（微生物学专业论文）黄孢原毛平革菌tdna插入突变体系构建研究.pdf

河南农业人学硕士学位论文 黄他原毛平革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 捅要 秸秆高效利用中的一个重要瓶颈技术是预处理技术。秸秆的微生物处理目前被认为是 最有前途的处理方法。鉴于秸秆的生物预处理技术还未成熟，仍存在着处理效率低，周期长 等弱点，本研究旨在采用t - d n a 随机插入突变的方法，试图对白腐真菌的模式菌种黄 孢原毛平革菌进行基因改造，进而获得改良的性状，最终服务于秸秆的高效生物预处理。 利用基因t 程原理，成功构建了双元载体，这种载体以p c a m b i a a 3 0 0 为骨架，把原 有的t - d n a 序列替换为完整的潮霉素b 抗性基因，包括来自黄孢原毛平革菌的潮霉素抗性 基因启动子，来自火肠杆菌的潮霉素抗性基因h y g 以及来自黄孢原毛平革菌的l i p 6 终止子， 如将此t - d n a 转入黄孢原毛平革菌基因组，理论上可以赋予黄孢原毛平革菌自身较高的潮 霉素抗性。此抗性可作为t - d n a 插入突变试验的筛选标记。 通过不同方案将双元载体质粒向农杆菌转化，发现转化效率显著不同。使用液氮速冻的 方法转化经c a c l 2 处理的感受态农杆菌，未出现转化子，改变液氮处理时间、质粒d n a 的 用量及受体菌种类等因素，均未获得转化子，表明速冻的方法向农杆菌引入质粒比较困难； 借助于诱动质粒p r k 2 0 1 3 ，使用三亲结合的方法顺利将双元载体导入农杆菌，并且转化效 率较高。至此，用于侵染黄孢原毛平革菌双元载体系统构建完成。 对含上述双元载体系统的农杆菌侵染黄孢原毛平革菌进行了初步研究，通过调：肖真菌起 始材料，共培养比例，诱导剂a s 的使用浓度等因素，均未获得转化子。 本试验过程中，因多次出现假阳性结果，双元载体系统的构建及鉴定耗去大量时间，致 使后续的侵染试验时间不足，最佳侵染条件未能及时摸清，没能获得转化子。 关键词：生物预处理；a m t ；黄孢原毛平革菌；双元载体； 河南农业大学硕士学位论文黄孢原毛平革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 c o n s t r u c t i o no ft - d n ai n s e r t i o nm u t a g e n e s i ss y s t e m f o rp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o ls o n ga n d o n g m a s t e rc a n d i d a t e ：x u er e n j a n a b s t a c t ：a si sk n o w nt oa l l ，t h ek e yt e c h n o l o g yd u r i n gh i g he f f i c i e n tu t i l i z a t i o no f s t r a wi sp r e t r e a t m e n t ，w h i l et h em o s tp r o s p e c t i v ep r e t r e a t i n gm e t h o di sm i c r o b i a l p r e t r e a t m e n t n o w a d a y s ，t h e r ea r es e v e r a lw e a kp o i n t sw h i c hs e r i o u s l yh i n d e r e dt h e d e v e l o p m e n to fm i c r o b i a lp r e t r e a t m e n t ，s u c ha sl o we f f i c i e n c y , l o n gc y c l et i m ea n d s m a l ls c a l et r e a t m e n t o u ra i mi st ot oa c h i e v em o l e c u l a rm o d i f i c a t i o nt o w a r d sm o d e l o fw h i t e r o tf u n g ip h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mt h r o u g ht - d n ar a n d o mi n s e r t i o n m u t a g e n e s i s ，a n do b t a i ni m p r o v e ds r a i n sw h i c hc o u l db eu s e di nh i g he f f i c i e n c y p r e t r e a t m e n to fs t r a w o nt h eb a s i so fg e n e t i ce n g i n e e r i n gp r i n c i p l e ，w es u c c e e d e di nc o n s t r u c t i n ga b i n a r yv e c t o r t h i sv e c t o rc o n t a i n st h eh p hg e n eo fe s c h e r i c h i ac o l ia st h es e l e c t i v e t r a i t ，g o v e r n e db yah e t e r o l o g o u sf u n g a lp r o m o t e rf r o mp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m g e n o m ea n dt h ep h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u ml i p 6 t e r m i n a t o r f o rac o m p l e t e h e t e r o l o g o u sh y g r o m y c i nb r e s i s t a n c eg e n ew a s i n t e g r a t e d ，i tc a nb eu s e di nas y s t e m t oi n f e c tp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m t h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f o r m a t i o ni na g r o b a c t e r i u mv a r i e sf r o md i f f e r e n tp r o t o c o l s t h em e t h o dt h r o u g hl i q u i dn i t r o g e nr e f r i g e r a t i o nr e s u l t e di nf e wt r a n s f o r m a n t a t t e m p t st h r o u g hv a r i o u sc o n d i t i o n ss u c ha sd i f f e r e n tl i q u i dn i t r o g e nt r e a t i n gt i m e ， d i f f e r e n ta m o u n to fp l a s m i da n dd i f f e r e n tc h o i c eo fr e c e p t o rb a c t e r i u ma l s og e n e r a t e d n ot r r a n s f o r m a n t ，w h i c hs h o w e dt h a ti tw a sr a t h e rh a r dt oo b t a i n a g r o b a c t e r i u m t h r o u g hl i q u i dn i t r o g e nr e f r i g e r a t i o np r o t o c o l s t h eb i n a r yv e c t o rp c 6 1 3 0 0w a se a s i l y t r a n s f o r m e di n t oa g r o b a c t e r i u ml b a 4 4 0 4t h r o u g ht r i p a r e n t a l m a t i n gp r o t o c o la n d l a r g ea m o u n tt r n a s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d t i l lt h e n ，ac o m p l e t eb i n a r yv e c t o rs y s t e m w a s f i n a l l yc o n s t r u c t e d w et r i e dt ot r a n s f o r mm o d e lo fw h i t e r o tf u n g ip h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m w i t ht h ei n f e c t i o ns y s t e mw h i c hw e p r e v i o u s l yc o n s t r u c t e d u n f o r t u n a t l y , a st h ef u n g a l s t a r tm a t e r i a ln e i t h e rt h ec o n i d a t en o r p r o t o p l a s tr e s u l ti na n yt r a n s f o r m a n t f o rl o t so ff a l s ep o s i t i v et r a n s f o r m a n t sp u to f fp r o c e s so fc o n s t r u c t i o no fb i n a r y v e c t o r , w ed i d n th a v ee n o u g ht i m et ot r ym a n yo t h e rf a c t o r sw h i c hi m p a c t i n gt h e e f f i c i e n c yo ft r a n s f o r m a t i o n k e yw o r d s ：m i c r o b i a lp r e t r e a t m e n t ；a m t , p h a n e r o c h a e mc h r y s o s p o r i u m ；b i n a r y v e c t o r 4 1 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论黄孢原毛平革菌t - d n a 插入突变 学位硕士 文题目体系构建研究级别 学生 薛仁军 学科导师 姓名专业 微生物学宋安东 姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 研究生签名：南二r 辱导师签名：秒夕 日期：司年爿f 。日日期：谚年多月oe l 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：磷人夕晕导师签名：铲彬 学院领导签名： 日期：1 ) 、年b 月i 口日日期：纠年勿月佃日 日期：年月日 致谢 本文是在宋安东副教授悉心指导下完成的，从论文的选题到研究方法和论文 写作，宋老师都进行了全程关键性的指导，并在论文质量和进度上提出了严格的 要求导师们渊博的理论思想，严谨的治学态度，卓越的管理能力、无私的敬业 精神以及和蔼可亲的待人方式将使我受益终生在此向宋老师表示最崇高的敬意 和最衷心的感谢! 在试验及论文完成过程中，王风琴副教授、邱立友教授、刘卫群教授、谢慧 老师以及微生物学系的其他各位老师都向我提供了大量无私的关心和帮助，使我 的试验能够顺利进行，在此向各位老师表示深深的谢意，祝愿老师们身体健康， 万事如意! 在试验过程中，得到了师兄任天宝、裴广庆、张小强、陈伟，师弟张雷鸣、 万续良、任省涛、耿涛、原欢，师妹张玲玲、张沙沙、田原、周丽娟、侯淑芬， 本科生熊晓东、常路路，以及楚乐然、刘玉博、刘杰、王磊、祖向阳、刘元金、 杨秀君、胡颖、冯雅岚等同班同学的大力帮助和鼓励，在此表示深深的谢意! 愿 各位在今后的工作学习中事事顺心，前程似锦! ! 在试验过程中，还得到了动物遗传工程实验室宋根娣、王婷婷、赵炎葱、柴 保国，华欣欣，园林植物生物技术实验室王政、阎新房、吴静、王海云等同学的 关心和帮助，感激不尽，在此一并致以衷心的感谢和最美好的祝福! 值得一提的是，我必须感谢i n t e r a c t 和b b s ，它使我认识了许多良师益友，从 网友f e s i t a 、如水月光、x i a o l i u s c i 、t c w i n b b s 、x i n g x i n g 那里，我学到了很多书本 上学不到的知识，这些令我受益匪浅。谢谢各位! 本试验的顺利完成也离不开院领导、研究生处诸位领导的关心和支持，在此 一并表示感谢! 最后再次向所有关心、帮助和支持我的老师、同学和朋友致以最诚挚的谢意! 衷心感谢我的家人，在我学习中给予的无私奉献、鼓励和支持，与我风雨同舟、 同甘共苦，在此我也向他们表示深深的谢意! i l 薛仁军 2 0 0 9 年4 月 河南农业大学硕士学位论文黄孢原毛平革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 1 文献综述 1 1 能源概述 长久以来，化石燃料一直是作为能源支柱支撑着世界经济的发展。然而，众所周知。化 石燃料噪、石油和天然气是地球在漫长的地址演变过程中形成和保留下来的，是不可再 生的资源，这些燃料的开采与使用对自然环境造成了不同程度的污染和破坏。 目前，地球上原油的可探明储量没有增加，而产量已接近了极限，人类正面临着能源与 石油危机的严竣挑战n 1 。化石能源的可开发利用总量逐年下降，而可再生能源的大规模开发 二度成为能源开发的主流，如图1 - 1 馏1 。2 0 0 3 年6 月召开的“国际可再生能源会议”提出了全 球应该加速实现从矿物能源时代向可再生能源时代过渡的发展战略。为了保证能源的持续供 给，世界各国都在积极探索利用可再生能源。太阳能、氢能和生物质能为代表的可再生能源， 逐渐成为世界各国的研究热点。 生物质能是指以生物质为载体的能量。所有生物质即生物界一切有生命的可以生长的有 机物质，包括动植物和微生物，都有一定的能量，都可能转化为能源。发展生物质能源是当 代世界科学研究领域的重要前沿性课题之一。 薹 g 善 8 砉 墨 ，l l ：，o 19 0 0 9 5 02 0 0 02 毒；i e o y e a r 圈1 - 1燃料的变更趋势 f i 9 1 1 a l t e r a t i o no ff u e l s 1 2 秸秆预处理技术 秸秆的主要成分是木质纤维素。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成， 并且形成了天然复杂致密的结构特性，有效降低了纤维素酶系与纤维素的直接接触，增加了 酶解的难度，如图卜2 。因此需要对木质纤维素进行必要的预处理，以改变天然纤维素的结 构，使结晶纤维素成为无定型纤维素，亦即进一步破坏部分1 3 - 1 ，4 糖苷键，从而降低结晶 度和聚合度，从而提高酶解效率，然后利用生物酶对纤维素进行糖化。 由此可见，秸秆高效利用中的一个瓶颈技术是预处理技术。预处理是通过物理、化学或 生物的方法打开生物质的木质素外壳，降解木质素半纤维素并使纤维素的晶体结构变成适宜 于纤维素酶作用的疏松结构。预处理技术也是生物燃料加工过程中成本最高的步骤之一。 2 河南农业大学硕士学位论文黄孢原毛平革菌t o d n a 插入突变体系构建研究 术质素1 气纤维索 乡1 ：维索 结构岱一 图1 - 2 木质纤维素结构示意图 f i 9 1 2 t h es c h e m a t i cd i a g r a mo fl i g n o c e l l u l o s es t r u c t u r e 一般来讲，好的预处理应满足以下四方面的条件：促进糖的生成或有利于后面水解 的进行，避免碳水化合物的降解损失，避免生成对水解和发酵有抑制作用的物质生成， 经济成本比较低。表1 1 对四种常规的木质纤维素预处理方法及处理特点做了大致的比较 【3 】。 表1 - 1常见的四类生物质预处理方法比较 t a b l e l - 3t h ef o u rc o n l n l o nm e t h o d so fp r e t r e a t m e n to nb i o m a 螨 3 河南农业大学硕士学位论文黄孢原毛平革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 1 3 生物预处理 秸秆的微生物处理目前被认为是最有前途的处理方法，自然界中有许多菌类可以腐蚀和 分解秸秆、树叶及树木等高纤维物质，这些菌种包括一些霉菌( 曲霉属、木霉属、青霉属等) 、 食用菌类及白腐真菌等。早在1 8 0 5 年，m f f s c h e 蹴已观察到微生物分解木质纤维的现象【4 】。 自1 9 7 9 年l a t h a n 用生物学方法处理秸秆后，国内外许多学者就致力于这一方面的研究。欧美 等发达国家在利用微生物分解秸秆综合利用方面己投入了较大的资金和力量进行开发和研 究。 目前的研究表明，只有少数真菌具有分解木质素的能力。主要分为三类【5 】：白腐真菌、 褐腐菌和软腐菌。白腐真菌降解木质素的能力较强，而后两者降解木质素能力较弱。白腐真 菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，因此被认为是主要的降解木质素的微生物。白腐真菌降 解植物细胞壁时存在非选择性降解和选择性降解两种明显不同的方式【6 1 。在此基础上， z a d r a z i l 根据白腐真菌优先降解细胞壁成分的不同将其分为三类【7 1 ：第一类，优先降解纤维 素和半纤维素，后降解木质素；第二类，优先降解木质素：第三类，同时降解纤维素，半纤 维素和木质素。在秸秆的预处理中，第二类白腐真菌最具有应用价值。 1 3 1 微生物降解秸秆的机理 在常见的天然木质纤维素中，纤维素、半纤维素以及木质素三部分交织成坚固致密复杂 的组织结构，大大降低了纤维素酶的糖化效率。要有效的利用其中可发酵糖，就必须对其进 行降解。 微生物在代谢过程中产生降解酶系，目前已知该酶系主要有胞外过氧化物酶( 木质素过 氧化酶和锰过氧化酶) 、一种含铜酚氧化酶( 漆酶) 以及能产生过氧化氢的葡萄糖氧化酶。漆酶 作为一种多酚氧化酶，可催化氧化酚类化合物，同时分子氧被还原成水。这一过程中，漆酶从氧 化底物分子中获得一个电子，使之形成自由基，该自由基不稳定，可进一步发生聚合或解聚 反应。在分子氧存在条件下，葡萄糖氧化酶可氧化相应底物产生过氧化氢。而在过氧化氢存 在情况下，锰过氧化酶、木质素过氧化酶和漆酶这三种酶协同作用于连结木质素结构单元之 间的醚键和酯键，首先使木质素分解成为单个的结构单元，在此基础上，进一步催化苯丙烯 醇之间的c a c b 键断成两分子苯丙烯醇，最后苯丙烯醇断链降解为小分子化合物，完成术 质素的降解【8 】。 1 3 2 秸秆降解前后的变化 1 3 2 1 成分变化 杨玉楠等【9 】使用黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ，以下简称黄孢菌) 对稻 草进行预处理，使秸秆的结构受到破坏，木质素含量降低，从而大大缩短了厌氧发酵周期， 提高了甲烷转化效率。室温下用白腐菌预处理2 0 d ，厌氧发酵1 5 d ，甲烷转化率为4 7 6 3 ， 继续发酵至3 0 d ，甲烷转化率高达5 8 7 4 ：3 9 的温度下预处理l o d 、发酵5 d 就可以达到 5 3 3 的甲烷转化率。采用秸秆预处理液作为连续序批式预处理的菌源时，甲烷产量显著下 降，预处理液一次转接甲烷转化率为2 2 6 。二次转接仅为1 2 ，检测分析显示白腐菌难以 4 河南农业大学硕j 二学位论文 黄孢原毛平革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 在后续的批处理中保持优势。这里用到的秸秆预处理方法是g p y 培养基上接种白腐菌，2 8 培养一周后，使用直径为l c m 的打孔器打出3 块，接种到1 0 0m l 马铃薯培养基中，2 8 ，1 6 0 r m i n 培养2 4h 成为菌悬液。取菌悬液1 0m l 分别加到9 0m l 马铃薯培养基中，2 8 ，1 6 0 r m i n 培养3 d 后与粉碎成2 c m 长的稻草秸秆6 0 9 一起加人到反应器中加水定容至5 l ，调p h 值为 4 5 ，在恒温反应器中分别于室温和3 9 下进行曝气处理。 1 3 2 2 降解选择性 杭怡琼等【1 0 1 发现白腐真菌侧耳z 1 7 ，9 2 1 ，1 0 2 4 菌株能明显地降解稻草秸秆的木质纤维 素，z 1 7 对木质素降解达4 0 5 3 ，1 0 2 4 菌株降解纤维素达到1 7 5 3 ，并且明显提高细胞外 蛋白含量。将稻草秸秆5 k g ，棉籽壳1 k g ，石灰0 x k g ，水1 0 k g ，混匀后，分装于塑料菌 袋中。每袋装湿料3 0 0 9 ，封e l ，于1 2 1 c 灭菌3 0 m i n 。冷却后分别接入各菌株培养物5 0 9 ， 2 尿素1 0 m l 拌匀于2 5 下培养。在整个培养期间，3 个菌株培养基质中胞外蛋白含量均 呈增加的趋势。其中，形成子实体的z 1 7 菌株高于不形成子实体的菌株，其胞外蛋白含量 增加最多达2 3 1 7 m g g 干物质，这一结果说明形成子实体的菌株具有比不形成子实体的菌株 更活跃的氮代谢水平。接种前基质中木质素和纤维素含量分别为1 6 6 3 、3 0 3 5 ，经过4 9 d 的培养，这两种成分都明显地减少了。在整个培养过程中，各菌株对木质素的降解率高于对 纤维素的降解率。 张晓昱【1 1 】发现白腐菌对秸秆木质纤维素的降解具有一定的先后顺序和选择性，先降解 半纤维素和木质素，再同时降解半纤维素、纤维素和木质素：从降解比例来看，白腐菌对半 纤维素和木质素具有很好的降解优势和降解选择性。先将三大素大分子进行氧化、裂解，再 将所得的短链或单体( 如小分子木素单体、愈创木基单体等) 等氧化成小分子酸类、酯类等， 整个过程是个氧化还原、非专一的降解过程。 1 3 3 影响微生物降解秸秆的因素及研究进展 1 3 3 1 菌种 预处理要选择合适的菌种，由于白腐真菌对降解木质纤维素具有两种不同的方式，应该 选择能够优先降解木质素的菌种。 a r o r a 等【1 2 1 对毛云芝( c o r i o l u sh i r s u t u s ) ，d a e d a l e al t a v i d a ，血朱栓菌( e o l y s r i c t u s s a n g u i n e u s ) ，炭球菌( d a l d i n i ac o n c e n t r i c a ) 和p o s t i a p l a c e n t a 的降解性能进行了比较研究， 结果表明，炭球菌和p o s t i ap l a c e n t a 能显著降解稻草和松木，血朱栓菌最适合生产漆酶。 戴永鑫等【1 3 l 研究了白腐菌及其产生的木质素降解酶系对秸秆的木质素生物降解方法， 探讨了黄孢菌和杂色云芝单一菌株生物降解及双菌株联合降解木质纤维素的规律，白腐菌双 菌联合固态培养可使木质素降解率达到4 7 6 4 ，脱木素选择性为4 7 4 。采用模拟大规模白 腐菌堆积培养( 厚度3 0c m ) 的方法降解桔秆木质素，培养3 0d ，木素降解率为3 2 5 4 ，表明 此方法是一种可行的大规模生物预处理方法。将黄孢菌的分生孢子制成菌悬液，按1 0 6 个m l 的接种量接种到固体培养基，3 4 c 静置培养。将杂色云芝按每瓶固体培养基3 个菌塞的接种 量接种，3 0 静置培养。联合培养时将上述条件合并，3 0 静置培养。 5 河南农业大学硕十学位论文黄孢原毛平革菌t o d n a 插入突变体系构建研究 谢响明等1 1 4 】采用黄孢菌处理麦草，同时改变生物预处理条件：麦草含水率、生物接种量、 营养源、预处理时间。通过测定纤维素、戊糖和木素降解率，探讨生物预处理的最佳条件。 实验结果表明，较佳的生物预处理条件为：麦草含水率8 0 ，生物预处理时间1 0 d 左右。 氮源加入量0 1 2 5 ，生物接种量对菌株的生长影响不大。 1 3 3 2 底物 不同的底物，降解效果也有明显差异。a n d e r ”i 从2 5 种白腐菌中筛选得到了选择性降 解木质素而保留纤维素的菌株。将2 5 种不同的白腐菌分别接种到松木片和牛皮纸木质素琼 脂平板，以纤维素的添加与否做对照试验。根据平板上呈现的酚氧化反应的差异，将2 5 种 真菌分为两组。分到s p o r o t r i c h u mp u l v e r u l e n t u m 、显丝菌p h a n e r o c h a e t es p 和p o l y p o r u s d i c h r o u s 的一组，能产大量的b 1 ，4 内切葡聚糖酶和纤维素酶，在振荡和添加纤维素的条 件下，也可以产生醌氧化还原酶，在静置条件一f 接种于盛有木粉的三角瓶，能产生少量的酚 氧化酶。由胶质干朽菌( m e r u l i u st r e m e l l o s u s ) ，射脉菌( 砌彪6 纪r a d i a t a ) ，朱红秘孔菌 ( p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s ) 和糙皮侧耳( p l e u r o t u so s t r e a t u s ) 组成的另一组，产酶情况与 第一组恰好相反。研究还表明，添加麦芽浸提物可以达到较高的木质素降解率。在上述条件 下，朱红秘孔菌失重3 4 ，纤维素没有损失而木质素降解率达到1 2 5 。 1 3 3 3 温度 大多数白腐真菌生长的最适温度为2 0 - , 3 5 。c t l 6 j 。l a n g 等将白腐菌侧耳( p l e u r o t u ss p ) 和污叉丝孔菌( d i c h o m i t u ss q u a l e n s ) 接种于稻草，分别在2 0 c ，2 5 ，3 0 和3 4 条件下 培养。8 周后测定胞外酶系包括漆酶和锰依赖过氧化物酶的活性。结果表明，侧耳在低温下 能产生较高的酶活力，漆酶的最高产量出现子2 5 3 0 。c ，而锰依赖过氧化物酶的最高产量 出现在2 0 。 1 3 3 4 固液比 在固体发酵中，含水量过高或过低都会影响白腐真菌的生长，合适的固液比根据基质的 不同而不同，通常情况下最适的固液相之比为1 ：3 6 【1 7 1 1 3 3 5 酸碱度 大多数白腐真菌适宜生长在微酸性环境内，p h 值在4 6 。 1 3 3 6 碳氮比 碳源、氮源的选择与限制培养，白腐真菌降解木质素是在次生代谢条件下完成的，因此 碳源和氮源是微生物降解木质素和产酶的一个极为重要的影响冈素，其中氮源限制不利于产 酶，而碳源限制则有利于酶的合成。z a f a r 等的研究【1 8 1 表明杂色云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 在不加氮源的条件下能显著降解稻草。将杂色云芝接种到稻草于2 5 分别培养 7 d ，1 4 d ，2 1 d ，2 8 d 和3 5 d 。经过3 5 d 的培养，木质素降解率可达4 2 ，同时纤维素的降解率仅 达到1 0 2 。n i k u p a a v o l a 的研列1 9 l 表明，射脉菌( j 协彪6 缸r a d i a t af r 7 9 ) 在限氮条件下能 产生大量的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。 1 3 3 7 培养时间 真菌培养周期一般较长。a k i n l 6 l 使用自腐菌虫拟蜡菌( c e r i p o r i o p s i ss u b v e r m i s p o r a ) 和 6 河南农业人学硕士学位论文黄孢原毛平革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 粪生黑蛋巢菌c y a t h u ss t e r c o r e u s 对狗牙根进行处理，发现6 周后降解率分别达到2 9 3 2 和6 3 - 7 7 。 1 4 丝状真菌的改造 1 4 1 丝状真菌的常规方案诱变 常规的诱变方法主要是理化诱变或混和诱变。物理因子主要有紫外线，y 射线，离子束， 微波，高压等；化学因子主要有亚硝基胍，硫酸二乙酯，亚硝酸钠，羟胺，氯化锂等。混合 诱变分空间诱变、组合因子诱变等。 1 4 。1 1 针对纤维素酶的诱变 董志扬等【刎以康宁木霉t 2 0 5 为出发菌种，通过_ r 射线照射和亚硝基胍交替处理，诱变出 一株纤维素酶高产菌株t 8 0 1 ，与出发菌株相比，其产酶能力提高1 1 7 7 倍。通过对诱变菌株 产纤维素酶条件研究发现，以稻草粉为碳源、蛋白胨为氮源时，菌株产酶最高。该菌株产酶最 适培养温度为2 8 - - 3 0 ，最适培养p h 为4 1 8 - 5 1 0 ，在此条件下发酵五天达到产酶高 峰。该诱变株产酶能力高于国内外一些已知的纤维素酶高产菌株如q m 9 4 1 4 等，具有重大 的实用价值。 张渊等【2 1 髓过对白灵侧耳进行原生质体制备和紫外线诱变处理，筛选出1 株本质素酶、 纤维素酶高产菌株b 2 0 3 ，与出发菌株相比，羧甲基纤维素酶活力在营养生长期和子实体形成 期分别是出发菌株的2 2 倍和2 4 7 倍，滤纸酶活力分别是出发菌株的1 7 5 倍和1 6 8 倍。漆 酶、愈创木酚氧化酶和邻苯二酚氧化酶活力在营养生长期分别是出发菌株的1 5 4 倍、1 2 1 倍和1 2 5 倍：在现蕾期分别是出发菌株的1 4 9 倍、1 8 1 倍和1 1 5 倍，对木质素、纤维素的降 解率分别比出发菌株提高了6 8 7 和5 6 5 。 石家骥等1 2 2 】采用离子束注入技术对中性纤维素酶产生菌特异腐质霉( h u mi c o l a i n s o l e n s ) h 3 1 - 3 进行诱变。经发酵筛选获得较高酶活力且传代稳定的正突变菌株h 1 4 ，制备 其原生质体后进行紫外诱变。筛选后得到正突变菌株h 1 4 - 2 ，最终c m c 酶、滤纸酶活力分 别达8 2 5 6 1 u m l 和5 7 7 i u m l ，较原始菌株提高了7 8 5 7 和1 0 6 8 1 。 李西波等【2 3 l 用青霉( 心以缸f 胧“ms p ) h k 2 0 0 3 为出发菌，经亚硝基胍( n t g ) 、羟胺复合诱 变。根据变异菌株菌落形态变化与产酶高低的关系，结合酶活力检测理化指标，筛选出一株 高产稳定的纤维素酶菌株l x 2 4 3 5 ，其产酶能力由2 0 0 u m l 提高到4 1 5 u m l ，较出发菌株 提高2 1 0 8 倍。对该菌种进行了连续8 次继代培养，结果表明其遗传性状稳定。 林英等【2 4 1 以绿色木霉f 2 6 4 为出发菌株制备其原生质体，对其进行紫外线诱变处理，筛 选出一株纤维素酶高产突变株绿色木霉f - u v 2 6 4 ，其滤纸酶活由出发菌株的5 2 i u g 干料提 高到1 5 7 8 i u g 干料，产酶能力提高了3 倍。经过1 0 代p d a 斜面继代培养及发酵试验，表 明该菌株是比原菌株更优秀的稳定高产株。 张辉掣2 5 1 以嗜热侧孢霉( 乃p 删嘶f 妇s p o r o t r i c h u m ) f f ；j 出发菌株进行紫外诱变，选育出 t h 3 2 9 突变株。该菌株的c m c a s e 和f p a a s e 分别提高到原始菌株的2 6 和2 0 倍。液体培 养产酶条件及正交试验研究结果表明，最适碳源为稻草粉+ 甘蔗渣( 总含量为2 0 时，稻草 7 河南农业大学硕士学位论文 黄孢原毛平革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 粉：甘蔗渣为1 ：4 ) ，最适氮源是蛋白胨( 0 4 ) ，k h 2 p 0 4 最适含量为0 3 ，m g s 0 4 7 h 2 0 最 适含量为0 0 3 ，最适p h 值为5 5 ，最适培养温度为4 5 ，培养第2 天f p a a s e 最高，培 养第4 天c m c a s e 最高。采用优化配方，在4 5 下培养，测得c m c a s e 为8 6 8 r o g ，f p a a s e 为2 2 6 1 u g 。 林建国等【2 6 】阐述了紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍三种诱变方法对发菌株绿色木霉t v 9 6 进行诱变以提高其产酶的能力。确定了紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍的最佳诱变时间分别为： 1 2 0 s 、3 5 r a i n 和2 5 m i n ；得到了3 1 株菌株的h c 值比出发菌株大，通过复筛，发现3 1 株菌 株中，有2 2 株的产酶能力比出发菌株有提高，且突变菌株n t g 8 的产酶能力最高值为 4 3 7 9 9 g m l m i n ，是出发菌株的2 0 3 倍， 并具有较好的遗传稳定性。 刘春芬【2 7 1 以绿色木霉1 3 0 1 0 为出发菌株，利用诱变因子的协同作用，对其进行了诱变 育种，得到酶活力较高的突变菌株绿色木霉g l l 3 0 1 0 。实验结果表明g 紫外线、亚硝酸钠 诱变因子对绿色木霉1 3 0 1 0 菌体细胞的致死作用表现出相似的趋势，在一定范围内都与诱变 剂量呈线性正相关。在协同诱变条件下，多轮反复诱变绿色木霉1 3 0 1 0 后，菌株的酶活力有 大幅提高，最终筛选得到了产纤维素酶活力单位提高了7 0 6 3 的菌株g l l 3 0 1 0 。 武秀琴等【2 8 】利用黑曲霉为出发菌株，经过紫外线和亚硝酸复合诱变，选育出酶活力高 的突变株进行培养并测定其酶活。在单因子诱变中，紫外线效果明显优于亚硝酸，致死率 7 0 8 0 的诱变剂量比较理想。复合诱变比单因子诱变效果好，产酶能力得到提高，而且 菌落生长速度也加快，在多次传代试验中，菌株的性状也比较稳定。出发菌株通过紫外线 ( 1 5 w ，照射距离3 0 c m 左右，照射时间8 r a i n ) 和亚硝酸( 0 1 m o l l 的n a n 0 3 处理5 m i n ) 的复合 诱变，复筛得到纤维素酶高产菌株，纤维素酶活力提高了6 1 1 0 ，滤纸酶活力提高了6 4 0 1 。 1 4 1 2 针对a 一淀粉酶的诱变 刘仲敏等f 2 9 1 以米曲霉2 1 9 7 为出发菌株，采用紫外线、硫酸二乙酯、6 0 c o y 射线、硝酸、 微波及离子束交替进行的复合诱变育种技术，通过平板初筛、固体麸皮初筛、固体麸皮复筛， 获得一株真菌a 淀粉酶高产菌株z l f l 3 ，并对其进行了生活力试验和遗传稳定性试验。结果 表明，突变株z l f l 3 生长代谢旺盛，营养要求低，遗传稳定性好，产酶水平较出发菌株提 高6 4 倍，达9 4 6 u g 。 1 4 1 3 针对木聚糖酶的诱变 佟晓华等幽】对二株产木聚糖酶的菌株进行了木聚糖酶活性测定，同时对其中的黑曲霉 进行了诱变处理，以提高其产酶活性，经u v 及亚硝酸的交替处理，获得一产酶活性为突发 株3 1 1 5 倍的突变菌株。 汪世华等【3 l 】采用分离株黑曲霉c 3 4 为出发菌株，经丫射线和硫酸二乙酯诱变处理，定 向选育出一株生产菌c 3 4 8 6 。同时对c 3 4 8 6 固态发酵产木聚糖酶的条件进行了研究，确立 了所试因素的最佳组合：麸皮与玉米芯的比例为7 ：3 ，氮源为1 5 硫酸铵，培养基起始p h 值为自然p t t ，2 5 0 m l 三角瓶中装培养基1 5 9 ，培养时间为7 2 h ，温度为4 0 。在最适条件下 木聚糖酶的平均产量为2 3 8 7 0 u g 。放大试验表明产酶平均可达8 2 6 0 u g 。 8 河南农业大学硕士学位论文 黄孢原毛半革菌t - d n a 插入突变体系构建研究 1 4 1 4 针对漆酶的诱变 莫佳琳等【3 2 】从贝壳状革耳菌( p a n u sc o n c h a t u s ，是一株具有选择性降解木素的白腐菌) 菌株出发，通过原生质体融合和紫外诱变技术处理，获得产漆酶酶活较高的诱变融合菌株， 诱变株2 8 2 7 的漆酶酶活高峰达1 7 2 9 0 i u l ，比原始菌的酶活高峰2 3 1 8 1 u l 提高约7 5 倍。 诱变菌株分泌的漆酶预处理荻苇浆、麦草浆和芦苇浆，l q p 浆和o l q p 浆的白度较未经处 理的高，卡伯值下降，黏度变化不大。经过漆酶价体生物处理可提高纸浆的可漂性，对后 续漂白有促进作用。实验结果初步证明，原生质体融合和紫外诱变技术可以作为改良贝壳状 革耳的手段。 王岁楼等【3 3 】对漆酶产生菌灵芝和鸡腿菇进行超高压处理，发现致死率随剂量的增加而 增加，在致死率为5 0 8 0 的范围内诱变效果较好。实验获得了2 株具有较大应用潜力 的灵芝高压突变株g 1 5 0 2 和鸡腿菇高压突变株c 2 0 0 3 ，其中g 1 5 0 2 酶活比出发菌株提高了 2 8 3 倍，发酵时间缩短了l d ；c 2 0 0 3 酶活比原菌株提高了2 5 7 倍，发酵时间也缩短了1 d 。 黄乾明等【3 4 1 以粗毛栓菌( t r a m e t e sg a l l i c a ) 为出发菌，通过紫外诱变处理其担孢子、 p d a r b b r 平板变色法初筛、a b t s 法测定培养液漆酶酶活力复筛，获得1 株漆酶高产诱 变菌株s a h 1 2 。用高氮低碳无机盐培养液( l m 3 ) 培养时，其峰值酶活力比出发菌株高出 4 倍，达到5 0 0 2 6 肌，且产酶稳定。对s a h 1 2 液体培养产酶条件的研究表明：以纤维二 糖和蔗糖为碳源明显优于麦麸、淀粉和葡萄糖，其最高酶活分别达1 8 5 2 6 u l 和1 3 4 3 6 u l ； 有机氮源较无机氮源更有利于s a h 1 2 漆酶的分泌，以蛋白胨、大豆粕和胰化蛋白胨为氮源 时其峰值酶活分别达到2 0 5 4 4 u l 、1 9 6 7 1 u l 和1 6 1 8 0 u l ；适宜初始培养p h 为4 0 ；a b t s 、 单宁酸、没食子酸对产酶均有明显的诱导作用，其中a b t s 和单宁酸的诱导效果相对更好， 愈创木酚和吐温8 0 对产酶有一定的抑制作用。 1 4 1 5 针对混合酶系的诱变 陈晓柯等f 3 5 】对担子菌p q 3 9 菌丝原生质体进行了紫外光l i c i 复合处理后，得到突变 株u 3 9 ，再将其分别用加c o 、h n 0 2 两种方法处理，各获得突变株u c 0 3 9 和u n 3 9 ，它们的 c m c 酶活由原来l m p q 3 9 的0 3 1 u 分别提高到0 4 6 u 和0 5 7 6 u 。酯酶同功酶电泳表明， u c 0 3 9 ，u n 3 9 和母株l m p q 3 9 的酶谱出现了6 条共同的谱带，同时也出现差异。突变株和 母株的桔杭试脸旱阳性。 苟兴华【3 6 】在原生质体形成及再生的最佳条件下制备勾巢曲霉u v g g 原生质体，然后对 原生质体进行紫外线诱变处理。经再生培养原生质体和发酵筛选再生菌株，获得了高产稳定 株p 4 7 3 。其糖化酶活力由出发菌株的8 7 0 0 u m l 提高到1 4 5 0 0 u ，m l 。 孙冬梅等f 3 7 】以黄绿木霉为出发菌株，孢子经紫外线照射，亚硝酸及氯化锂复合处理后获 得一株酶活增强的突变株。通过对峙培养与发酵液处理病原菌研究了该诱变株对大豆根腐病 几种镰刀菌的拮抗作用。诱变株经传代3 0 代后，其产酶活性仍保持增强，生防能力有所提 高。拮杭试验结果明确了黄氯木霉诱变株对镶刀菌的拮抗机理以生存竞争和接触后对病原菌 菌丝破坏的溶菌作用为主，且诱变株产孢速度快，分生艳子梗空间竞争优势强于原始菌株。 9 河南农业人学硕士学位论文 黄孢原毛平革菌t o d n a 插入突变体系构建研究 酶活测定结果表明，诱变株的滤纸酶活提高8 5 7 ，c m c n a 酶活提高2 6 7 ，b 一葡萄糖苷 酶活提高1 3 0 3 。 喻风香p 8 1 对根霉r a 1 菌株进行n a n 0 2 诱变和紫外线诱变，得到一株低聚糖酶活力较 高的菌株，酶活力达到4 3 6 0o w g 干曲) 。比出发菌株提高4 0 3 7 ，液化酶比出发菌株提高到 4 8 6 2 。达到1 9 5 3 ( u g 干曲) ，糖化酶提高到出发菌株的5 6 7 8 ，达到2 5 5 1 0 5 g 干曲) ， 将该菌株进行斜面传代，产酶稳定。 康东亮p 9 1 利用紫外线照射和光复活交替处理液体曲生产菌株，得到一株性