（有机化学专业论文）毛细管电色谱硅胶整体柱的制备与性能研究.pdf

南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 中文摘要 毛细管电色谱( c e c ) 是毛细管电泳( c e ) 和高效液相色谱( h p l c ) 的融合技术。它既 具有h p l c 高选择性的优点，又具有c e 高柱效、高分辨率、高选择性、快速、微量的优势。 毛细管电色谱作为一种新兴的微分离技术发展迅速，潜力巨大，是当今分析化学的研究热 点。然而一些涉及色谱柱和分离模式的实际困难，如气泡问题、色谱柱寿命短问题等大大 限制了毛细管电色谱的发展，使其尚不能作为有效的标准分析手段。目前专用制备色谱柱 的改进以及新型分离模式的研究已成为进步开发电色谱潜力的关键，其中毛细管电色谱 整体柱的研究是公认有效解决上述困难的有效途径之一，也是当今电色谱研究的前沿课 题。 本论文采用热引发一步法制备毛细管电色谱硅胶整体柱。系统的研究并优化了制柱条 件，考察了单体比例、盐酸浓度、毛细管内径以及制柱反应时间等因素对柱制备的影响。 而且还通过使用表面活性剂或交联剂解决了均相的难题。本文在电色谱上评估了整体柱的 性能，深入探讨了有机溶剂比例、p h 值、电压以及温度等电色谱操作条件对电渗流、保留 机理和柱效的影响。实现t 9 种苯的同系物和多环芳烃的基线分离；还基线分离了7 种中性、 酸性和碱性物质。该柱柱效超过l1 0 ，0 0 0 p l a t e s m 。 关键词：毛细管电色谱，毛细管整体柱，硅胶整体柱 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e t r o c h r o m a t o g r a p h y ( c e c ) i s an e wm i n i a t u r i z e d s e p a r a t i o nt e c h n i q u e t h a t c o m b i n e st h e a d v a n t a g e s o f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p hf h p l c ) d u et oh i g he f f i c e n c y , h i g hs e l e c t i v i t y , r a p i ds e p a r a t i o n a n dl o w c o n s u m p t i o no fb o t hs a m p l e sa n ds o l v e n t s ，c e ch a sr e c e i v e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o ni nr e c e n t y e a r sa n de v o l v e da sap r o m i s i n ga n a l y t i c a lt e c h n i q u e h o w e v e r ，t h e r ew e r es t i l lp r o b l e m sa n d d i f f i c u l t i e sa s s o c i a t e dw i t hb u b b l ef o r m a t i o na n dc o l u n m d r y - o u ti nc e c t h e s ep r o b l e m s c a nb e a d d r e s s e db yc a p i l l a r ym o n o l i t h i cc o l u m n t od a t a , t h i st e c h n i q u eh a sb e e nt h em o s ti n t e r s t i n g 6 e l d i n c e c b yo p t i m i z i n gp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n ，w ep r e p a r e dd i f f e r e n th e a ti n i t i a t e ds i l i c am o n o l i t h sb ya o n e s t e p ，i ns i t u ，p r o c e s s f u r t h e r m o r e ，u s i n gs u r f a c t a n to rc r o s s l i n k e rw e o v e r c a m et h ep r o b l e m o f h e t e r o g e n e o u s r e a c t o ra n do b t a i n e dt h eh o m o g e n e o u sr e a c t o ri na d d i t i o n ，d i f f e r e n tp a r a m e t e r s s u c ha st h ev o l u m eo f a p p l yv o l t a g e ，b u f f e rp h ，a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o na n dc o l u m n t e m p e r a t u r e ，w e r ev a r i e dt oa s s e s st h e i ri n f l u e n c eo nr e t e n t i o nm e c h a n i s m ，e l e c t r o o s m o t i cf l o w ( e o f ) a n dc o l u m ne f f i c i e n c i e s u s i n gt h i sc o l u m n a v a r i e t yo fp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s w e r es e p a r a t e df r o mm i x t u r ew i mt h e o r e t i c a lp l a t en u m b e r s g r e a t e r t h a n110 0 0 0p l a t e s m k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e t r o c h r o m a t o g r a p h y , c a p i l l a r ym o n o l i t h i cc o l u m n ，s i l i c am o n o l i t h i c c o l u m n 南9 t - 大掌学位论文电子版授权使用协议 ( 请将此协议书装订子论文首页) 论文毛细管也色语硅妖登氐裢钧蝴性能稀失系本人 在南开大学工作和学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩。 本人系本作品的唯一作者( 第一作者) ，郎著作权入。现本人同意将本作品 收录于“南开大学博硕士学位论文全文数据库”。本人承诺：已提交的学位论文 电子版与印刷版论文的内容一致，如因不同面引起学术声誉上的损失由本人自 负。 本人完全了解亩珏盍堂国量丝羞王馐盎! 篮囝堂焦论塞的鳘堡赴鎏。同 意南开大学图书馆在下述范围内免费使用本人作品的电子版： 本作品呈交当年，在校园网上提供论文目录检索、文摘浏览以及论文全文 部分浏览服务( 博士论文前2 4 页，硕士论文前1 6 页) 。公开级学位论文全文电 子版于提交1 年后，在校园网上允许读者浏览并下载全文。 注：本协议书对于“j 兮公开学位论文”在保密期限过后同样适用。 院系所名称：但孽院元磊所 作者签名：邵车 学号：0 id 3 i i 日期：2 0 0 4 年s 月工。日 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 第一章前言 1 1 毛细管电色谱技术回顾 近年来，一种新兴的微柱分离分析技术受到广泛关注，并成为研究热点之一。这种新 兴技术就是毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，简称c e c ) 。c e c 是在毛细管 中填充或是在毛细管内壁涂布，键合色谱固定相，依靠电渗流( e l e c t r o o s m o t i c ，e o f ) 推动 流动相，使样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附，分配平衡常数的不同和电泳 速率的不同而达到分离分析的一种电分离模式。c e c 是毛细管电泳( c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 和高效液相色谱( h i 【g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 的 融合技术。它既具有h p l c 高选择性的优点，又具有c e 高柱效、高分辨率、快速、微量 的优势。在c e c 分离过程中，色谱和电泳两种机理同时作用，增加了分离效率，克服了 c e 选择性差，难以分离中性物质的困难，开辟了高效微分离技术的新途径。因此，c e c 在近年来倍受关注，并且在生物分析、环境分析、药物分析和法医鉴定等多个领域得到广 泛的应用。 早在2 0 世纪5 0 年代初期，m o l d 等【i 】就将电场引入薄层色谱系统，利用电渗流作薄层 色谱流动相的推动力，分离了胶棉中多糖成分。1 9 7 4 年p r e t o r i o u s 等忙奇电场引入毛细管 填充柱色谱，显示出e o f 作为流动相推动力进行分离的巨大优势。但是，由于当时石英毛 细管尚未面世，p r e t o r i o u s 等采用的柱直径较大，没有把毛细管电色谱的优越性充分发挥出 来。 j o r g e n s o n 等p 】在1 9 8 1 年发表了在毛细管电色谱发展史上具有里程碑意义的论文。他们 在1 7 0 p m 内径的毛细管中填充1 0 p r o 的o d s 固定相，以电渗流推动流动相，成功的分离 了中性化合物9 一甲基蒽和芘。获得了3 1 ，0 0 0 理论塔板数的柱效，并指出固定相的不规则 性对样品的区带展宽影响不大。就是这篇论文的发表，使得毛细管电色谱受到人们的广泛 关注。1 9 8 2 年，t s u d a 等1 4 在毛细管壁键合固定相，首次实现了电驱动丌管液相色谱，即 开管电色谱( o t - c e c ) ，并对多环芳烃进行了分离。随后，m a r t i n 等 5 , 6 1 对丌管毛细管电色 谱中的轴向扩散和峰展宽进行了研究，从理论上证实了以电渗流作为流动性推动力的优越 性。1 9 8 7 年和1 9 8 8 年，k n o x 等1 7 , 8 1 在5 0 p m 内径的毛细管中填充粒径为5 p m 的填料，获 得较高的理论塔板数。并证明了在电渗流驱动体系中，可以使用更细粒度的填料。此外， 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 他们还对压力和电渗流作为雅动力的两个体系中的流型、区带展宽、焦耳热效应进行了比 较，并对毛细管电色谱中的双电层现象进行了系统研究。 1 9 9 0 年，t s u d a t 9 l 等发展了毛细管电色谱连续进样技术，利用压力流和电渗流进行样品 富集和分离。1 9 9 1 年，k n o x 等i l0 1 从理论上揭示了填料粒径和电介质浓度对电渗流的和柱 效的影响。并完善了他们所发展的毛细管电色谱理论。同年，v e r h e i j 等1 首次实现了c e c 和质谱的联用。1 9 9 2 年，y a m a m o t o 等1 1 2 1 研究了线性流速和拄效的关系，在不降低柱效的 前提下，线性电渗流速可以增加到3 m m s 1 。，重现性很好，相对标准偏差小于2 。同年， m a y e r 等f ”嘈次在毛细管丌管柱上实现手性分离。1 9 9 3 年，“等m 7 利用蛋白质固定相填充 柱实现了c e c 手性分离。1 9 9 4 年s m i t h 等【l 习采用电色谱分析药物，通过加压抑制气泡， 获得了3 8 0 ，0 0 0 理论塔板数米的柱效。同年，b a y e r 等【l 叫利用高压液相色谱泵首次实现了 毛细管电色谱的梯度洗脱，并利用该技术成功的分离了寡聚核苷酸。r e b s e h e r 等【l7 】首次提 出毛细管电色谱填充柱区带展宽因素的试验测量方法。j a c o b s o n 等i l8 】制作了第一个毛细管 电色谱芯片。1 9 9 5 年，y 缸在1 5 0 “m 内径毛细管中填充了9 0 的3 p r o 的o d s 和1 0 的1 m 硅胶颗粒，通过激光诱导荧光检测，获得了4 0 0 ，0 0 0 理论塔板数米的柱效，并发明 了毛细管电填充技术瞄o j 。s m i t h 等25 埽用离子交换电色谱分离酸性药物获得了0 , 9 - - 2 以 及o 0 4 的折合塔板高度，充分显示了c e c 的巨大潜力。g u o 等陋1 人首次利用溶胶一凝胶 技术制备开管毛细管柱。1 9 9 6 年，y a n 2 3 】等利用双高压电源，实现了电渗流驱动了流动相 梯度洗脱，并成功分离1 6 种芳香化合物。f u j i m o t o 等 2 4 3 首次制备了连续床毛细管电色谱 丰t 。1 9 9 7 年，h o r v 6 t h 等【2 5 1 对毛细管电色谱的动力学进行了系统研究，考察毛细管电色谱 填充柱中填充部分和开管部分不同的电渗流和电导。s t a h b e r g l 2 州也对毛细管电色谱中的区 带迁移理论进行了研究。1 9 9 8 年，s t e a d 等2 7 1 研究了毛细管电色谱柱上的浓缩技术，应用 于血浆中淄类药物的分析。b a y e r 等 2 31 人首次实现了毛细管电色谱与核磁共振的联用，次 年，h o r v 6 t h 等【2 9 1 进一步发展了毛细管电色谱的动力学理论，对毛细管电色谱和高压液相 色谱中影响柱效的各个参数进行了比较。p o p p e 等1 3 0 】研究了大孔填料在毛细管电色谱填充 柱中的性能和应用。2 0 0 0 年l i u 等1 3 1 1 实现了c e c 和i c p m s 的联用技术，并应用于金属 离子的分析中。h i e r t 6 n 等【3 2 1 制备了整体柱c e c 芯片。近年来，毛细管整体柱成为c e c 的 热点课题，引起了广泛关注1 3 3 - 3 7 】。几个研究小组从不同角度进步发展了毛细管电色谱理 。论【3 8 4 0 。 综上所述，毛细管电色谱的发展历史虽短，但是在理论、技术、仪器和应用等方面发 展很快，并己迅速成为分析化学的研究热点。同时也要看到，毛细管电色谱发展还很不完 2 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 善，理论相对于实验滞后，缺乏统一的指导性理论；仪器设备和柱制备技术仍处在探索性 研究阶段，还不能达到完善、专用、商品化的水平来满足应用的需求：虽然在多个领域得 到应用，但还不能成为有效的鉴定标准，尚有很大的发掘潜力。 1 2 整体柱的研究进展 由于生命科学、新药开发和环境科学飞速发展的需要，液相色谱、微柱液相色谱和毛 细管电色谱越来越受到人们的广泛关注，但是由于它们本身存在一些缺陷，例如：传质扩 散慢和填料间无效体积大，这些缺陷导致2 0 年来，传统商品h p l c 色谱柱的柱效一直徘徊 在1 0 ，0 0 0 3 0 ，0 0 0 p l a t e s m 。尽管研制出来一些新的固定相，如：非多孔颗粒和灌注色谱 填料，意图解决这些问题，但实际上并未从本质上鳃决。直到一种新型固定相整体固 定相出现。 整体柱被认为是填充柱和开管柱理想的替代者，是近年来国际上柱制备研究的热点。 整体柱( m o n o l i t h i cc o i u m n ) ，又称捧柱( r o d ) 、连续床层( c o n t i n u o u sb e d ) 、无塞柱 ( f r i t l e s sc o l u m n ) 。这是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床 固定相。这种色谱柱制备方法很简单，把配置好的单体、添加剂、致孔剂和引发剂等混合 物装入空的色谱柱内，经过一段时间的聚合反应之后。就形成整体色谱柱。由于使用了聚 合方法，可以往固定相中引入各种可能的作用基团，有很强的灵活性。同时，用原位聚合 制得的整体色谱柱要比常规填装的色谱柱多孔性和渗透性好，具有灌注色谱的特点，即色 谱柱中既有流动相的流通孑l ( 接近l 陋) ，又有便于溶质进行传质的中孔( 几十个纳米) ， 因而可以对生物大分子进行快速分离，而且色谱柱的稳定性很好。并且在毛细管电色谱中 使用整体色谱柱，可以避免塞子的制作这一难题，并排除了由塞子产生气泡的烦恼。 1 9 6 7 年，k u b i n ”制作出第一个整体色谱柱。他使用膨胀性较强的聚( 2 羟乙基甲基 丙烯酸酯) 凝胶代替多糖凝胶，作为低压体积排阻色谱的固定相来分离蛋白质但是这种 整体色谱杠渗透性太差，难以在实际中应用。在7 0 年代初，r o s s 等”使用通孔的聚氨 酯泡沫作为气相色谱的固定相，但是这类固定相非常容易胀润，而且在一些溶剂中易于软 化，未能得到实际应用。8 0 年代末9 0 年代初。瑞典u p p s a l a 大学的h j e r t 6 n 系统的研究了 常规液相色谱整体柱和毛细管液相色谱整体柱“+ ”3 。9 0 年代后该实验室在c e c 上使用了整 体色谱柱，进行了大量研究。同时有许多著名专家进行了各种模式、各种类型整体柱的研 究。c e 的出现极大的改善了原来h p l c 柱效低的缺点，为整体柱的研究带来了无限的机遇， 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 成为当今分析化学的热点课题。 目前，整体色谱柱主要有三类：硅胶整体柱、粒子圃定整体柱、有机聚合物整体柱。 1 2 1 硅胶整体柱 尽管在2 0 世纪7 0 年代末，就已经报道过由硅酸盐表面活性裁制得的连续硅胶载 体“，但是真正进行色谱应用的硅胶整体柱却是1 9 9 6 年才出现的。到目前为止，有两种 制备硅胶整体柱的方法。 1 9 9 6 年f i e l d i s o 】介绍了一种方法，将熔融石英柱充满硅酸钾溶液，1 0 0 c n 热l h ，然后 清洗柱子，再用氮气在1 2 0 下干燥2 4 h ，之后，在干燥甲苯中使其充满1 0 的二甲基十 八烷基氯硅烷( o d s ) ，7 0 加热5 h 。待反应结束后冲洗柱子，此柱用于反相h p l c ， 尽管此法得到了带有2 岬尺寸微小孔径的连续硅胶，但其结构不具有均匀性。 同年，m i n a k u c h i 等用溶胶凝胶割成了具有均匀结构的整体柱。多孔硅胶棒是 通过烷氧基硅烷的水解、浓缩来制备的，其中伴随着在水溶性有机聚合物存在下的分阶段 分离。分离过程包括凝胶、陈化和干燥。具体过程如下：向聚环氧乙烷水溶液中加入四甲 基硅烷和适当的催化剂，如乙酸。将混合物在0 c 搅拌3 0 m i n 。将得到的均匀溶液加入到 一个圆柱状的聚碳酸酯模型中，使之在4 0 c 下反应。2 h 内出现凝胶，接着，将胶化的样 品在相同温度下陈化1 h 。用蒸馏水冲洗已经形成的湿硅胶棒为了得到中孔结构，接着要 将湿硅胶棒漫在氨水溶液中。然后对其进行充分的蒸发干燥、热处理，这样可以使有机成 分分解，并使亲水硅胶表面稳固。由于在陈化和干燥过程中凝胶收缩。凰此目标硅胶将被 包裹在热收缩的聚四氟乙烯( d t f e ) 柱中，外压压缩确保了硅胶和管壁间没有空隙。通过 柱上反应可以使硅胶棒十八烷基砖烷化劭e a 上。用这种方法，得到的硅胶棒通孔为1 2 斗m ，中f b j 为5 2 5 p m ，硅胶棒表面积达到3 0 0 4 0 0 m 。g 垆”。 h a y e s 等人【5 2 】提出了一种利用一步溶胶凝胶过程制备整体柱的方法，其中他们使 用一种商业化的溶胶前体c 。8 一t m s 与毛细管内壁的硅羟基键和的方法，将固定相颗粒固 定在柱中。具体过程如下：将四甲基硅烷、溶胶前体c 1 8 一t m s 、苯基二甲基硅烷与三氟 甲酸混和并搅拌5 m i n ，1 3 ，0 0 0 r p m 下离心，滤去沉淀物，上清波放跫备用。毛细管表面用 去离子水在2 0 0 p s i 的氦气流下冲洗1 5 m i n ，然后用同样压力的氦气流吹干。毛细管两端用 氧一乙炔矩熔化封口，并以o 5 。c m i n 的速度从4 0 。c 加热至2 5 0 。c ，并保持6 0 m i n 。然后 打开毛细管两端封口，再用氦气流处理3 0 m i n 。取6 0 c m 的毛细管一段用氧一乙炔炬封 4 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 口，用l o o p s i 的压力下将溶胶一凝胶前体溶液压入毛细管内，距封口l o c m 处停止，为以 后开紫外检测窗口预留一段空间。溶胶溶液经过4 h 后形成凝胶。用环氧树脂封住毛细管 端口。自3 5 c 以0 2 m i n 的速度程序升温至1 5 0 c ，保持1 2 0 m i n 后，使用氧化铝晶片 打开两个封口，并立即开检测窗口，得到的整体柱即可使用。 c h e n 和h o b o “”制备了通过配体交换电色谱进行分离的手性整体柱。硅胶基质首先采 用溶胶一凝胶过程制备，然后用3 一缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷( y g p s ) 衍生化，后 者再与苯丙酰胺反应。用该柱对丹酰一卜l e u 和丹酰一l l e u 的柱效分别为9 0 。0 0 0 和 6 6 ，0 0 0 p l a t e s m d u l a y 等人o ”使用原位光聚合法制备溶胶一凝胶整体柱，制备和功能化步完成。该 法除了制备时间短以外，还有许多优点，如可控s t i l l 径、控制形成的凝胶柱在毛细管中的 位置和长度。高机械强度和制备过程的低温避免了高温导致床层断裂。其柱渗透性好，可 用注射器推出末反应试剂。该柱柱效超过1 0 0 ，0 0 0 p l a t e s m 。其具体制备过程为：甲基丙 烯酸氧丙基三甲氧基硅烷( m p t m s ) 的盐酸( 酸催化剂) 溶液中加入不同含量致孔剂( 甲 苯) 、引发剂( i r g a c u r el ，0 0 0 ) ，在室温下搅拌，形成单相溶液。毛细管用刀片刮去1 5 c m 的聚酰胺外层，将单体溶液通入其中，用6 只1 5 w 的紫外灯在3 6 5 n m 照射5 m i n 。然后用乙 醇洗出未反应的试剂，即制得整体柱。 硅胶整体柱的网络渗透性和机械强度高，耐热性、耐溶剂性好。在此种柱中有两种孔 结构( 微米级通孔和纳米级中孔) 。制柱的关键在于具有均匀的合适孔径，使硅胶网络均 匀，当然这是不容易的。还有，由于缩聚反应和在干燥过程中产生毛细力，硅胶整体柱趋 向收缩，甚至产生裂缝，这可能导致柱效很低，甚至柱子完全损坏。不过研究已发现，在 硅胶整体柱填料中掺入有机成分，可以大大减少溶胶一凝胶在干燥过程中的收缩量 5 ”。因 此，对合成嵌入有机固定相的溶胶一凝胶做进一步研究成为热点，当然其中关键在于选择 合适的溶剂体系，此体系应与前体易混和，与最后的溶胶一凝胶相容。 1 2 2 粒子固定整体柱 粒子固定整体柱的柱效和选择性与相同颗粒填充的填充柱柱毂相似。这种方法是将 h p l c 的填料颗粒填充到毛细管中，再采用诸如高温烧结、溶胶一凝胶技术等方式形成连 续床层的整体柱。主要有粒子嵌入法、烧结法、粒子截留法、粒子键和法和粒子装模法五 种制备方式。 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 粒子嵌入法 k n o x 和g r a n t t 5 6 1 制备了粒子嵌入整体柱，他们将填料装入孔径为1 2 m 的厚壁管中， 接着用拉伸玻璃机器将玻璃管拉成毛细管。结果，颗粒嵌入管壁，形成稳定的嵌入整体柱。 这种整体柱的柱效与填充柱一样高，并且流阻比填充柱低。此柱的主要问题在于制备过程 中产生蒸气，必须控制硅胶吸水量和拉制温度。 粒子嵌入接体柱不能使用化学键和硅胶固定相，因为拉伸过程涉及高温，将损坏固定 相。拉伸毛细管不能用熔融氧化硅管制得，因为硅胶将在低于熔融氧化硅熔点时熔化。另 外，p y r e x 玻璃易碎，很难操作。 烧结法 烧结法。7 删是将硅胶基质的填充柱进行热处理，使填料粒子表面熔融并相互联结，从 而被固定形成整体柱。 a s i a i e 等“7 1 用匀浆法制成6 p mo d s 填充柱，经过一系列处理后分别在1 2 0 。c 和1 8 0 ( 2 下进行热处理，填料表面因熔融而相互连接在一起，然后键合c ，。固定相。和普通的填充柱 相比。该法制得的整体柱的机械强度和稳定性均得到改善。在c e c 和一h p l c 模式下对该 柱的柱效进行了考察，发现与新填充的普通填充柱类似。 w i s t u b a 和s c h u r i n g t 5 8 l 使用烧结的方法制备了手性整体柱。他们将多孔硅胶( 5 1 u m ，孔径 3 0 r i m ) 的匀浆液填入毛细管，然后此填充柱分别用o 1 m 碳酸钠、水和丙酮冲洗，并在室 温下干燥过夜。在1 2 0 c 用氦气流吹冲填充柱4 h ，然后升温3 8 0 c 烧结1 0 h 。切去暂时的 柱塞，将5 一l o w v 的c h i r a s i l - - d e x i n 酮溶液在3 0 0 b a r 的压力下压入毛细管，然后将毛 细管置于室温下的g c 柱温箱内，2 3 5 ( 2 及2 b a r 的条件下加热3 天，形成的整体柱分别用 丙酮、水和流动相冲洗。甲苯巴比妥、环己巴比妥、5 一乙基一1 一甲基一5 一正丙基巴比 妥酸、1 一甲基- - 5 - - ( 2 - - 丙基) - - 5 - - 正丙基巴比妥酸、二苯乙醇酮等对映体均在该柱上 获得了满意的分离。 对于粒子烧结整体柱，在填料装入柱内烧结前，填料必须完全干燥，否则，高温时残 留的水或任何其他液体将迅速气化，从而引起柱床裂缝。由于在烧结过程中严格的实验条 件( 高温和碱性n a h c 0 3 ) ，固定相被破坏，结果使柱失活。 粒子截留法 粒子截留法【6 0 6 4 1 是柱子装填后引入能截留填料的溶液进行处理后得到整体柱。 c h i r i c a 等【6 0 i 研究了一种利用溶胶一凝胶技术制备整体柱的方法。具体的方法是：先在 毛细管一端做一个塞子，并在毛细管中装入5 肛m 的色谱填料，再填充硅酸钾溶液，在1 6 0 6 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 下加热数天逐渐形成凝胶，从扫描电镜图中可以看出，在整体柱中形成了多孔填充颗粒， 色谱填料被少量凝胶化的无定型硅胶所包围。c h i r i c a 的整体柱分离多环芳烃时，其容量因 子要比一般没有粘合剂的c ，。的柱子容量因子小，作者认为是因为在形成硅酸盐时，c ，。填 料的孔一部分被堵塞，一部分c 。链被水解。 c h i r i c a 等6 1 1 使用有机基质截留的方法固定反相填料。首先在毛细管一端制备一多i l 塞然后用常规匀浆法填充毛细管柱。在填充过程中，色谱柱层超声数次。当填料填充到 理想的长度时，停泵并逐渐减压，确保床层最小的移动。固定填料用的有机基质包括甲基 丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 、a m p s 和引发剂偶氮二异丁腈( a i b n ) ，致 孔剂为水、正丙醇和1 ，4 一丁二醇三元体系。用5 0 p s i 的气压将单体混合液压入制得的填 充柱，然后，柱两端用胶塞封闭，在6 0 c 反应4 8 h 。聚合完成后除去多孔塞，与一段毛细 管空管相连，并在空毛细管上开检测窗口，即制得该柱。 粒子截留整体柱是将颗粒截留在填充柱大孔硅胶网中。一旦截流完成，毛细管不再需 要塞子，这产生一种均匀的、稳定的填充床层。不同的填料可以被截留。但是由于硅胶干 燥必须缓慢进行，以避免柱床裂缝，因此预制各过程比较费时。得到的柱也是活性的，因 此导致峰拖尾。还有由于截留硅酸盐掩蔽固定相以及在n h 3 0 h 清洗过程中固定相的水 解，导致分析物的保留因子显著降低。 粒子键和法 t a n g 等【6 5 砌j 研究一种类似截留法的方法，把毛细管连接到一个可以拿掉的寨子上，用 超临界c 0 2 把固定相装入毛细管中，把含有四甲基硅烷、乙基三甲基硅烷、甲醇、三氟乙 酸、水和甲酰胺的溶液压入毛细管中，并把颗粒压缩到一定的毛细管长度。凝胶化过程包 括硅烷的水解和聚合，形成一种有机无机的混合体系。在超临界c 0 2 中于室温下2 4 h 或以 不同的温度到2 5 0 几小时就可固化。最后形成的整体柱的凝胶网络中含有紧密装填的固 定相填料。 键和整体柱不能使用化学键和填料和超临界流体c 0 2 干燥，柱的惰性和柱的预制备时 1 自：| 被显著改善。键和整体柱表现出几乎与通常填充毛细管柱相同的性能，但不需要塞子。 用键和整体柱，包括3 m ，1 , 5 0 0 ho d s ，可获得柱效为4 2 0 ，0 0 0 p l a t e s m 。这种柱具有流体 力学渗透性，在压力作用下，很容易用流动相清洗。但是由于填充柱中溶胶一凝胶的压力， 其渗透性比同样填料的填充桂渗透性小1 5 5 j 。幸运的是，由于在c e c 中不存在反压力，流 体力学流阻高并不是问题。 粒予装模法 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 实际上，粒子装模法1 6 9 7 2 】是粒子截留法的一种特例，固定相的装填及粒子截留可在 步操作完成。 d u l a y 等6 9 1 分别在聚乙氧硅烷、乙醇、盐酸等反应物中加入5 1 a m 或3 w n 的o d s 超 声后o d s 颗粒与反应物形成悬浮液，将上述体系装入7 5 h mi , d 的毛细管中，热处理后形 成整体柱填充床。整体柱中色谱填料之间有比较多的溶胶一凝胶，o d s 颗粒的存在可减少 连续床中因干燥时产生的内部压力而造成的裂缝。该柱渗透率高，使用3 岫o d s 的柱效 比使用5 p , mo d s 的柱效高。 粒子装模整体柱具有很好的可渗透性，可将其应用在无高压泵的毛细管l c 中 7 ”。反 相粒子( o d s ) 可以悬浮在前体( 四甲基硅烷) 和溶剂( 乙醇) 组成的溶剂中。但是在溶 胶一凝胶过程中，当前体转变成硅胶时，o d s 颗粒与亲水硅胶填料不相容。结果o d s 颗 粒周围形成裂缝。此外，将o d s 颗粒均匀的装入溶胶一凝胶填料中是很难的，这是因为 它们的极性和密度的差异。 1 2 3 有机聚合物整体柱 与硅胶整体柱相比，有机聚合物整体柱的制备要相对简单和直接。通常，将单体混合 物及致孔剂注入到空柱中，经过热引发、自由基引发和紫外光引发在柱内聚合，然后采用 合适的溶剂并由机械泵和电渗流驱动除去致孔剂和柱内残留的单体”根据制备时选用单 体及致孔剂的不同，聚合物整体柱可分为：聚丙烯酰胺类整体柱、聚甲基丙烯酸酯类整体 柱和聚乙烯类整体柱。 丙烯酰胺类整体色谱柱“8 “1 1 在水相中进行整体柱的聚合 1 9 9 5 年f u j i m o t o 【7 4 7 7 1 进行聚丙烯酰胺整体毛细管电色谱拄的研究。他们使用丙烯酰胺， 亚甲基二丙烯酰胺和2 丙烯酰胺一2 甲基1 丙磺酸混合物在毛细管柱内进行聚合，虽然和管 壁没有键合，但具有很好的稳定性。这种色谱柱的柱效达每米1 5 0 ，0 0 0 理论塔板数，但是 保留时间太长，要比一般毛细管电色谱柱高十倍。f u j i m o t o 认为这种色谱柱的分离机理是 筛分作用f 7 ”。另一方面f u j i m o t o 用疏水性强的n 一异丙基丙烯酰胺代替亲水性的丙烯酰胺， 并且把毛细管壁用双官能团试剂3 ( 三甲基硅烷基) 甲基丙烯酸酯处理，其官能团与管壁 以共价键相结合，该化合物的可聚合基团与交联剂聚合，从而使凝胶结合到管壁上。用水 性缓冲溶液，乙腈做流动相可以分离疏水性混合物，这种色谱柱柱效赢、保留时阳1 也短。具 3 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 有反相色谱的特点。 1 9 9 6 年h j e , r t 6 n 研究组【48 】进行了水溶性丙烯酰胺制备整体色谱柱的研究，其聚合的混 合物包括：丙烯酰胺水溶液，哌嗪二丙烯酰胺，乙烯基磺酸。为了使生成的整体色谱柱具 有疏水性，往聚合混合物中加入甲基丙烯酸十，l 烷基酯或甲基丙烯酸正丁酯。因为后者是 疏水性物质，和前面的水溶性混合物成两相，所以要加入表面活性剂进行超声处理，形成 乳浊液，在加入引发剂之后注入毛细管柱中进行聚合反应。制得的熬体色谱柱在选择合适 的流动相成分后可以把5 个多环芳烃很好地分离开。利用这一整体色谱柱进行分阶段的梯 度洗脱，可以大为改善分离情况，例如把要分离的样品溶于5 0 ：5 0 ( v 厂v ) 的乙腈和水的混 合物中，进样到c e c 系统中，进行分离，稍待片刻，把洗脱流动相换成7 0 ：3 0 ( v ) 的 乙腈和水的混合物再进行分离。作者解释这一现象时认为，这是由于溶质扩散跨越过强溶 剂弱溶剂的界面时使“峰聚焦”，从而使峰变窄，近期的研究证明了h j e n 6 n 的解释。 在使用这种整体色谱柱进行分离时，往洗脱流动相中加入表面活性剂( 不要超过胶束 的临界浓度) 会有利于等度分离【4 8 】。h j e a 6 n 解释这一现象时，认为这是出于表面活性剂的 c 。：链和固定相上的c 。链结合，这样既增加了疏水固定相的浓度又增加了磺酸基团的浓 度，使电渗流提高。固定相浓度的增加使保留时间增加，但电渗流提高又提高了迁移速度， 二者相互抵消，使保留不变而分离度却可以提高，不过这一假说没有得到验证。 最近，h o e g g e r 和f r e i t a g t s l 用一系列不同链长的单体制备聚酰胺整体柱。其使用的单 体包括甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯和丙烯酸己酯。哌嗪二乙酰胺为交联 剂，乙烯基磺酸作为电荷提供者，整体柱孔径的大小由控制致孔剂硫酸铵的含量来决定。 色谱分离可分别控制条件以纯反相或纯正相模式进行。 2 在均相中进行整体色谱柱的聚合 虽然使用水溶液聚合体系制备整体色谱柱取得了不容否认的成功，但是在两相体系早 进行整体色谱柱的制备总是受到一定的限制。主要是疏水固定相所必须的有机单体不溶于 水。而在有机相中进行聚合具有明显的优点：有机物有很宽的极性范围，可以选择从非极 性到强极性的有机物；可以控制整体色谱柱的多孔性。 p a l m 和n o v o t n y 等7 9 】把高疏水性基团结合到聚丙烯酰胺为基质的组织中，使用水缓冲 溶液和n 一甲基甲酰胺，亚甲基二丙烯酰胺，丙烯酸和c 4 ，c 6 或c 1 2 甲基丙烯酰烷基酯。单 体的总浓度控制在5 ，在所有的研究中都保持在这一浓度，在单体混合物中含有6 0 的 二丙烯酰胺，1 0 的丙烯酸，其他3 0 是丙烯酰胺和不同的疏水性单体。混合溶剂的组成 决定于甲基丙烯酸烷基酯的类型，n 甲基甲酰胺的浓度可从5 0 ( 用于甲基丙烯酸丁酯) 9 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 改变到9 5 ( 用于甲基丙烯酸十二烷基酯) 。 这种整体色谱柱只有把聚乙二醇( m r = l o ，0 0 0 ) 加入到聚合化合物中才能得到高的柱 效，聚乙二醇的作用是让丙烯酰胺链有侧向凝聚的作用，从而使整体色谱柱具有多孔性。 这一系统使用常规的过氧化硫酸盐t e m e d ( n ，n ，n 1 ，n 、- 四甲基乙二胺) 作引发剂进 行聚台，得到的整体色谱柱呈不透明的多孔聚合物，在聚合完成之后用电渗流把多余的聚 乙二醇冲洗出去。这一制备整体色谱柱的方法具有很好的重复性，它们都含有丙烯酸烷基 酯，因而都具有反相色谱的特点，当流动相中的有机组分增加时保留值线形地下降。用苯 基酮作模型化合物测定其柱效达3 0 0 ，o o o _ _ 4 0 0 ，0 0 0 p l a t e s m 。这类色谱柱能够有很强的承受 超载的能力，但是峰形会拖尾。使用这种色谱柱分离芳香酮，分析时间不到5 m i n 。他们还 用此柱分离了低聚糖。 k o i d e 和u e n o 在制备以聚酰胺为基质的手性整体柱方面做了大量的工作1 8 0 - 8 3 1 。他们以 聚b 一环糊精或羟甲基取代的b 环糊精聚合物作为手性选择剂，将其与功能单体、交联剂、 致孔剂、引发剂的混合物引入毛细管反应5 小时。带负电荷的凝胶手性柱能分离中性及阳 离子型手性物质，带正电荷的凝胶手性柱能分离阴离子型手性物质。对丹酰氨基酸的手性 分离柱效达到了2 4 0 ，0 0 0 p l a t e s m 。在其后的工作中，为了解决b - 环糊精单体无手性分离能 力的问题，他们又以甲基丙烯酰胺取代的b 环糊精与聚酰胺凝胶共价键合的方法制各了整 体手性柱，对中性及阳离子型手性物质进行了手性分离。近来他们又制备了键合冠醚的聚 酰胺整体柱，1 2 种基本氨基酸在该柱上得到了手性分离，其柱效超过了1 3 5 ，0 0 0 p l a t e s m 。 聚苯乙烯类整体色谱柱【9 2 州l 聚苯乙烯类整体柱使用的单体种类较少，目前所使用的单体仅为苯乙烯、二乙烯基苯， 有不少人进行了研究。例如g u s e v 。”把氯甲基苯乙烯，二乙烯基苯和偶氮异丁腈混合，并 加入各种致孔剂( 如甲醇、乙醇、丙醇和甲苯等) 以及甲酰胺一起，装入经硅烷化的毛细 管中进行聚合，得到的整体色谱柱具有典型的多孔结构，这种大孔包含在薄薄的明显无孔 的聚合物结构中，在整体色谱上有反应能力的氯甲基可以与n ，n 一二甲基辛胺反应在固 定相中引入季胺基团，使整体色谱柱的表面具有正电荷，可以分离碱性和酸性肽。令人惊 奇的是，使用没有功能团的聚( 苯乙烯一二乙烯基苯) 共聚物整体色谱柱和p h = 7 的缓冲 溶液流动相o “，可以分离化学上很类似的三肽( g l y g l y p h e 和p h e g 1 y g l y ) ，在这 种情况下使被分析物移动的力量是电泳力，起分离作用的是固定相。但是往流动相中加入 乙腈会大大降低溶质的淌度，因而使这一方法失去了吸引力。 l o 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 张玉奎等人 粥l 制备了聚( 苯乙烯二乙烯基苯甲基丙烯酸) 共聚物整体柱。他们系统 地研究了操作参数如电压、电解液和有机改性剂的影响，并证实其分离机制为反相机理。 丙烯酸酯类聚合物整体色谱柱i 略1 “i s v e c 等人是制备这一类整体色谱柱的代表人物，他们将9 0 年代初研究h p l c 用的整 体色谱柱的经验1 9 5 , 9 6 l 用于c e c ，可以很快地评价出制得色谱柱的形态和组成，以及操作条 件对c e c 分离过程的影响1 4 s , 8 4 , 9 9 。1 1 钔。这种色谱柱的制备方法很简单”o 叭，石英毛细管不需 要经过硅烷化处理，只要把聚合混合物用注射器灌入毛细管中，以热源( 入热水浴) 引发 自由基聚合，形成硬的多孔聚合物整体色谱柱，典型的单体混合物含有：二甲基丙烯酸乙 烯酯：4 0 ，甲基丙烯酸丁酯：5 9 7 ，2 一丙烯酰胺一2 一甲基一1 一丙磺酸：o 3 。在 聚合混合物中还要加入致孔剂和自由基聚合引发剂，如过氧化苯甲酰、偶氮二异丁腈，这 样可以保证在室温下经过几个小时，或在冰箱中经过几天就可以完成聚合。等聚合完成后 把致孔剂冲洗出去( 使用泵或电渗流) 。这一制备整体色谱柱的方法具有以下优点：( a ) 毛 细管不需要经过硅烷化处理，当然如果经过硅烷化处理会使整体色谱柱和管壁结合的更牢 固一些。( b ) 无须经过再一次的化学反应和修饰，如引入乙烯基。( c ) 所有的试剂都不需 要经过再处理，使用市售的化学试剂即可。当然如果经过处理会进一步提高色谱柱的重复 性。 在聚合过程中所加致孔剂的种类和比例对整体色谱柱有很大的影响，在理想的情况下 这一聚合系统要满足：( a ) 进行聚合的系统是均一的，使形成的整体色谱柱可以产生电渗流。 ( b ) 进行聚合的系统能含有各种极性的单体，并可形成多孔聚合物。( c ) 进行聚合的系统能在 很宽的范围内控制整体色谱柱，并使其达到平衡。经过充分的研究开发出一类三元致孔剂 体系【1 0 2 】：( a ) 水；( b ) 1 一丙醇；( c ) l ，4 一丁二醇。使用这一致孔剂体系并用紫外光引发 聚合制备出的整体色谱柱，分离多环芳烃混合物其柱效可以达至t 2 1 00 0 0 p l a t e s m ，几乎是 利用热聚合制备出的柱子的两倍【1 0 ”。用这一色谱柱分离二肽，在流动相中含有1 一辛基磺 酸对离子，它和二肽末端的胺基作用，阻止其和整体色谱柱上的负离子基团作用，同时增 加被测定化合物的疏水性。 甲基丙烯酸酯基整体色谱柱即使是在极端p h 条件下，例如p h 为2 一1 2 下也是稳定的， 在此p h 范围内磺酸功能团所产生的电渗流可以保证在较短的时间内得到分离。这样的情 况使用硅胶填料是绝对做不到的。 刷型手性固定相由于对分子结构和形状具有较高的内在选择性，常用于h p l c 中。它 南开大学2 0 0 1 级硕士研究生学位论文 通过共价键使单分子层的手性有机分子键合到载体上制得。由于与被分析物之间的相互作 用可以用手性模型合理推断，故可以预示分离情况，并根据被分析物绝对构型预测一对对 映体的相对洗脱顺序，在c e c 中可以用更小的颗粒填充，柱效与选择性有显著提高。 p e t e r s 等l m 】用2 羟基乙基异丁烯酸( n 。l 缬氨酸3 5 - 二甲基苯胺) 氨基甲酸酯为手 性单体及甲基丙烯酸缩水甘油酯等物质制成“模塑”刚性整体毛细管刷型手性固定相实现 了对n 。( 3 5 - 二硝基苯甲酰基) 亮氨酸二烯丙基酰胺对映体的拆分。该法的特点是引入手 性单体，不需事先对毛细管进行处理；通过选择合适的聚合溶剂，精确控制聚台成分的组成 以调节渗透性，并具有独特的高效性和选择性。具体的c e c 条件为：在1 0 0 1 a m i d 毛细管 柱内用乙腈一磷酸流动相，加压o 2