（动物学专业论文）草鱼cnbp、eif5a的克隆、组织表达及进化分析.pdf

摘要摘要从草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 肝肾e d n a 文库中克隆到草鱼细胞核酸结合蛋白和真核翻译起始因5 a 。草鱼细胞核酸结合蛋白( c e l l u l a rn u c l e i ca c i d - b i n d i n gp r o t e i n , c n b p ) 全长c d n a 为1 9 4 8 b p 。其中5 端非翻译区3 3b p ，3 非翻译区1 4 2 3b p 。开放阅读框为4 9 2b p ，编码1 6 3 个氨基酸。草鱼c n b p 含有7 个保守c c h c 型锌指结构、核定位信号区和r g g 框，与其他鱼类的同源性很高。与人及其他脊椎动物的相比，草鱼c n b p 在2 5 处氨基酸位点发生替换，其中在第3 个锌指中的第5 个氨基酸残基由g l y 变成在鱼类中保守存在的h i s ，另外在第1 锌指和第2 锌指结构间，缺失6 1 4 个氨基酸残基。但这种结构的差异还不足以产生新的功能，因为适应性进化分析显示细胞核酸结合蛋白没有经历正达尔文选择佃1 ) 。r t - p c r 的实验结果表明，在正常草鱼肝、肠、肾、脾、心、肌肉、鳃和脑8 种组织中，c n b p在草鱼心脏中表达比较显著，其次是脑、鳃、肌肉，在肾中也有微弱表达。草鱼真核翻译起始因子5 a ( e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o i lf a c t o r5 a ，e l f 5 a )全长e d n a 为2 2 4 9 b p ，其中包含5 非编码区4 1 b p ，3 非编码区1 7 4 3 b p ，其编码的e 5 a 由1 5 5 个氨基酸残基组成，分子量为1 6 8 5 6 k u ，等电点p i 为5 1 8 。草鱼e l f 5 a 蛋白的n 端含有e l f 5 a 家族共有的羧腐胺赖氨酸，在蛋白c 端包含一段富含亮氨酸的结构域。草鱼e l f 5 a 与人及其他动物的e l f 5 a 具有较高的同源性，只有少数氨基酸残基发生替换。适应性进化分析也表明e i f 5 a 不但具有结构的保守性还具有功能的保守性。e l f - 5 a 在草鱼心、脑、肌肉、鳃、脾、肝脏、肠、肾等组织中恒量表达，并且其表达不因p o l yi ：c 的诱导而发生变化。关键词：草鱼；细胞核酸结合蛋e i ( c n b p ) ；真核翻译起始因子5 a ( e l f 5 a ) ；表达；进化a b s t r a c ta b s t r a c tc t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l ac e l l u l a rn u c l e i ca c i d - b i n d i n gp r o t e i n ( c n b p ) a n de u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r5 a ( e l f - 5 a ) h a db e e nc l o n e df r o mt h el i v e ra n dk i d n e yg r a s sc a r pe d n al i b r a r y 1 1 1 ef u l l - l e n g h t hg r a s sc a r pc n b pw a s19 4 8 b p ，w h i c hc o n t a i n e da5 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f3 3 b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f14 2 3 b p 1 1 1 eo p e nr e a d i n gf r a m ew a s4 9 2 b p ，w h i c hc o u l dc o d ea16 3a m i n oa c i dp o l y p e p t i d e g r a s sc a r pc n b pc o n t a i n e ds e v e nc c h cz i n cf i n g e rd o m a i n s n u c l e a r1 0 c a t e ds i g n a la n da l lr g gb o x ，w h i c hw a sh i g l l l yc o n s e r v e di nf i s h c o m p a r e dw i t hh u m a na n do t h e rv e r t e b r a t e s ，2 5a m i n oa c i dr e s i d u e sw a ss u b s i t u t e di ng r a s sc a r pc n b p , t h ef i f t hg l y c i n er e s i d u ea tt h et h i r dz i n cf i n g e rd o m a i nw a ss u b s t i t u t e dw i t hh i s t i d i n ea n d6 -14a m i n oa c i dr e s i d u e sw e r ea b s e n tb e t w e e nt h ef i r s ta n dt h es e c o n dz i n cf i n g e ri nt h eg r a s sc a r pc n b p n e v e r t h e l e s s ，t h eg r a s sc a r pc n b pw a sn o ti nt h ep o s i t i v ed a r w i ns e l e c t i o n ( ( i ) 1 ) b ya d a p t i v ee v o l u t i o na n a l y s i s t h e r e f o r e ，n e wf u n c t i o nw a sn o tg e n e r a t e db ys t r u c t u r a ld i f f e r e n c eo fc n b et h e s ei n d i c a t e dt h a tc n b pw a si nt h en e u t r a ls e l e c t i o n r t - p c re x p e r i m e n ti n d i c t e dt h a ti nt h en o r m a ll i v e r , i n t e s t i n e ，k i d n e y , s p l e e n ，h e a r t ，m u s c l e ，g i l la n db r a i no fg r a s sc a r p ，t h ec n b ph a dt h eh i 曲e s te x p r e s s i o n a ll e v e li nh e a r t ，t h eb r a i na n dg i l lr a n k e ds e c o n d l y , a n dw e a k l yi nk i d n e y t h ef b l ll e n g t he d n as e q u e n c eo fg r a s sc a r p 棚1 - 朝w a s2 2 4 9 b p ，w h i c hc o n t a i n e da5 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f4 1 b pa n da3 u n t r a n s l a t e dr e g i o no f1 7 4 3 b p t h eo p e nr e a d i n gf r a m ew a s4 6 5 b p w h i c hc o u l dc o d ea15 5a m i n oa c i dp o l y p e p t i d ew i t ham o l e c u l a rm a s so f16 8 5 6k ua n dp i5 18 g r a s sc a r pe l f - 5 ac o n t a i n st h eu n u s u a lb a s i ca m i n oa c i dh y p u s i n et h a tc o n s e r v e di ne i f 5 af a m i l ya tt h en t e r m i n a lr e g i o na n da1 e u c i n e - f i c hs t r e t c ha tt h ec t e r m i n a lr e g i o n a n di t sc o m p l e t ea m i n oa c i ds e q u e n c es h a r e dh i g h l yi d e n t i t yw i t he l f 5 af r o mh u m a na n do t h e rs p e c i e s ，o n l ys e v e r a la m i n oa c i d r e s i d u e sw e r es u b s t i t u t e d a d a p t i v ee v o l u t i o na n a l y s i sa l s oi n d i c a t e dt h a te l f 一5 aw a sn o to n l yc o n s e r v e di ns t r u c t u r eb u ta l s oi nf u n c t i o n e l f 5 ai sc o n s t a n t l ye x p r e s s e da m o n gt h eh e a r t ，b r a i n ，m u s c l e ，g i l l ，s p l e e n ，l i v e r , i n t e s t i n ea n dk i d n e yo fg r a s sc a r p ，嬲w e l la si ni n f e c t e dt i s s u e sb yp o l yi ：c k e yw o r d s ：g r a s sc a r p ，c n b p , e l f - 5 a ，e x p r e s s i o n ，e v o l u t i o nn学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，教育机构的学位或证书而使用过的材料。也不包含为获得南昌大学或其他与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名( 手写) ：豫诏、签字日期：劲孑年f 月砂日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌太掌有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名( 手写) ：p 礴媳导师签名( 手写) ：签字日期：斌年1 1 月修日签字日期：a 嘲车fv 月修e l第1 章综述第1 章综述在细胞的生长和分化过程中，基因的表达在转录、转录后和翻译水平都受到严格的调控。转录调控是基因表达调控的第一步，曾被认为是基因表达的主要调控机制。但是随着对转录后调控机制越来越多的了解，发现转录后调控在基因表达调控中同样起着重要作用。在转录后调控的过程中涉及到多种蛋白质，其中最重要的是各种核酸结合蛋白的参与。这些蛋白质需要一种或多种核酸结合结构域而发挥其重要的作用，通过核酸结合结构域特异性与核酸结合，参与d n a 的转录和r n a 的翻译，调控细胞的生长、分化与凋亡。其结构与功能的异常往往可导致疾病的发生。因此，对这类核酸结合蛋白的作用机制探索具有非常重要的生物学意义。下面对核酸结合蛋白的结构域及其与核酸的作用方式作简要概述。1 1 锌指结构近年来发现一些由较短的多肽片段( 少于5 0 个氨基酸残基长度) 不能自身折叠成稳定的结构域，但是在锌离子存在的一定条件下可以不需要任何化学反应就能与这种结构形成稳定性结合，发挥其特殊功能。人们将这种能够特异性地与核酸位点结合并调节生理功能的蛋白质片段称为锌指结构，含有锌指结构的蛋白称为锌指蛋白。锌指蛋白通过c v s 或h i s 与z n 2 + 配位，形成相对独立的结构域即锌指结构域。锌指蛋白通过锌指结构域与核酸相互作用，调节基因的转录与翻译。在锌指结构中，氨基酸序列中含有9 个重复串联的3 0 个氨基酸残基：c x 2 4 c - x 1 2 h x 3 5 h ( 其中c 代表半胱氨酸，h 代表组氨酸，x 代表任何氨基酸) 。在近2 0 年中，己发现1 0 多种不同种类的锌指结构。b e r g 等【1 】根据锌指结构序列和功能的不同将其分为9 大类( 表1 1 ) 。锌指识别d n a 主要是由于它的三维结构。基于单个锌指和h cl i n k e r ( h c连接处) 及双链d n a 的结构特征，s m i t h 等【2 】构建了锌指结合双链d n a 模型一锌指结构域很可能嵌合于双链d n a 的大沟而与d n a 相互作用。锌指的部分螺旋肽嵌于d n a 的大沟，而折叠则偏离d n a 螺旋轴，与d n a 螺旋表面接第1 章综述触。据此可以推测锌指指端的氨基酸残基特异识别d n a 大沟中的碱基对。锌指结合的d n a 片段大小各有差异。通过足印实验( f o o t p r i n t i n g ) ，m i l l e r等【3 】最初认为t f i i i a 中每个锌指结构结合d n a 双螺旋的半圈，5 个碱基对。还有很多锌指蛋白，如s p l 的每个锌指结构却仅识别3 个碱基对。s p l 含有3 个锌指结构域，能识别并结合9 1 0 个碱基对的d n a 片段【4 】。另一方面，每个锌指结构域与d n a 作用的模式也不完全相同。t f a 含有9 段锌指同源序列，其中5 、6 和6 、7 段间的连接处序列较短，分别只有4 个和5 个残基( 一般为7 或8 个残基) 【3 】。这样使得第6 个锌指正好位于其转弯处，导致d n a 轴的弯曲【5 1 。突变第9 个锌指，则由7 、8 、9 组成的多结构域单位就不能有效的结合于这些d n a 区域，而容易被d n a s ei 水解，而1 5 个结构域仍然与d n a 结合，并阻断d n a s ei的进一步水解【6 】。表1 1 根据序列与功能的不同对锌指结构的分类t a b l e l 1t h ec a t e g o r i z a t i o no fz i n co nt h eb a s i so fs e q u e n c ea n df u n c t i o n注：c 代表半胱氨酸；h 代表组氨酸；x 代表其他氨基酸n o t e ：c y s t e i n ew 鹊d e n o t e db yc h i sw a sd e n o t e db yha n dxi n d i c a t e do t h e ra m i n oa c i d s 关于锌指与r n a 结合的研究较少。主要是由于r n a 的二级和三级结构比d n a 复杂，它包含内部的环和与发夹圈相似的螺旋部分。t f i i i a 是第一个被发现的不仅能与d n a 结合，而且还能与爪蟾属的成熟卵母细胞的5 sr n a 结合的锌2第1 章综述指蛋白。由锌指4 7 完成该功能，其中锌指4 6 结合在r n a 的核心区域而锌指7 结合在i i 型螺旋一b 环区域 7 ，8 1 。与结合d n a 一样，t f m a 通过a 螺旋与r n a 结合，但只有l 、2 位氨基酸残基参与。无论锌指4 - 7 单独存在还是存在于完整的t f a分子中，均以相同的方式与5 sr n a 结合。图1 1 锌指结合于双链d n a 模型f i g 1 1t h em o d e lo f z i n cf i n g e rb m d m gt od s d n ao z n ；。配位氨基酸c y s 或h i s ；其他氨基酸；n ：n 端；c ：c 端o i n d i c a t e dz n ；o i n d i e a t e dc y so rh i s ；i n d i c a t e do t h e ra m i n oa c i d e ；n ：n - t e r m i n a lr e g i o n ；c ：c - t e r m i n a lr e g i o n 1 2 冷休克结构域几乎所有单细胞生物在环境温度急剧下降时都会产生应激反应，在此过程中大部分蛋白质的合成被终止，但有一类蛋白质的表达却急剧增加，这类蛋白质被称为冷休克蛋白( c o l ds h o c kp r o t e i n , c s p ) t 9 1 ，自从1 9 8 7 年在大肠杆菌中发现第一个冷休克蛋i 兰t ( c s p a ) t 1 0 】至今，已发现了该家族的9 种蛋白质( c s p a i ) 。c s p s都是由6 8 至1 j 7 4 个氨基酸构成的小分子蛋白质，而且它们之间具有较高的同源性( 4 4 - 8 0 ) 。c s p 存在5 条反平行b 折叠链片层结构。其特点是分为两层，层由b 1 3 组成，另一层1 扫1 3 4 5 组成，形成了一个封闭的桶状结构【1 1 1 。这种结构又称为冷休克结构域( c o l ds h o c kd o m a i n , c s d ) 。这种折叠桶结构首先是在核糖体蛋白s l 上发现的，故又称作s l 结构域。b 1 3 上拥有总共8 个芳香族氨基酸中的7 个，并且在溶液中都暴露在外表面。由此形成了2 个r n a 结合基序r n p l( k r g f 憎g a f v i x - f y ) 、r n p 2 ( l i f v i g k - n g l ) 1 2 】，其上含有3 个苯丙氨酸残基( f 1 5 、f 1 7 、f 2 7 ) ，它们都是结合单链d n a 和r n a 所必需的。3第1 章综述图12 枯草杆菌c s p b 的结构模型”1f i 9 12s t r u c t u r eo f c s p b f x o m b a c i l l u ss u b t i l i s绿色表示1 3 折叠，芳香旗( 黄色) 和碱性氨基酸( 蓝色) 介导c s p s 与单链d n a q i r n a 结台。f o r e g r o u n d s t r a n d sa r es h o w na sg r e e nr i b b o n s t i l es o l v e n te x p o s e d m o m a t i c m a d b a s i cr e s i d u e s t h a t m e d i a t c b i n d i n g t os s d n aa n d r n a m - e s h o w l l i n y e l l o w ( a r o m a t i cc h a i n s 、a r i d b l u e( b a s i cc h a i n s )普遍认为c s p s 的功能是作为r n a 分子伴侣( r n ac h a p e r o n e ) 与细胞中的m r n a 结合稳定m r n a 防止其降解，促进翻译的作用。这可能是因为c s p s可以通过c s d = p 表面暴露的苯丙氨酸残基与r n a 序列中的一个含有a t t g g 的顺式作用元件( y - b o x ) 有很强的亲和力，使得c s p s 易与m r n a 结合。若苯丙氨酸残基f 1 5 、f 1 7 、f 2 7 被a l a 代替或h i s 2 9 被g l u 代替c s p b 将丧失对单链r n a 的结合能力3 】。另一方面，也有证据显示，c s p a 和c s p b 结合至u m r n a 上会增强后者对核糖核酸酶消化的感受性，而形成稳定二级结构m r n a 对核糖核酸酶消化的感受性差，这说明c s p s 可能阻止y m r n a - - - 级结构的形成。c s p s 的这两种特性是相辅相成、缺一不可的。c s p s 也可以通过位于c s d 上的r n p s 与单链d n a 结合，调节基因的转录。c s p a 和c s p b 具有特异的结合单链d n a 或其互补区的能力，c s p a 不但可以作为转录因子对于冷诱导基因的表达发挥作用，c s p a 还可作为另外两个冷休克诱导蛋f 1 ( h - n s 和g y r a ) 的转录增强因子，因而推测冷休克蛋白作为一种d n a 结合蛋白而起作用。凝胶阻滞实验表明，c s p a 能结合到位于舭启动子区域的a t t g o 序列上从而推损d c s p a 参与其他冷休克蛋白的转录激活过程。在低温时c s p a 能在转录启始时使关闭的转录复合物转变为开放转录复台物【“】，因此它被认为是作为冷休克转录激活因子而起作用。冷休克蛋白与r n a 或单链d n a 的结合是非特异性的，不同的c s p 之间存在不同程度上的偏好。c s p f 和c s p h 所含的芳香族氨基酸残基( 3 - - 4 个) 比其他c s p s 少得多，这就表明它们所执行的功能可能不同于其他c s p s ，在含芳香族氨基酸残基少的c s p s 更容易与d n a 结合，而不是r n a l ”l 。第1 章综述通常情况下，冷休克蛋白在细胞内不稳定，很容易受到蛋白酶的攻击而降解，但有学者报道芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) d p 的3 种冷休克蛋白在体外与r n a 或单链d n a 结合后，蛋白质就会变得很稳定，不再被蛋白酶降解【1 6 】。一般而言，c s p s 绑定s s r n a 或s s d n a ，但不绑定d s d n a 1 7 1 。1 3r n a 结合域r n a 识别基序( r n ar e c o g n i t i o nm o t i f , r r m ) 又叫r n p ，同时也称为r n a 结合功能域保守序列( c s r b d ) t 1 8 】。它广泛存在于动物、植物、真菌和细菌等不同物种中，已经发现约有3 0 0 个r n a 结合蛋白。r r m 通常由8 0 - , - 9 0 个氨基酸组成，其中含有分别具8 个和6 个保守氨基酸的r n p l 和r n p 2 基序，在r n p l 和r n p 2 的两侧是一些散布的疏水性氨基酸。r r m的p q p p 0 【p 的二级结构形成4 条反向平行p 片层结构，2 + a 螺旋与p 片层结构的方向相垂直。r n p l 和r n p 2 位于d 3 和p 1 片层结构的中间位置。从r r m 的三维结构显示了r r m 保守氨基酸的2 个作用。第一，r n p l 和r n p 2 的带电和芳香族侧链在溶剂中暴露在外侧，并可能通过氢键和环的堆积力直接与r n a 结合。第二，位于r n p l 最后位置的芳香侧链指向折叠的结构域内部，和两个a 螺旋的其他高度保守的疏水氨基酸形成结构域的疏水核心【l9 1 。r n a 的结合实验表明可能与r n a 相互作用的r r m 的三个主要结构是：b 片层结构、连接片层结构的环、r r m 的氨基和羧基两端的区域。虽然缺失分析表明，r n p l 和r n p 2 的高保守氨基酸对r n a 的结合是必需的【2 0 1 ，但是可能并不能区分不同的r n a 分子。r n a 结合的特异性主要存在于r r m 基序的可变区，特别是在环和末端的位置。对u 1 7 0 k ，u 1 a 和h n r n pc 三种蛋白的突变分析发现紧接着r r m 羧基端的氨基酸对r n a 的结合特异性是高度必需【2 1 1 。因此在r r m 基序中含有许多保守的氨基酸以保证对r n a 的结合活性。r n a 结合蛋白与r n a 的结合已经被许多实验所证实。b i a m o n t i 等【2 1 】提出了一种r n a 结合的机制，r n a 结合蛋白的附属结构域非特异地将蛋白停靠在r n a 上，从而使相应的r r m 能特异地与r n a 结合。r r m 的构象在结合r n a 和未结合r n a 时是基本一致的。暴露的b 片层r n a 结合表面与r n a 衔接形成一个开放的平台，而不是将r n a 埋藏在结合的裂缝中。结合的r n a 保持相对暴露可以使它与其他r n a 序列或r n a 结合蛋白相互作用。此外，结合在r n a 上的蛋白质为r n a 分子在细胞不同位置的定位提供5第1 章综述了信号。同样，r r m 也可以识别单链d n a 。r r m 通过表面的r n p 1 和r n p 2 基序在b片层的4 5 。方向从5 到3 穿过b 1 f 3 3 d 2 与单链r n a 或d n a 结合【翻。细胞中的d s r n a 结合蛋白( d s r n a - b i n d i n g p r o t e i n ，d s r b p ) 是一类含有d s r n a结台域( d s r n a - b i n d i n g d o m a i n ，d r b d ) 的蛋白质，负责对d s r n a 产生应答。通过d r b d d s r n a 、d r b d - d s r n a - d r b d 或d r b d - d r b d 等方式相互作用从而参与细胞内的一系列反应。现有的资料表明d s r b p 与核小核糖核蛋白颗粒、异质性胞核核糖核蛋白、抗病毒粒子的形成有关，并参与r n a 加工、多聚腺苷酸化、信号识别、核定位、转录激活、发育调控等过程】。盘坠卫生岛、，1 r 一图l3 册即的结构。”及其与d s p , n a 的结合“1f i 9 1 3s t m c m m o f d r b da n d t h e b i n d i n g b e t w e e n d r b da n d d s r n ad r b d 是d s r b p 发挥功能的结构基础。不同的d s r b p 含有1 个或多个d r b d 共同发生效用。d r b d 的氨基酸序列具有种属保守性，一般由6 5 7 0 个氨基酸残基组成。结构为坤b d n ，能特异识别并结合d s r n a 州。d r b d 主要通过3 个区域( 区l 、区2 、区3 ，分别对应a 1 、b 1 b 2 、1 3 2 2 a ) 隔 d s r n a结合r 图i3 ) 1 2 5 。其中，区l 、区2 与d s r n a 的小沟结合，区3 与大沟结合。r n t l p与d s r n a 相互作用表明，d r b d 有时可能倾向于同具有特殊序列( 如5 ：端有a a o u 或n g n n l 的r n a 结合 2 6 2 7 】，而且，p k r 、d i c e r 和a d a r 的d r b d 也能识别含有膨胀环结构、突环结构等非a 型d s r n a 序列。因此，d r b d 与r n a 的结合不能片面的说是结构依赖性或是序列依赖性，而是结构相关或是序列相关的结合。除了与d s r n a 特异结合外，d r b d 还能结合d n a 。有研究表明，r n a 解旋酶( r n ah e l i c a s ea r h a ) 作为核酸解旋酶家族的一员兼顾d n a 和r n a 的解旋功能。r h a 可以结合抑癌基因p 1 6 r s k 4 a 的启动子参加其转录调节口“。h u n g 等 2 9 1研究发现r h a 有2 个d r b d ，其中，d r b d i 与d s r n a 的亲和力比d r b d 2 的低，但它与自身c 端富含脯氮酸的序列相互协作，形成一个核酸结合的整体模式，能结第1 章综述合d n a 。突变研究发现与d n a 和r n a 结合的结构域虽然不同但有所重叠。r h a的d r b d 如何既与a 型的d s r n a 又与b 型的d n a 结合，其机制尚不清楚。1 4 亮氨酸拉链结构域碱性亮氨酸拉链蛋e t ( b a s i cl e u c i n ez i p p e rp r o t e i n ，b z l p ) 是真核生物的转录因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的类型之一【3 0 1 ，广泛分布于从植物到动物等不同的真核生物中。b z l p 蛋白的重要结构域是亮氨酸拉链结构域( l e u c i n ez i p p e rd o m a i n ，l z d ) 。典型的特征是每7 个氨基酸的第7 位含有一个亮氨酸，以及其他疏水残基位于第3和第4 位。亮氨酸拉链形成一个两亲性的u 螺旋，该结构为b z i p 蛋白与d n a 结合之前的二聚体化作用所需【3 1 1 。l z d 与紧靠它n 末端的大约2 0 个氨基酸的碱性结构域相互协作，能专一作用于d n a 序列。天然的亮氨酸拉链b z i p 蛋白质在与d n a 结合后，其结构由随机螺旋变为a 2螺旋，同时，b z i p 部位形成双链结构【3 2 1 。这些蛋白质可以识雯j l j 2 类d n a 元件：a p 1 t r e 和a t f c r e 序列模体。a p 1 t r e 元件有保守的t g a c t c a ，它是一个拟二元对称。与这个位点结合的蛋白质包括f o s 和j u n 家族，它们可以被促进有丝分裂的、诱导分化的和神经原专一的刺激所诱导。a t f c r e 元件含有t g a c g t c a 保守序列，它是一个二元对称。与这个位点结合的蛋白质的基因的表达与、钙和病毒所诱导的反应有关1 。目前，研究天然和人工合成的亮氨酸c 拉a 链m p 蛋白的结构、功能、结合、33,34dnar n a 的机理及其动力学成为蛋白质领域的一个热门方向【”】。1 5 螺旋环螺旋从m u r r e 等【3 6 1 9 8 9 年发现了碱性螺旋环螺旋( b a s i c h e l i x 1 0 0 p h e l i x ，b h l h )结构以来，研究者们已经在真核生物中发现了许多b h l h 转录因子超家族成员。b h l h 是一个转录因子特有的结构域。这个结构域的基序包含了约6 0 个氨基酸，由一个碱性氨基酸区( b a s i cr e g i o n ) 和一个螺旋- 环- 螺旋( h l hr e g i o n ) 区组成。碱性区约含1 5 个氨基酸，其中含有较多的碱性氨基酸，这个区域的活性主要与转录因子与d n a 特定序列的结合有关。螺旋环螺旋区的主要作用是与其他蛋白结合形成二聚体，协同行使功能。7第1 章综述己知的动物b h l h 蛋白可以根据其结合d n a 的活性划分成6 类【37 1 。1 ) a 类蛋白能结合序列为5 - c a g c t g 3 ( e 盒序列) 的d n a 序列，包括的蛋白有t w i s t 、h e n 、a t o n a l 、d e l i l a h 、d h a n d 、a c s 、m y o d 、e 1 2 和d a 。2 ) b 类成员如m y c 、m a x 、u s f 、s r e b p 、m i t f 等可以结合g 盒序列，即5 - c a c g t g 3 。3 ) c 类成员除了b h l h 结构域之外，还含有另一个蛋白相互作用的结构域卅a s 结构域，这类b h l h 蛋白可以结合非e 盒序列a c g t g 3 或5 _ n g c g t g 3 。4 ) d类由不含碱性氨基酸区的h l h 蛋白构成。由于不含有碱性氨基酸区，因此这类蛋白不能结合d n a ，但其可以通过竞争性结合其他的b h l h 蛋白，起到调节下游基因转录的作用。5 ) e 类b h l h 蛋白包含了g r i d l o c k e ( s p l ) 、h e y 和h a i r y 。这类蛋白在碱性区有脯氨酸和甘氨酸，并且可以结合5 - c a c g n g 3 。6 ) f 类成员由含有e b h l h 结构的蛋白组成，这个结构与d n a 结合和二聚体都相关。1 6r g g 框和k h 结构域r g g 框( r c , gb o x l 一般存在于蛋白质的c 端，是一段重复出现的“精氨酸甘氨酸甘氨酸”顺序。r g g 框介导蛋白质蛋白质相互作用，从而影响r n a 与蛋白质结合的活性。m e a t s 等【3 8 】研究发现单纯疱疹病毒i c p 2 7 蛋白中的r g g 框能与p o l y ( g ) r n a 结合，介导该蛋白的r n a 结合活性。n o r t h e r nb o l t 也发现，单独的r g g 转接到异种蛋白上同样可以介导与r n a 的结合。k h 结构域首先是在h n r n p k 蛋白中被发现，是一段由含有一定疏水性残基的约6 0 个氨基酸组成的序列，序列中央有一段高度保守的v i g x x g x x i 序列。目前发现的r n a 结合蛋白最多能含有1 5 个拷贝的k i - i 结构域。1 7 本研究的目的及意义核酸结合类蛋白在基因的转录、转录后调节及翻译水平调控中起非常重要的作用，通过和核酸相互作用来调节细胞的功能。核酸结合类蛋白参与d n a 的转录、r n a 剪接、转运、维持r n a 的稳定和降解和细胞内定位等核酸代谢的各个方面。核酸结合类蛋白还参与细胞的代谢，影响细胞的分化，衰老与凋亡等。因此，核酸结合类蛋白具有重要的生理及分子功能。目前为止，仅有很少的核酸结合蛋白得到了较为详细的研究，还有大多数核酸结合蛋白，它们与靶标核酸结合后的相互作用及功能都有待深入研究。8第1 章综述本文克隆了草鱼细胞核酸结合蛋白及真核翻译起始因子5 a 基因，并对其分子特征进行了分析。用r t p c r 对目的基因在草鱼组织中的表达特征进行探索，并进一步了解病毒与真核翻译起始因子5 a 表达的关系。分析细胞核酸结合蛋白及真核翻译起始因子5 a 的适应性进化，有助于进一步了解它们的作用机理和分子演化趋势，而对特定氨基酸位点的保守性分析以及正选择位点的寻找，会有助于对其结构与功能进行深入的研究。9第2 章草鱼c n b p 和e l f - s a 的克隆、分子特征及组织表达第2 章草鱼c n b p 和e l f - 5 a 的克隆、分子特征及组织表达本文从草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 肝肾c d n a 文库中首次筛选到草鱼细胞核酸结合蛋白和真核翻译起始因子5 a 的全长c d n a 。分析其分子特征、同源性比对、系统进化等信息，并利用半定量r t - p c r 分析方法初步探索了这2 个基因的在草鱼各组织中的表达情况。细胞核酸结合蛋i 圭 ( c e l l u l a rn u c l e i ca c i d b i n d i n gp r o t e i n , c n b p ) 是一种广泛分布于细胞中的一种d n a 结合蛋白。迄今，已有人( h o m os a p i e n s ) 和多种动物的c n b p 基因被克斛3 9 训】。c n b p 是1 个1 9l ( u 的小分子蛋白质，含有7 个c c h c型( c y s x 2 c y s x 4 h i s x 4 c y s ) 的锌指结构，与逆转录核酸结合蛋白非常相似【4 5 1 。在不同物种中，c n b p 享有较高的同源性，这种极高的保守性意味着它可能具有非常重要的功斛4 6 1 。近年来，鱼类c n b p 相继报道。斑马鱼( d a n i or e r i o ) 和银鲫( c a r a s s i u sa u r a t u sg i b e l i o ) c n b p 都是由1 6 3 个氨基酸残基组成的小分子蛋白质，其确切功能仍在探索中。真核翻译起始因子( e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r , e l f 5 a ) 是一类参与真核细胞蛋白质翻译的物质，目前已发现有2 0 余种成员，分属于e l f 1 、e l f 2 、e l f 3 、e l f - 4 、e l f 5 、e l f 6 等多个家族。真核翻译起始因子各自包含多个亚基并以复合物的形式发挥作用7 1 。e l f 5 是g t p 酶激活蛋白，在翻译起始时激活e l f 2的g t p 酶活性，使e l f 2 g t p 水解为g d p 结合的e l f 2 。e l f 5 有e l f 5 a 、e l f 5 b 亚基。其中，e l f 5 a 能调节蛋白质的翻译，参与m r n a 的降解 4 8 , 4 9 ，并与细胞周期g 1 s转化、细胞增殖、分化和凋亡密切相关【5 0 5 2 】。e l f 5 a 是迄今唯一1 个含羟腐胺赖氨酸( h y p u s i n e ) 残基的蛋白质。p a r k 5 1 】研究发现哺乳动物中羧腐胺赖氨酸的合成速率( 或者说合成时间) 与细胞的分裂进程紧密相关，由此推测它在细胞分裂增殖过程中有重要作用。反之，用亚精胺和脱氧羧腐胺赖氨酸合酶( d h s ) 抑制剂或一些金属螯合物抑制脱氧羧腐胺赖氨酸羧化酶的功能，可以使哺乳动物细胞停止分化，细胞周期停留在g 1 s 转化时期【5 3 巧5 1 。迄今，虽然已鉴定了人及多种动物的e l f - s a 及其同工型( i s o f o r m ) 基因，但对鱼类e l f - 5 a 及其功能的了解甚少，仅有斑马鱼e l f - 5 a ( n p9 9 8 3 5 0 ) 的报道。1 0第2 章草鱼c n b p 和e l f - 5 a 的克隆、分子特征及组织表达2 1 材料与方法2 1 1 材料2 1 1 1 主要仪器设备高速冷冻离心机、小型台式离心机、定量移液器( 5 “，l m l ，2 0 0 p 1 ，l o o 肛1 ，l o t l ，一2 5 1 x 1 ) ：e p p e n d o r f 公司恒温水浴锅：上海跃进医疗仪器厂恒温恒压水平电泳仪：北京六一仪器厂恒温生化培养箱：s a n y o 公司超净工作台：苏州净化设备公司电子天平：梅特勒托利多公司涡旋振荡器、高温烘箱：智城分析仪器制造公司p c r 扩增仪：p e r k i ne l m e r 公司g e ld o cx r 凝胶成像系统：b i o r a d 公司2 1 1 2 主要试剂、试剂盒琼脂糖、引物、o l i g o ( d t ) 1 8p r i m e r ：上海生工公司( s a n g o n )d n am a r k e r 、溴酚蓝：b b i 公司t a qd n ap o l y m e r a s e ：t a k a r a 公司d e p c ：p r o m e g a 公司p o l yi ：c - p h a r m a c i ab i o t e c h 公司s vt o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m ：p r o m e g a 公司其它试剂均为国产分析纯2 1 1 3 实验材料草鱼肝肾e d n a 文库( 载体为p b l u e s c r i p ti is k ，宿主菌为d h 5 a ) i 妇_ i ：海联合基因公司构建。实验鱼取自江西省水产科学研究所的健康草鱼，体重约5 - l o g 。于流水实验槽中暂养一周。取正常草鱼组织和经p o l yi ：c 诱导后的草鱼组织( 肝、肾、脾、腮、脑、肠、肌、心) 用于提取总r n a 。其中诱导组为背鳍下肌肉注射p o l yi ：c ，每条鱼约注射5 0 i - t lp o l yi ：c ( 1 m g m l ) ，诱导3 天后提取该组鱼的总r n a 。使用s vt o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m ( p r o m e g a ) 提取草鱼各组织的总r n a 。m m l v 反转录酶( t a k a r a ) 反转录得到c d n a 。1 1第2 章草鱼c n b p 和e l f - s a 的克隆、分子特征及组织表达2 1 2 方法2 1 2 1 草鱼c n b p 、e i f - 5 a 基因的克隆通过对草鱼肝肾e d n a 文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析共获得5 1 0 个草鱼肝肾表达序列标签( e s t ) 。利用n c b i 的b l a s t x 程序，发现编号为y g 0 0 2d 0 6 和y g 0 0 3h 1 0 克隆经比对初步确定分别为草鱼c n b p 和以p 鲥。将其连接液转化大肠杆菌( d h 5 a ) 并采用p b l u e s c r i p t i i s k 载体上的通用引物：t 3 ( 5 一a ：兀a a c c c t c a c t a a a g g k i a a 3 ) 和t 7 ( 5 - t a a t a c g a c t c a c t a = r a - 3 )进行菌液p c r 鉴定，获得均为大于2 0 0 0 b p 的阳性克隆。经上海生工测序，确定分别为草鱼c n b p 和e l f - 5 a 的全长e d n a 序列。反应体系为2 5 a 1 ：水1 8 7 5 m ，1 0 x p c r 反应缓冲液2 。5 m ，