（植物学专业论文）山银花的组织培养.pdf

山银花的组织培养 摘要 本试验选用广西本地山银花品种华南忍冬的带腋芽茎段为外植体进行 组织培养，分别在灭菌方式的确定、基本培养基的选择、初代芽诱导培养 基和继代芽增殖培养基、继代代数对丛芽增殖的影响、生根和移栽这七个 方面进行了研究，得出以下结果： 1 将华南忍冬的带腋芽茎段先用7 5 沼i 精浸泡2 5 s ，再用0 1 升汞溶液 ( 加吐温8 0 ) 灭菌9 m i n ，此为较好的灭菌处理组合。经灭菌处理后的外植体 污染率可以控制在2 5 以下，初代芽诱导率可保持在6 0 以上。 2 m s 为较好的基本培养基，丛芽在此培养基上的分化能力比在b 。培养 基上的强，芽体健壮。 3 初代芽诱导使用n a a 和6 - b a 配合处理，发现n a a 对诱导华南忍冬腋 芽萌发无作用；使用6 - b a 单因子处理时，在6 - b a l 0 2 o m g l 处理的范 围内，腋芽的萌发率与6 - b a 浓度成正相关；其中较适宜的处理浓度为 6 - b a 2 o m g l ，平均每个外植体出芽数为5 2 个，萌发率为6 3 3 。 4 芽的继代增殖使用6 - b a 单因子进行诱导，6 一队浓度在0 5 2 o m g l 时，丛芽的产生量与6 - b a 的浓度基本成正相关；其中6 - b a l 7 m g l 处理组比较适合丛芽的分化，平均每丛丛芽增加芽数为1 0 7 个，芽比较粗 壮。 5 在山银花丛芽的继代过程中，平均每丛丛芽增加芽数最多出现在第4 代为11 1 个，以后平均每丛丛芽增加芽数随着继代代数的增加而下降。 6 ib a 并不能诱导山银花无菌芽生根。n a a 诱导生根的处理浓度需控制 在0 1 5 o 2 5 m g l 之间。m e t 诱导生根的浓度应控制在1 0 2 0 i i l g l 。n a a 和m e t 配合使用的处理中n u i , o 2 5 m g l + m e t 2 o m g l 的组合诱导山银花无菌 芽生根效果最佳。 7 在经过3 0 天的炼苗后，n a a 单因子处理的生根苗成活率为6 6 7 ， m e t 处理组的为7 0 0 9 6 。n m + m e t 处理组的达到了10 0 。 关键词：山银花组织培养快速繁殖丛芽增殖 tls s u ec u l t u r eo fl 刎，硎及钠f j 鲥d c a b s t r a c t a s t u d yw a sm a d eo fi n d u c i n ga x i l l a r yb u d sf r o mt h es t e mw i t hb u d so fg u a n g x i l o n 如e r ac o t l f u s ad c 。s e v e ns t a g e so fp r i m a r yr e s e a r c hw e r ep r o c e s s e d t h a tw a s , t h e w a y so fs t e r i l i z a t i o n , t h ec h o o s eo fb a s i cm e d i u m , t h ed o s eo fp h y t o h o r m o n ei ni n i t i a l a n ds u b c u l t u r em e d i u m , e f f e c t so fs u b c u l t u r i n gg e n e r a t i o n sc o n c e n t r a t i o n so ns h o o t s , r o o t i n ga n dt r a n s p l a n t a t i o n n er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h es t e mw a sd i p p e di n7 5 a l c o h o l2 5 sf i r s t l y , t h e ni tw a sd i p p e di n 0 1 h g c i d w i t hp o l y s o r b a t es o ) 9 m i n t h a tw a st h eb e s tw a y o fs t e h l i z a t i o n t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a tt h er a t eo fp o l l u t i o nw a sc o n t r o l l e db e l o w2 5 a n dt h er a t eo fi n i t i a t i v e w 淞k e p ta b o v e6 0 2 m sw a sc h o s e na sb a s i cm e d i u mi nt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t ，i nw h i c ht h ea b i l i t y o f d i f f e r e n t i a t i o nw a ss t r o n g e rt h a nb s 3 6 - b aa n dn a aw e r eu s e di nt h ei n i t i a le x p e r i m e n t i tw a sf o u n dt h a tn a aw a s u s e l e s st os p r o u ta u x i l i a r yb u d so fl o n i c e r ac o n f u s ad c o n l yu s e d6 - b ai nt h ei n i t i a l e x p e r i m e n t , w h e nt h ed o s eo f6 - b aw a sb e t w e e n1 0 2 2 m g l , t h es p r o u t i n gr a t eo f a x i a lb u d sa n dt h e6 - b ad e n s i t yw e r op r o p o r t i o n a l 6 - b a 2 0 m g lw a st h es u i t a b l e d i s p o s e ，w h i c ht h ea v e r a g eo ft h eg e r m i n a t i v eb u d sw a s5 j ，t h er a t eo fi n d u c t i o nw a s 稻3 4 o n l yu s e d6 - b ai nt h es u b c u l t u r ep r o l i f e r a t i o ne x p e r i m e n t , w h e nt h ed o s eo f 6 - b aw a s0 5 2 o m g 几t h es p r o u t i n gr a t eo fb u d sa n dt h e6 - b ad e n s i t yw e r e p r o p o r t i o n a l 6 - b a l 7 m g lw a qt h es u i t a b l ed i s p o s e ，w h i c ht h en u m b e ro fb u d sw a s 1 0 7 a n dt h eb u d s w e r es t r o n g e rt h a nt h eo t h e ro n e s i nt h ep r o c e s so fs u b c u l t u r e ，t h ea v e g a g eo ft h eg e r m i n a t i v eb u d sw h i c hw a st h e m o s to fa nw e r e l l 1i nt h e4 t hg e n e r a t i o n a st h ei n c r e a s i n go fg e n e r a t i o n t h ea v e r a g eo f t h eg e r m i n a t i v eb u d sw e n td o w n 6 t h er e s u l ts h o w e dt h a ti b ac o u l dn o ti n d u c e l o n i c e r ac o n f l l 僦ld c t or o o t t h e d o s eo fn a aw h i c hr o o t e de f f e c t u a l l ys h o u l dc o n t r o li n0 1 5 0 2 5m g lt h ed o s eo f m e ts h o u l dc o n t r o li n1 0 2 o m g l n a a 0 2 5 m g l + m e t2 0 m g lw a st h eb e s t t r e a t m e n tw h i c hr o o t e dl o n i c e r ac o n f n s ad c e f f e c t u a l l y 7 a f t e rd o m e s t i c a t e dt h e r o o t i n gp l a n t s3 0d a y sl o n g , t h es u r v i v a lr a t eo f t r a n s p l a n t a t i o nw i t hn a aw a s6 6 7 t h es u r v i v a lr a t eo ft r a n s p l a n t a t i o n 稍恤m e t w a s7 0 0 ，t h es u r v i v a lr a t eo f t r a n s p l a n t a t i o nw i t hn a a + m e tw a s1 0 0 k e yw o r d s ：l o n i c e r ac o n f u s ad c t i s s u ec u l t u r e r a p i dp r o p a g a t i o n p r o h f e r a t i o no fc l u s t e rb u d s 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名鸯 茹寸 学位论文使用授权说明 加口7 年占月旭日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布亿缸密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文储躲巷翔y 翩躲桫砷年名月谬日 广西大掣q 甄士掌位论文 前言 山银花为华南地区“金银花”中药材的主要品种，有清热解毒之功效。主要药用部 分为花，藤和叶也可入药“1 。 1 来源 中国药典2 0 0 0 年版一部将金银花规定为忍冬科植物忍冬( l o n i c e r a j a p o n i c a t h u n b ) 、红腺忍冬( l o n i c e r ah y p o g l a u c am i q ) 、华南忍冬( l o n i c e r ac o n f u s ad c 1 和毛花 柱忍冬( l o n i c e r a d a s y s t y l a r e h d ) 的干燥花蕾或初开的花锄。中国药典2 0 0 5 年版一部 把金银花的来源规定进行了修订，分列出山银花。其中规定金银花来源为忍冬科植物忍 冬，山银花来源为忍冬科植物灰毡毛忍冬( l o n i c e r am a c r a n t h o i d e sh a n d m a z z 1 、红腺忍 冬和华南忍冬哪。山银花在生物学特性、有效成分和含量方面都与金银花很相似m “。 2 生物学特性 2 1 植物形态 华南忍冬也称山银花，是忍冬科多年生半常绿木质藤本植物；幼枝、叶柄、总花梗、 苞片、小苞片和萼筒均密被灰黄色卷曲短柔毛，并疏生微腺毛；小枝淡红褐色或近褐色。 叶纸质，卵形至卵状矩圆形，长3 6 c m ，顶端尖或稍顿而具小短尖头，基部圆形、截形 或带心形，幼时两面有短糙毛，老时叶面变无毛；叶柄长5 1 0 m m 。花有香味，双花腋 生于小枝或侧生短枝顶集合成具2 4 节的短总状花序，有明显的总苞叶；总花梗长2 8 m m ；苞片披针形，长1 2 m m ；小苞片圆卵形或卵形，长约l m m ，顶端钝，有缘毛；萼 筒长1 5 2 m m ，被短糙毛；萼齿披针形或卵状三角形，长l m m ，外密被短柔毛；花冠白 色，后变黄色，长3 2 5 c m ，唇形，简直或有时稍弯曲，外面被少量开展的倒糙毛和长、 短两种腺毛，内面有柔毛，唇瓣略短于筒；雄蕊和花柱均伸出，比唇瓣稍长，花丝无毛。 果实黑色，椭圆形或近圆形，长6 1 0 n m l 嘲。 2 2 生长习性 2 2 1 温度 华南忍冬耐寒性强。在- 1 0 c 背风向阳有一定湿度情况下，叶子不落；一2 0 c 下能 g - 西大曹u 囊士学位戗演 安全越冬，翌年正常开花；5 1 2 时植株就开始发芽生长，随温度升高生长速度加快；1 6 以上新梢生长迅速并开始孕育花蕾；2 0 3 0 c 为最适宜生长温度，4 0 c 以上只要有一 定湿度也不热死m 。 幺2 2 根的生长 华南忍冬的根系发达，1 0 年生植株根平面分布直径可达2 4 m ，深度2 0 3 0 c m ， 根系在4 月上旬至8 月下旬生长最快。 2 2 3 枝条及花的生长 华南忍冬在春季由越冬芽形成的枝条为一级枝，生长到一定程度顶端生长点停止分 化，由一级枝的腋芽生长形成二级枝，依次形成三、四级枝。枝条有花枝、生长枝、徒 长枝之分。花枝上形成花芽。徒长枝多生于植株的下半部，枝条粗大、叶子肥硕，消耗 大量养分。花期为4 5 月，有时为9 1 0 月开第二次花，果熟期为1 0 月州。 2 3 产地 分布于广西、广东和海南。生于丘陵地的山坡、杂木林和灌丛中及平原旷野路旁 或河边，海拔最高达8 0 0 米。越南北部和尼泊尔也有分布。在广西的忻城县石山地区大 量种植的就是山银花“”，目前该县山银花种植面积达7 0 6 万亩，鲜花产量2 0 0 0 吨年。 3 化学成分和药理作用 3 1 化学成分 山银花花蕾含有机酸，挥发油和黄酮类物质“”“”。其中干花的有机酸类含量约占 6 ，以绿原酸( c h l o r o g e n i ca c i d ) 和异绿原酸( i s o c h l o - r o g e n i ca c i d ) 为主“”，还含有 环烯醚萜苷、裂环马钱素、獐牙茶苷、马钱素、马钱酸、新环烯醚萜苷、常春藤皂苷类 化合物等“”。挥发油已测得有三十多种成分，主要为芳樟醇( 1 i n a l 0 0 1 ) 、双花醇、香叶 醇、6 - - 苯乙醇、异双花醇、a 一松油醇、丁香油酚、香树烯、苯甲酸甲酯丁香酚、金台 欢醇等“”。黄酮类主要有樨草素( 1 u t e , o l i n ) 、木樨草素一7 0 一d 葡萄糖苷( 1 u t e o l i n - - 7 一o a d g l l 啪s i d c ) 、木犀草素- - 7 - - o - - d 半乳糖、槲皮素一3 一o b d 葡萄糖苷、 金丝桃苷和5 一羟基一3 ，4 ，7 一三甲氧基黄酮等“”1 。山银花花蕾中还含有肌醇 ( i n o s i t 0 1 ) 、8 - 谷甾醇( b s i t o s t e r 0 1 ) 2 0 e 根据相关资料的显示，广西山银花干燥花中主要 有效成分绿原酸的含量大于中国药典2 0 0 5 年版一部所规定的标准( 绿原酸含量不少 于1 5 p 。4 嘲。 2 3 2 主要药理作用 3 2 1 抗菌作用 金银花对多种致病菌有一定的抑制作用“，包括金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、 大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌，对肺炎球菌、脑膜炎双球菌、 绿脓杆菌、结核杆菌等。金银花对致龋病的变形链球菌、放线粘杆菌和引起牙周病的产 黑色素类杆菌，牙龈类杆菌及伴放线嗜血菌亦显示了较强的抗菌活性。金银花于体外有 一定的抗钩体作用嘲，对皮肤真菌有一定抑制作用。 3 2 2 抗病毒作用 金银花水煎剂( 1 ：2 0 ) 在人胚肾原代单层上皮细胞组培养上，对流感病毒、孤儿病毒、 疱疹病毒增多有抑制作用伽。金银花具有细胞外抑制病毒作用，对格兰氏阴性细菌内毒 素有较强的拮抗作用，以及对上呼吸道感染致病之毒有抑制和延缓细胞病变的作用，为 治疗病毒性心肌病及其它病毒性疾病提供了用药依据汹1 。 3 2 ，3 抗生育作用 山银花经乙醇提取后之水煎液浸膏对小鼠、狗、猴等多种动物有明显的终止妊娠作 用，尤其对小鼠、狗有显著的抗早孕作用啪1 。 3 2 4 抗炎及解热作用 金银花具有明显抗炎作用，注射给药时可明显抑制新鲜鸡蛋清、鹿角菜胶等所致大 鼠脚跖水肿，明显抑制巴豆油性肉芽囊大鼠的炎性渗出和炎性增生，于体外还能抑制人 的r 球蛋白的c u 热变性啪1 。 3 2 5 降血脂作用 金银花能显著降低多种模型小鼠血清胆固醇 c ) 及动脉粥样硬化指数( m ) ，提高高 密度脂蛋白一胆固醇( 加) l 曲含量，保护胰腺b 细胞及弱降糖作用叭1 。 3 2 6 对免疫系统的作用 金银花具有促进白细胞的吞噬功能，促进炎性细胞吞噬功能，降低豚鼠t 细胞a 一醋酸 萘酯酶( a l 峪e ) 百分率，降低中性粒细胞( p m n ) 体外分泌功能，恢复巨噬细胞功能， 调理淋巴细胞功能，显著增强 l - 2 的产生等作用 3 2 e 另外，硝酸铈与金银花配合使用对烫 伤小鼠细胞免疫的调理作用较单味药效果更好。 3 2 7 抗肿瘤作用 金银花中的木樨草素对n k i y 腹水癌细胞体外培养有抑制生长的作用。 3 3 2 8 止血作用 金银花中绿原酸有明显的止血凝血作用。 3 2 9 其他作用 金银花中所含绿原酸可引起大鼠、小鼠中枢神经系统兴奋汹1 。口服大剂量绿原酸能 增加胃肠蠕动，促进胃液及胆汁分泌。此外绿原酸还能轻微增加肾上腺素及去甲肾上腺 素对猫与大鼠的升压作用，但对猫的瞬膜反应无影响啪1 。绿原酸具有致敏原作用，可引起 变态反应，但口服无此反应，因为绿原酸可被小肠分泌物转化成无致敏活性的物质。另外 有实验证明金银花有溶血作用。 4 山银花的开发价值分析 4 1 蓄水保土价值 由于山银花能够具有生长快、寿命长、根系发达、生命力强、枝条多、叶子密度大、 郁闭快的生物学特性，因此它有良好的蓄水保土效益。试验证明，山银花在片麻岩、石 灰岩、角砾岩地区沙土、硬土上均能生长。幼苗在沙壤土上生长较快，硬土上生长较慢， 在4 5 年后生长速度无差异哪3 0 广西的金银花基地忻城县境内8 0 为大石山区，山银 花一直以来就在石山中生长。杨吉华等口刀研究表明，山银花可以吸收和调节地表径流， 提高土壤渗透速度，改善土壤物理性状，增加土壤贮水量，提高土壤蓄水保土能力。由 于根系发达，可疏松土壤，改善土壤的通气状况，加深活土层，固持土壤，减少水土流 失，减少土壤侵蚀量。据报道呻“1 ，在片麻岩强度侵蚀区荒坡上栽培山银花，5 年后植 被覆盖度达9 1 7 ，蓄水效率达4 8 2 ，减沙效率达7 2 6 ；在田问栽培华南忍冬，5 年 后植被覆盖度达8 6 4 ，蓄水效率达4 3 2 9 6 ，减沙效率达6 8 2 9 6 ，蓄水保土效果非常明显。 4 2 药用价值 金银花是全国1 0 种名贵、广谱药材之一，中医临床主要用于治疗温病发热，因金 银花清热解毒作用颇佳，且有舒风散热之效，常用于治疗外感风热、温病及疮疡肿等热 毒症“。著名治疗风热感冒的“银翘饮”即以金银花为主药。金银花还大量应用于治疗 肺炎肺结核合并呼吸道感染、阑尾炎、局限性腹膜炎、痛疖、丹毒等，其退热效果显著。 以金银花为主配合其他药物治疗痢疾、上呼吸道感染、百日咳、腮腺炎、流感、急性喉 头炎、急性扁桃体炎等。依此，金银花大量用于中成药生产，如“银黄口服液”、“银翘 解毒丸( 还有片剂、颗粒剂) ”、“双黄连片”、“三黄片”等。 4 t , u 氟花的角l | 鼠培养 2 0 0 3 年上半年，我国突遭s a r s 病毒的侵袭，给人们造成极大的恐慌和危害，而作 为防治s a r s 的良药成份之一的金银花，一度成了抢手货，供不应求，干花价格最高达 到了3 6 0 元k g 。 4 3 保健价值 神农本草经将金银花列为上品，有“久服轻身，长年益寿”之说。金银花在营 养保健方面也有很大开发潜力。以金银花( 或其叶、藤) 制作的金银花茶气味清香、口 。感好，且具清热解毒的作用，既是防暑佳品，又可增智益寿。以金银花或忍冬藤生产的 银花露、汽水、可乐、汽酒、啤酒，凉口清爽，是夏季的上好饮料。忍冬花牙膏、金银 花痱子水等具有很好的抗菌消炎作用，深受市场消费者欢迎。 4 4 经济价值 山银花对土壤的要求不严，即使在立地条件较差的石山区也能生长，扦插苗当年栽 培，翌年有部分植株开始开花，第三年进入盛花期，是一种投资少、易管理、见效快的 经济作物。种植山银花每亩投资5 0 0 6 0 0 元，其中包括购种苗、农药、化肥、人工费 等，2 3 年后开始收花，亩产干花2 0 0 k g 左右( 最高产可达3 5 0 k g ) ，按一般价格计算， 平均每亩收入3 0 0 0 元以上。忻城县北更乡弄兰村仲周屯户年均种植金银花2 0 0 株，每 株的鲜花产量都在l o k g 以上，年收鲜花2 0 0 0 k g ，按每k g 鲜花4 元计算，种花年每户可 收入8 0 0 0 元。 5 山银花繁殖方式的国内外研究进展 目前金银花的主要的繁殖方式分有性繁殖和无性繁殖两种。 5 1 有性繁殖 5 1 1 种子繁殖 在1 0 1 1 月采摘果实，去净果肉，取成熟种子晾干备用。一般在4 月下旬，选择 肥沃砂质壤土，每亩施堆肥2 5 0 0 k g ，翻耕平整后条播或撒播。播前将种子用3 5 4 0 c 温水浸泡一昼夜，捞出来，放在温暖处催芽约2 周左右，待种子裂口即可播种。条播按 行距2 1 c m 开浅沟，将种子均匀撒入沟内，覆土6 8 c m ；撒播是将种子均匀地撤在己准 备好的地块里，覆土3 6 c m ，压实。在干旱多风时，地面可盖稻草保湿，每隔2 3 天 喷水1 次，约1 0 天左右可出苗。出苗后适当问苗并施稀薄人粪尿，苗高1 5 c m 时打顶， 使其分枝。幼苗在当年秋季或第2 年春季可移栽。此方法繁殖系数不高，因种子萌发率 5 - - 西大增领士学位论文 不高，而且容易出现烂种蝴。 5 2 无性繁殖 5 2 1 分株繁殖 山银花易生根蘖苗，栽后第二年植株周围都能萌发根蘖苗。一般于春季结合施肥时 断根，在断根愈伤组织处生长出根孽苗，于夏秋季的雨天把幼苗刨出移栽。此繁殖方式 的繁殖系数同样较低“”。 5 2 2 扦插繁殖 一般在秋季阴雨天时进行插条。春季雨水充沛，虽然适于插条，但扦插苗移栽后当 年不能开花；伏天插条又容易干死或或烂皮。扦插时取l 4 年生健康枝条，剪成2 0 3 0 c m 长的段，摘去下部枝叶，保留上部1 对叶，栽于3 0 c m 见方的穴内，2 4 棵l 穴， 枝条的2 3 3 4 埋入土中，压实后浇透水、大面积栽植行距1 2 m x1 8 m 为宣。试验证 明，生理成熟度较高的3 4 生枝条扦插后得到的幼苗成活率较高。 在以上的繁殖方式中，种子繁殖和分株繁殖的繁殖系数低。种子繁殖的植株由幼苗 到开花通常需要3 5 年。扦插繁殖要栽植两年以上才可开少量的花，三、四年后才进 入盛花期。以上传统的繁殖方式满足不了规模化种植对种苗的需求。因此，需寻求另外 的快速繁殖途径。 5 3 组织培养快速繁殖 近年来，药用植物组织培养方面的研究发展很快。以三七侧、铁皮石斛“等药用植 物的组织培养已取得了成功。植物组织培养一年四季均可生产种苗，不受地区、季节及 有害生物的影响，便于工厂化生产。通过组织培养得出的种苗个体差异小，可快速繁殖， 能节省人力、物力等。”。利用组织培养过程中出现的芽变或人工诱变，可培育新品种。 王光全、孟庆杰等嘲1 对风爪金银花进行组织培养，初代诱导丛芽培养基为m s + 6 - b a l 0 m g l ( 单位下同) + n a a 0 1 m g l ，继代培养基为1 2 m s + 6 一b a 0 5 + n a a 0 0 8 + i b a 0 2 ，生根培养基为1 2 m s + i a a l 0 + n a a 0 0 4 。2 2 天后获得丛生芽，4 4 天后诱 导出侧根，生根率达8 8 。 杨培君、陈德经等嘲以金银花“蒙花”品系的茎段为外植体，于惦和b 。附加不同 植物生长调节剂配比的培养基上，探讨愈伤组织形成和丛生芽诱导及生根培养的条件， 诱导愈伤组织和丛生芽的培养基为b 5 + 6 一b a 2 0 + k t ( 激动素) 0 2 o 5 + i a a ( 吲哚乙 酸) 0 5 1 o + l i - i ( 水解乳蛋白) 1 0 0 0 ，继代增殖培养的培养基为b 5 + b a 2 o + k t 0 5 + i a a l 0 + l h l 0 0 0 和b 5 + 6 b a 2 0 + k t 0 3 6 + i a a l 0 + c h ( 水解酪蛋白) 1 0 0 0 + 6 g - 西大茸明曩士掌位僦演 1 2 m s ，生根培养基为1 2 m s + i b a ( 吲哚丁酸) 0 2 + l h l 0 0 0 。结果表明，l h 和c h 在金银花愈伤组织和丛生芽诱导方面具明显的作用。接种1 0 1 5 天后获得丛生芽，2 0 天后诱导出不定根。 李景刚、孙满芝汹1 利用金银花良种p m l 的嫩枝梢作为外植体，进行离体培养，研 究出其生长分化的基本培养基为m s ，最佳分化培养基为m s + 6 b a 2 0 + n a a 0 1 ，分化 率为9 3 ，最佳生根培养基为1 2 m s + n a a 0 3 ，生根率9 6 。 覃拥灵田1 以宜州当地主要金银花品种皱叶忍冬的茎段为外植体材料，接种于附加不 同植物生长调节剂配比的m s 和1 2 m s 培养基上，研究出丛生芽诱导及生根诱导的条件。 试验结果表明：丛生芽诱导和继代培养的培养基为m s + 6 b a o 5 + i b a 0 0 5 ，生根培养 基为m s + i b a l 0 + n a a 0 0 5 。 赵秀芳嘞1 采用不同诱导、增殖和生根等培养基进行的红金银花离体快繁技术的研究 结果表明：丛生芽诱导以m s + 6 - b a 2 0 3 0 + n a a 0 2 培养基为好；m s + 6 b a 2 0 + n a a 0 2 + c w ( 椰汁) l o o m l l 为增殖培养基可以获得理想的效果，增殖倍数这4 9 倍；在不含任 何植物生长调节剂的1 2 m s + 0 1 5 活性炭培养基上即可形成较发达的根系，生根率达 1 0 0 9 6 ：试管苗移栽对基质要求不严，移栽到疏松透气的蛭石+ 珍珠岩+ 园土( 1 ：1 ：1 ) 混合 基质中，成活率可达9 2 。 仇键、谭晓风呻1 研究了蒙花1 、2 号金银花带芽茎段的丛芽诱导和快速繁殖技术。 结果表明：初代培养以m s 为基本培养基，附加6 - b a l 0 + n a a 0 2 诱导腋芽能得到理想 的效果；在继代培养中，通过6 - b a 和n a a 的组合试验，发现m s + b a l 5 + n a a 0 0 2 、 m s + b a l 5 + n a a 0 0 5 、m s + b a 2 0 + n a a 0 0 5 培养基诱导丛芽效果都较好；将无菌苗置 于1 2 m s + n a a l 0 的培养基诱导生根，萌发率高达9 2 9 6 。 黄守印、张福州以北京忍冬带叶柄茎段为外植体，用m s + 6 b a 2 5 + z t ( 玉米素) 0 5 + i b a 0 5 为培养基，使9 4 的外植体腋芽萌发，增殖系数1 2 ，在1 2 m s + i b a l 0 培养基 上，生根率为7 8 7 ，移栽入珍珠岩+ 腐殖土= 1 ：l 的基质内，成活率为1 0 0 。 王晓明、易霭琴等m 1 以灰毡毛忍冬新品种金翠蕾、银翠蕾和白云为研究对象，取 当年抽生的嫩枝茎段为外植体，采用单因素、双因素试验和正交试验设计，研究了不同 时期的外植体、灭菌处理与植物植物生长调节剂对接种污染率和无菌外植体得率的影 响。研究结果表明，春季带顶芽的嫩茎为接种培养的最佳外植体，消毒灭菌处理则以7 5 酒精浸泡1 0 s 后，在加有2 3 滴吐温8 0 的0 1 升汞溶液中浸泡5 m i n 为最佳。试验获得了 灰毡毛忍冬3 个新品种所适宜的初代培养基：金翠蕾和银翠蕾为m s + 6 b a l 0 + n a a 0 1 ， 7 广西，叫弗习n b 摩啦论文 白云则为m s + 6 - b a l o + m a 0 1 。 到目前为止，国内有关研究单位已对5 6 种金银花的组培快繁进行了研究，并获得 了组培苗，但关于组培苗移栽方面的报道很少。 5 4 细胞培养 随着组织培养技术不断发展，细胞培养的方法己从固体、液体、悬浮培养，深层大 罐发酵发展到液体连续培养；培养材料包括药用植物的根、茎、叶、胚、果实、种子等 组织器官，诱导出的愈伤组织或冠瘿组织。目前这项技术己发展成一门精细的实验技术， 在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保存、分离鉴定等方面建立了一整套完整的技 术方法蚴。 1 钛e s h ih o f i i l 【e 旧1 用可溶性乙烷基醋酸盐的培养基对金银花进行细胞悬浮培养，成 功诱导出了五种羟孕甾二酮，同时从产物中确定了倍半萜烯以大根香叶烷为构架。 h i r o b u m iy 锄锄t o 嘲1 在对金银花进行细胞悬浮培养过程中发现并没有产生任何环 烯醚萜和葡萄糖苷。但是，细胞却有能力转变马钱苷为裂环马钱苷，也同时可以把羟化 酶转变为马钱苷和裂环马钱苷。但其中的香叶醇就不能转变为环烯醚萜葡萄糖苷和裂环 马钱苷。在金银花的细胞培养中，缺乏相应的酶把葡萄糖苷转化成环烯醚萜可能是导致 没有任何裂环马钱苷的原因。 n o b u 删i 缸柚。呻1 在对金银花进行悬浮培养中发现了一种酶粒子，它可以将脱氧马 钱苷转化为马钱苷。这种酶粒子的反应被一氧化碳和细胞色素p 4 5 0 所抑制。这一反应 主要是依赖于分子氧和h a d p h 。试验中还确定了这种酶的反应底物为脱氧马钱苷。 6 研究目的及意义 6 1 保护山银花品种资源，为广西山银花种植业发展提供有力的技术支持 据有关资料报道，中医三分之一方剂中用到金银花，而同时根据中国经济林学会最 新统计表明，目前全国金银花实际年产量为5 0 0 万6 0 0 万k g ，而社会年需求量大约为 1 7 0 0 多万k g ，供需缺口很大，仅靠野生资源难以满足市场需求。另外由于人为的开荒 种地，致使华南忍冬的野生资源逐年减少，有些地区已濒临灭绝。这无疑给人工种植金 银花留下了较大的发展空间嘲。广西这几年来也开始引种山银花，建立山银花的种植基 地。忻城县境内8 0 为石山地区，由于耕地的缺乏难以大面积的种植农作物，从而阻碍 了该县经济的发展。山银花种植业作为典型喀斯特峰丛地区特色经济项目，现已在忻城 8 广西大尊u 曩士学位论文 县取得了较好的收益。该县目前种植山银花面积已达7 0 6 万亩，建立生产示范基地9 个。 现全县年鲜花总产量达3 4 0 0 多吨，实现销售收入1 7 0 0 万元。山银花种植业已逐渐成为 忻城县继甘蔗，桑蚕之后的支柱产业呻1 。该县计划3 年内将山银花的种植面积扩大到2 0 万亩，这就需要至少4 0 0 多万株种苗的供应。一般的育苗方式为种子繁殖和扦插繁殖。 山银花种子的萌发率不高，经播种成活后的山银花植株要种植3 年以上才可以开花。使 用营养繁殖如扦插繁殖的方式植株第2 年可开少量开花，但是扦插成活率不高，成活的 植株容易在盛花后出现早衰。 因此，通过有性和无性繁殖的方式均不能在短期内大批量的繁殖生产山银花种苗。 植物组织培养一年四季均可生产种苗，不受地区、季节及有害生物的影响，通过植 物组织培养得出的植物个体又可与母体保持性状的一致性旧1 。因此，通过植物组织培养 可以短期内提供大量的金银花种苗。资料显示，罗汉果扦插苗第2 年开始开花，而罗汉 果组培苗具有当年种植当年开花结果，结果早、多等特点。本试验以成熟山银花植株 为组织培养材料，如果培养出的组培苗当年定植大田就可开花，使山银花植株提前l 2 年进入盛花期，这对于提高山银花种植的经济效益具有很重要的现实意义。 6 2 探索本地山银花的植物组织培养快速繁殖的技术 目前国内对金银花的植物组织培养快速繁殖已有一部分的研究，但研究的材料主要 是北方地区当地种植品种，如山东的凤爪金银花、“蒙花”品系金银花等。这些研究虽 对本试验有一定的借鉴作用，但是由于品种不同，植物的基因型也不同，在使用同样的 培养方法对不同基因型金银花进行培养时也会产生不同的效果。因此，很有必要对适宜 在广西种植的山银花迸行系统的组织培养研究。 广西本地也种植有大量的金银花，如山银花、毛花柱忍冬等品种。其中，山银花中 绿原酸的有效含量比很多金银花品种要高，忻城县测定本地的山银花绿原酸平均含量达 4 4 5 ，而区外的平均为4 0 9 。所以，国内对广西本地种植的山银花需求量很大。目前 国内还没有对广西山银花品种进行组织培养快速繁殖的相关研究报道。 本试验以在广西种植的山银花其中一个品种华南忍冬伍伽把盯口c 册肛蛐d c ) 为材料 进行组培快繁研究，研究成果可以为山银花种苗大批量生产开辟一条新途径，同时也可 以给广西山银花的优良品种选育、良种推广提供科技支持。 9 第一章材料和方法 1 1 试验材料 1 1 1 初代培养材料 广西药用植物园种植的华南忍冬当年生幼嫩枝条。 1 1 2 继代增殖培养材料 初代培养中由华南忍冬腋芽诱导出的单芽。 1 1 3 生根培养材料 继代增殖中生长健壮的无根苗。 1 1 4 移栽试验材料 生根培养中长出根的无菌苗。 + 1 1 5 其它供试材料 萘乙酸( n a a ) 为中国医药( 集团) 上海化学试剂公司生产，有效成分i 9 8 o 。 6 苄基腺嘌呤( 6 - b a ) 为中国医药( 集团) 上海化学试剂公司生产，有效成分 1 9 8 o 。 3 吲哚丁酸0 b a ) 为中国医药( 集团) 上海化学试剂公司生产，有效成分i 9 8 o 。 多效唑( m e t 、p p 3 3 3 ) 为江苏建湖农药厂生产，有效成分9 9 o 。 凝固剂用合浦琼脂厂生产的琼脂粉( 7 0 0f l c m 2 ) 。 糖为大明山糖厂生产的食用白糖。 1 2 试验方法 1 2 1 外植体灭菌 将华南忍冬嫩枝去除叶片后剪成1 o 1 5 c m 长带腋芽的茎段，用洗衣粉溶液和高锰 酸钾分别浸泡1 5 m i n ，随后用清水漂洗1 h ，在超净工作台上进行灭菌。使用四种灭菌方 式对外植体进行灭菌处理：分别是3 次氯酸钠灭菌7 1 1 m i n ：7 5 酒精浸泡1 5 3 5 s ； 0 1 升汞溶液( 力吐温8 0 ) 中灭菌7 1 0 m i n ：先用7 5 酒精浸泡再用o 1 升汞溶液 ( 加吐温8 0 ) 处理。最后用无菌水冲洗5 6 次，接种在m s + b a 2 0 + n a a 0 0 5 培养基上， 2 0 天后统计污染率和腋芽萌发率，筛选出适合的灭菌方式。 1 。2 2 基本培养基的筛选 将经灭菌处理后带腋芽的茎段接种于附加植物生长调节剂的m s 、b 5 两种培养基 1 0 广冒r 大学习i 士掌位能譬屯 上，每个处理接种3 0 瓶，每瓶一个茎段，每7 天记录一次芽萌发率和芽生长情况，筛 选适合山银花腋芽萌发培养的基本培养基。 1 2 3 初代培养 将经灭菌处理后的山银花茎段接入不同植物生长调节剂配比的培养基中，每处理1 5 瓶，每瓶2 个茎段，3 0 天后统计平均出芽数、萌发率、芽生长状况。 1 2 4 继代培养 当由腋芽形成的丛芽长至0 5 1 c m 时，将其从茎段上切下接入到不同植物生长调 节剂配比的培养基中，每处理1 5 瓶，每瓶接种2 丛丛芽，3 0 天后统计平均出芽数、芽 生长状况。 1 2 5 生根培养 当丛芽长至1 5 2 0 c m 时，将其切开分为单芽，接入到不同植物生长调节剂配比 的培养基中，每处理1 0 瓶，每瓶接种2 个芽，每1 5 天记录一次生根情况。 1 2 6 移栽试验 将生根的无菌苗从培养室中取出放在室外炼苗3 0 天后，再将生根苗从瓶中取出洗 去基部的培养基后假植到营养杯内，基质为河沙与塘泥土混和物，定期浇水，覆盖薄膜， l o 天后揭膜，揭膜后2 0 天统计假植成活率，统计假植成活率后移栽到大田。 1 3 培养基 各种培养基中都附加白糖3 ，琼脂0 4 5 ，p h 值为6 7 ，在1 1k g 锄、 1 2 1 条件下灭菌2 0m i n 。 1 3 1 基本培养基 m s 、1 3 5 培养基 1 3 2 初代培养基 将腋芽茎段接种于附加不同浓度的6 - b a 、n a a 的m s 培养基上： m s + 6 b a l 0 + n a a 0 1 ( 窑) m s + 6 - b a l 5 + n a a 0 1 m s + 6 - b a 2 0 + n a a 0 1 m s + 6 一b a 2 5 + n a a 0 1 m s + 6 b a l 0 + n a a 0 1 5 m s + 6 b a l 5 + n a a 0 1 5 m s + 6 一b a 2 0 + n a a 0 1 5 m s + 6 一b a 2 5 + n a a 0 1 5 c k ( 空白) m s + 6 b a l 0m s + 6 b a l 5 廷p m s + 6 b a 2 0 ( ) m s + 6 b a 2 5 m s + 6 - b a 3 0 1 1 g - 西，叫塾礓士掌位论文 山氟花的膏l | 鼠培养 1 3 3 继代培养基 ( d m s + 6 b a 0 5 m s + 6 b a0 8 ( 耍) m s + 6 - b a1 1 m s + 6 b a 1 4 m s + 6 b a1 7 m s + 6 b a 2 0 m s + 6 b a 2 3 m s + 6 b a2 6 c k o m s + 6 - b a l 0 + n a a 0 0 5 m s + 6 - b a l 5 + n a a 0 。0 5 m s + 6 - b a 2 0 + n a a 0 0 5 1 3 4 生根培养基 1 2 m s + i b a 0 3 ( 室) i 2 m s + i b a0 6 1 2 m s + i b a 0 9 1 2 m s + i b a1 2 i 2 m s + i b a1 5 c k 1 2 m s + n a a 0 0 5 1 2 m s + n a a0 1 1 2 m s + n a ao 1 5 1 2 m s + n a a0 2 1 2 m s + n a a 0 2 5 1 2 m s + m e t0 5 1 2 m s + m e t1 0 1 2 m s + m e t1 5 1 2 m s + m e t2 0 1 2 m s + m e t2 5 ( 孙2 m s + n a , 4 d 1 5 + m e f l 2 ( 蛩i 2 m s + n a 4 d 2 + m e r l 6 ( 耍a 2 m s + n a 4 0 2 5 + m e l 2 0 1 4 培养条件 培养室光照强度为1 5 0 0 2 0 0 0 l x ，光照时间为每天1 2 1 4 小时，温度为笛 - - 2 8 c 。 广西，叫蝴士掌位性文 第二章结果与分析 2 1 灭菌方式的确定 华南忍冬外植体的灭菌处理比较困难，因为华南忍冬茎部中空，幼嫩茎、叶、芽表 皮附着疏柔毛和疏腺 7 0 1 ，灭菌剂难以完全杀灭表皮和茎段内部附带的细菌和霉菌。灭 菌剂处理时间太短，污染严重，时间稍长，对组织产生毒害容易导致腋芽盼萌发困难。 因此本次试验采用多种灭菌剂及不同的时间对其进行灭菌处理。 用3 次氯酸钠、7 5 酒精、o 1 升汞( 加吐温8 0 ) 处理山银花外植体茎段，接入 m s + 6 b |