三联体( c a t a l y t i ct r i m ) ：一个亲核氨基酸 s e r ，位于高度保守的g l y x l - s e r - x 2 g l y 五肽中；一个酸性氨基酸a s p ( g 1 u ) ；一个h i s 。构成催化三联体的三个氨基酸在一级结构上相差甚 远，但在空间结构上排列在靠近的位置上( b r a d ye ta 1 ，1 9 9 0 ) 。构成活 性中心催化三联体的空间中非常靠近的三个氨基酸，以非常保守的几 何取向埋于最中间p 折叠一侧的“环”中，活性中心接近表面但是没有 完全暴露在溶剂中，其上是一个“盖子 结构。“盖子”是由双亲性螺 旋构成，通过疏水作用和静电作用“固定”在活性中心上方，在足m i e h e i 脂肪酶空间结构中，t r p 8 8 构成了活性s e r 上方盖子的中心部位。称之 j 审 ，套篱拶鸪降；。 - - 、 山东农业大学硕士学位论文 为“盖子 是因为它可以发生位置变化。最初盖子是盖在活性中心上方 的，从而阻止水溶液中的底物靠近活性位点；当脂肪酶接触到底物或者 抑制剂时，由于界面活性，构象发生改变盖子移开，活性中心暴露于溶 剂中，与底物结合催化反应进行或者被抑制剂结合而失去活性 ( a n g k a w i d j a j a & k a n a y a , 2 0 0 6 ) ( 图1 - 2 ) ，此时暴露出的是一个很大 的疏水表面，原先暴露在外的亲水区则埋藏到了蛋白的内部( g r o c h u l s k i 甜以，1 9 9 3 ；d e r e w e n d ae t a l ，1 9 9 4 ) 。 图1 - 2 足m i e h e i 腊肪酶“盖子”打开和关闭时的空间结构 f i g 1 - 2c a r t o o nr e p r e s e n t a t i o no f t h ec l o s e d ( a ) a n do p e n ( b ) c o n f o r m a t i o no f al i p a s e f r o m 兄m i e h e f 1 1 3 脂肪酶的催化机理 脂肪酶活性中心具有与丝氨酸蛋白酶相似的催化三联体，其催化机制 也与丝氨酸蛋白酶十分相似。j a e g e r 将羧基酯键的水解断裂过程分为4 个 阶段( j a e g e r e ta 1 ，1 9 9 4 ；j a e g e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 1 3 1 酶与底物的结合 当没有油一水界面时，脂肪酶的活性中心被盖子结构覆盖，脂肪酶呈 一种闭合型结构。一旦环境中有疏水性物质存在时，盖子结构疏水一侧暴 露到脂相中，增强了酶与脂表面的疏水作用，盖子结构打开，脂肪酶露出 一个大的疏水表面，底物与活性中心的催化残基结合( d a n i e l s e ne ta 1 ， 5 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达与性质研究 2 0 0 1 ；s v e n d s e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在活性中心附近的组氨酸的参与下，活性中 心的丝氨酸残基被激活，丝氨酸残基羟基上的氢原子转移到组氨酸的咪唑 环上，丝氨酸残基的羟基氧原子对已被激活的底物羰基碳原子发起亲核攻 击见图1 - 3 ( a ) 。 1 1 3 2 四面体中间复合物的形成 在丝氨酸残基羟基氧原子的作用下，羰基双键断裂，羰基氧原子携带 上负电荷( 阴离子氧) ，而羰基碳原子与4 个其它原子键合，形成一个瞬 间的四面体中间复合物，见图1 - 3 ( b ) 。阴离子氧通过与两个肽键的n h 基团相互作用而稳定；醇羟基的氧原子通过与组氨酸提供的质子氢相互作 用而稳定。 1 1 3 3 酰基一酶共价中间体复合物的形成 羰基碳原子继而发生螺旋扭转，形成一个螺旋状的大偶极，阴离子氧 与另外两个肽键的- n h 基之间形成氢键( 阴离子氧洞) 。而组氨酸咪唑环上 从丝氨酸羟基获得的质子氢被转移给酯键的醇羟基，酯键断裂，释放游离 。的醇，同时羰基与质子化的丝氨酸之间重新形成酯键。这样，就形成了一 个稳定的酰基一酶共价中间体复合物，见图1 - 3 ( e ) 。 1 1 3 4 脱酰基过程 组氨酸残基的咪唑环将从丝氨酸获得的质子转移给酯键的醇羟基后， 又从进入活性中心的水分子中夺取质子，从而激活了水分子。水分子剩下 的o h 离子攻击同丝氨酸羟基共价